4.2　課后習(xí)題詳解

1如果一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為12000的蛋白質(zhì)，含10種氨基酸，并假設(shè)每種氨基酸在該蛋白質(zhì)分子中的數(shù)目相等，問(wèn)這種蛋白質(zhì)有多少種可能的排列順序？

答：已知蛋白質(zhì)中氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量為120，則該蛋白質(zhì)中氨基酸數(shù)目為12000/120＝100，所以該蛋白質(zhì)可能的排列順序有10100種。

2有一個(gè)A肽，經(jīng)酸解分析得知為L(zhǎng)ys、His、Asp、Glu₂、Ala以及Val、Tyr和兩個(gè)NH₃分子組成。當(dāng)A肽與FDNB試劑反應(yīng)后，得DNP-Asp；當(dāng)用羧肽酶處理后得游離纈氨酸。如果我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將A肽用胰蛋白酶降解時(shí)，得到兩種肽，其中一種（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4時(shí)，凈電荷為零，另一種（His、Glu以及Val）可給出DNP-His，在pH6.4時(shí)，帶正電荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解時(shí)，也得到兩種肽，其中一種（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4時(shí)呈中性，另一種（Lys、His、Glu₂以及Val）在pH6.4時(shí)，帶正電荷。問(wèn)A肽的氨基酸序列如何？

答：（1）該A肽的氨基酸序列為：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val

（2）具體分析過(guò)程如下：

①FDNB法測(cè)定N-末端氨基酸，A肽與FDNB試劑反應(yīng)后得DNP-Asp，表明N-末端為Asp-。

②羧肽酶法測(cè)定C-末端殘基，處理后得游離纈氨酸，表明C-末端為-Val。

③胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸殘基的羧基形成的肽鍵，得到的是以Arg和Lys為C-末端殘基的肽段。用胰蛋白酶降解得到兩種多肽，其中一段含Lys，表明該A肽結(jié)構(gòu)為Asp-（　　）-（　　）-（　　）-Lys-（　　）-（　　）-Val。

④由（His、Glu以及Val）可給出DNP-His，又pH6.4時(shí)帶正電荷即Glu應(yīng)為Gln，酸水解使Gln→Glu，此片段序列為His-Gln-Val。

⑤糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵。用糜蛋白酶降解A肽得到兩種肽（Asp、Ala、Tyr）和（Lys、His、Glu₂以及Val），結(jié)合③和④可得其結(jié)構(gòu)為Asp-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val。

⑥又（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4時(shí)呈中性，則Asp應(yīng)為Asn，酸水解使Asn→Asp＋NH₄＋，所以此A肽的氨基酸序列為Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val。

⑦利用（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4時(shí)凈電荷為零及（Lys、His、Glu₂以及Val）在pH6.4時(shí)帶正電荷能驗(yàn)證推斷正確。

3某多肽的氨基酸序列如下：

（1）如用胰蛋白酶處理，此多肽將產(chǎn)生幾個(gè)肽？并解釋原因（假設(shè)沒(méi)有二硫鍵存在）。

（2）在pH7.5時(shí)，此多肽的凈電荷是多少單位？說(shuō)明理由（假設(shè)pK_a值：α-COOH4.0；α-NH₃＋6.0；Glu和Asp側(cè)鏈基4.0；Lys和Arg側(cè)鏈基11.0；His側(cè)鏈基7.5；Cys側(cè)鏈基9.0；Tyr側(cè)鏈基11.0）。

（3）如何判斷此多肽是否含有二硫鍵？假如有二硫鍵存在，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定5，17和23位上的Cys哪兩個(gè)參與形成？

答：（1）①4個(gè)肽。

②原因：胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸殘基的羧基形成的肽鍵，得到以Arg和Lys為C-末端殘基的肽段。所以上述多肽可以得到Glu-Val-Lys、Asn-Cys-Phe-Arg、Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg和His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu-Glu-Lys這4個(gè)肽段。

