任務2.4　苷類的結構研究

苷類多為固體化合物，其結構研究一般按照下面步驟進行。

第一步：物理常數的測定，如測定熔點、比旋度等。

第二步：分子式的測定。

經典的方法是進行元素的定性和定量分析，并測定分子量，確定分子的組成和分子式。近年來廣泛應用質譜分析的方法測定分子量和分子式。苷類化合物一般極性較大，無揮發性，遇熱汽化時易于分解，采用電子轟擊質譜（FD-MS）、快原子轟擊質譜（FAB-MS）等方法來獲得分子離子峰，尤其是FD-MS及FAB-MS兩種質譜法更是目前測定苷類分子量的常用方法，其中高分辨快原子轟擊質譜法（HR-FAB-MS）還能夠直接測定苷類化合物的分子量。

2.4.1　組成苷的苷元和糖的鑒定

將苷用稀酸或酶進行水解，使之生成苷元和各種單糖，然后再對這些水解產物進行鑒定。

將苷用稀酸進行水解，使生成苷元和各種單糖，分得苷元，測定質量，計算苷元在苷中所占的百分數，或進行糖的定量分析，計算糖在苷中所占的百分數。利用PC或TLC鑒定水解液中單糖的種類，并可進一步采用光密度掃描計測定各單糖斑點的含量，算出各單糖的分子比，以推測苷元與哪些單糖相連以及單糖的個數。

糖的極性強，因此在硅膠薄層上進行色譜分離時，一般點樣量不能大于5μg，而用硼酸溶液或一些無機鹽的水溶液代替水調制吸附劑進行鋪板，就能顯著提高點樣量，并改善分離效果。用這種鹽的水溶液制備硅膠薄層時，所用的鹽一般是強堿弱酸（或中強酸）鹽，如0.3mol/L的磷酸氫二鈉水溶液。用這種鹽溶液制備的硅膠板分離糖時，其上樣量可達400～500μg。

糖的PC或TLC所用的顯色劑有些是相同的，其顯色原理主要是利用其還原性或形成糖醛后引起的呈色反應。有些顯色劑不僅可以決定糖的斑點的位置，尚可區分其類型。常用的顯色劑有苯胺鄰苯二甲酸試劑、三苯四氮鹽試劑（TTC試劑）、間萘二酚-鹽酸試劑、雙甲酮-磷酸試劑等。這些顯色劑對不同的糖往往顯示不同顏色（見表2.1）。

有些顯色劑中含有硫酸，因此只能用于TLC，例如茴香醛-硫酸試劑、間萘二酚-硫酸試劑、α-萘酚-硫酸試劑、