（2）①在pH7.5時(shí)，此多肽的凈電荷是－2.5單位。

②理由：pH7.5時(shí)4個(gè)Glu和2個(gè)Asp共帶6個(gè)負(fù)電荷，2個(gè)Lys和2個(gè)Arg帶4個(gè)正電荷，1個(gè)His可以被看作帶半個(gè)正電荷，其他氨基酸均不帶電荷，1個(gè)α-COOH帶1個(gè)負(fù)電荷，所以凈電荷為－2.5單位。

（3）如果用胰蛋白酶處理此多肽產(chǎn)生4個(gè)肽段，則其不含二硫鍵；若用胰蛋白酶處理此多肽產(chǎn)生3個(gè)多肽，則其含有二硫鍵。假如有二硫鍵存在，則經(jīng)胰蛋白酶處理后得到的3個(gè)肽段所帶電荷不同，因此可用離子交換層析、電泳等方法將肽段分開(kāi)，鑒定出含二硫鍵的肽段，測(cè)定其氨基酸順序，便可確定二硫鍵的位置。

4今有一個(gè)七肽，經(jīng)分析它的氨基酸組成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時(shí)，與FDNB反應(yīng)不產(chǎn)生α-DNP-氨基酸。經(jīng)糜蛋白酶作用后，此肽斷裂成兩個(gè)肽段，其氨基酸組成分別為Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。這兩個(gè)肽段分別與FDNB反應(yīng)，可分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應(yīng)能生成兩個(gè)肽段，它們的氨基酸組成分別是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。試問(wèn)此七肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)是怎樣的？

答：（1）此肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時(shí)，與FDNB反應(yīng)不產(chǎn)生DNP-氨基酸，說(shuō)明此肽不含游離N-末端氨基酸，即此肽為環(huán)肽。

（2）糜蛋白酶可斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵。由該肽經(jīng)糜蛋白酶作用后產(chǎn)生兩個(gè)肽段（Ala、Tyr、Ser）和（Pro、Phe、Lys、Arg）可知結(jié)構(gòu)：-（　　）-（　　）-Tyr-和-（　　）-（　　）-（　　）-Phe-。

（3）由（2）得到的兩肽段與FDNB反應(yīng)，分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys，可知該兩肽段的N末端分別為Ser和Lys，結(jié)合（2）可知結(jié)構(gòu)：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-（　　）-（　　）-Phe-。

（4）胰蛋白酶只斷裂Arg或Lys殘基的羧基參與形成的肽鍵。由該肽與胰蛋白酶反應(yīng)能生成兩個(gè)肽段（Arg、Pro）和（Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可知結(jié)構(gòu)：-Pro-Arg-和-（　　）-（　　）-（　　）-（　　）-Lys-。

綜上所述可知此七肽為一環(huán)肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)是-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-。

5三肽Lys-Lys-Lys的pI值必定大于它的任何一個(gè)個(gè)別基團(tuán)的pK_a值，這種說(shuō)法是否正確？為什么？

答：正確。當(dāng)該三肽處于等電點(diǎn)時(shí)，其解離集團(tuán)所處的狀態(tài)是：C-末端是COO-（pK_a＝3.0），N末端NH₂（pK_a≈8.0），3個(gè)側(cè)鏈為3（1/3ε-NH₃＋）（pK_a＝10.53），因此pI值＞最大的pKa值（10.53）。

6一個(gè)多肽可還原為兩個(gè)肽段，它們的序列如下：鏈1為Ala-Cys-Phe-Pro-Lys -Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val-Cys；鏈2為Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。當(dāng)用嗜熱菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫鍵）時(shí)可得下列各肽：（1）（Ala、Cys₂、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）（Arg₂、Cys₂、Trp、Tyr）；（4）（Cys₂、Phe）。試指出在該天然多肽中二硫鍵的位置。

答：已知嗜熱菌蛋白酶斷裂Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr及Val等疏水性強(qiáng)的氨基酸殘基的N端，根據(jù)題中已知條件可進(jìn)行以下分析：

（1）消化原多肽得到（Ala、Cys₂、Val），說(shuō)明鏈1在2位Cys后及11位Val前斷裂，2位Cys與12位Cys之間有二硫鍵。

（2）由鏈1序列及肽段（2）組成可得肽段（2）的序列為：-Phe-Pro-Lys-Arg-。

（3）由肽段（1）（2）組成可知肽段（3）（Arg₂、Cys₂、Trp、Tyr）中必有Cys來(lái)自鏈2，另一Cys為鏈1中8位Cys，因此可知鏈1中8位Cys與鏈2中一個(gè)Cys之間有二硫鍵。

（4）嗜熱菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸殘基的N端，故肽（Cys₂、Phe）來(lái)自鏈2，結(jié)合肽段（3）含Tyr，可知形成的二硫鍵為鏈1中8位Cys與鏈2中3位Cys之間，肽段（4）中（Cys₂、Phe）說(shuō)明鏈2中1位Cys與5位Cys之間有二硫鍵。

綜上可得該多肽中二硫鍵位置如圖4-2所示，

圖4-2

7一個(gè)十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列產(chǎn)物：

并觀察下列事實(shí)：（1）用羧肽酶A和B處理該十肽無(wú)效；（2）胰蛋白酶處理產(chǎn)生兩個(gè)四肽和游離的Lys；（3）梭菌蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)四肽和一個(gè)六肽；（4）溴化氫處理產(chǎn)生一個(gè)八肽和一個(gè)二肽，用單字母符號(hào)表示其序列為NP；（5）胰凝乳蛋白酶處理產(chǎn)生兩個(gè)三肽和一個(gè)四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH時(shí)攜帶-1凈電荷，在pH12時(shí)攜帶-3凈電荷；（6）一輪Edman降解給出下面的PTH衍生物：

圖4-3

寫(xiě)出該十肽的氨基酸序列。

答：（1）該十肽的氨基酸序列為：Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro。

（2）具體分析過(guò)程如下：

①羧肽酶A和B同時(shí)作用能釋放除Pro以外的任何C-末端殘基。用羧肽酶A和B處理十肽無(wú)效，說(shuō)明該十肽C-末端殘基為-Pro。

②梭菌蛋白酶只斷裂Arg殘基的羧基端肽鍵。由梭菌蛋白酶處理該十肽后得一個(gè)四肽和一個(gè)六肽，則可知該十肽第4位或第6位為Arg。

③溴化氰只斷裂由Met殘基的羧基形成的肽鍵。由其處理該十肽后得一個(gè)八肽和一個(gè)二肽，說(shuō)明該十肽第8位或第2位為Met；又用單字母表示二肽為NP，即-Asn-Pro-，故該十肽第8位為Met。

④Edman化學(xué)降解法分析N-末端基，根據(jù)其降解所得衍生物的結(jié)構(gòu)，可得N—末端氨基酸殘基結(jié)構(gòu)式為：—NH-CH（-CH₂OH）-C（＝O）—，還原為—NH-CH（-CH₂OH）-COOH—，可知此氨基酸殘基為Ser；因此該十肽的結(jié)構(gòu)應(yīng)該為Ser-（　　）-（　　）-（　　）-（　　）-（　　）-（　　）-Met-Asn-Pro。

⑤胰蛋白酶專一斷裂Lys或Arg殘基的羧基形成的肽鍵，該十肽經(jīng)胰蛋白酶處理產(chǎn)生兩個(gè)四肽和游離的Lys，因此②中的Arg只有位于第4位，才能形成兩個(gè)四肽和游離的Lys，第5位、第6位只能為L(zhǎng)ys，即十肽為Ser-（　　）-（　　）-Arg-Lys-Lys-（　　）-Met-Asn-Pro。

⑥胰凝乳蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽后，產(chǎn)生兩個(gè)三肽和一個(gè)四肽，結(jié)合該多肽的氨基酸殘基組成，可得該十肽第3位或第7位為Tyr或Phe，第2位為Glu或Gln。

⑦由N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH時(shí)攜帶-1凈電荷，在pH12時(shí)攜帶-3凈電荷，可知第2位應(yīng)為Glu，第3位為Tyr，所以此十肽的第7位為Phe。

綜上所述可知該十肽的氨基酸序列為Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro。

8一個(gè)四肽，經(jīng)胰蛋白酶水解得兩個(gè)片段，一個(gè)片段在280nm附近有強(qiáng)的光吸收，并且Pauly反應(yīng)和坂口反應(yīng)（檢測(cè)胍基的）呈陽(yáng)性。另一片段用溴化氰處理釋放出一個(gè)與茚三酮反應(yīng)呈黃色的氨基酸。寫(xiě)出此四肽的氨基酸序列。

答：（1）此四肽的氨基酸序列為：Try-Arg-Met-Pro。

（2）具體分析過(guò)程如下：

①胰蛋白酶專一斷裂Lys和Arg殘基的羧基形成的肽鍵。該肽經(jīng)胰蛋白酶處理后得兩個(gè)肽段，故該四肽中含Lys或Arg。

②由肽段在280nm附近有強(qiáng)的光吸收且Pauly反應(yīng)和坂口反應(yīng)呈陽(yáng)性，可知該肽段含Tyr和Arg。

③溴化氰專一斷裂Met殘基的羧基形成的肽鍵。另一肽段用溴化氰處理后得到與茚三酮反應(yīng)呈黃色的氨基酸，故肽段序列為-Met-Pro-。

綜上可得該四肽的氨基酸序列為Try-Arg-Met-Pro。

9蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一個(gè)十八肽，其序列為CNCKAPETALCARRCQQH，已知蜂毒明肽形成二硫鍵，不與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)。

（1）問(wèn)此肽中存在多少個(gè)二硫鍵？

（2）請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)確定這些（個(gè)）二硫鍵位置的策略。

答：（1）鹵化烷試劑碘乙酸能與巰基發(fā)生反應(yīng)，該多肽不與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)說(shuō)明此肽中不含游離的—SH，且其序列組成有4個(gè)—Cys殘基，所以應(yīng)存在兩個(gè)二硫鍵。

（2）二硫鍵的位置可能有3種情況：

①1位Cys與3位Cys之間和11位Cys與15位Cys之間；

②1位Cys與11位Cys之間和3位Cys與15位Cys之間；

③1位Cys與15位Cys之間和3位Cys與11位Cys之間。

第①種情況，用胰蛋白酶斷裂將得到兩個(gè)肽段和游離的Arg；第②種和第③種，用胰蛋白酶處理將得到一個(gè)肽段和Arg；通過(guò)二硫鍵部分氧化可以把后兩種情況區(qū)別開(kāi)來(lái)。

10敘述用Merrifield固相化學(xué)方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一個(gè)亮氨酸殘基使成三肽，可能會(huì)掉進(jìn)什么樣的“陷坑”？

答：（1）Merrifield固相化學(xué)方法合成二肽Lys-Ala：

①將Ala先和氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂反應(yīng)，共價(jià)的掛接在樹(shù)脂上；

②除去Ala的N-末端保護(hù)基，使Lys（其氨基預(yù)先用叔丁氧甲酰基保護(hù)）以DCC為縮合劑，接到Ala的氨基上；

③將樹(shù)脂懸浮在無(wú)水三氟乙酸中，通入干燥的HBr，使肽與樹(shù)脂脫離，同時(shí)切除一些保護(hù)基，即完成合成。

（2）Merrifield的方法可以使肽鏈按控制順序從C端向N端延長(zhǎng)，由于Lys的側(cè)鏈含有一個(gè)—NH₃＋，所以新加入的Leu可能被接在Lys的側(cè)鏈殘基上。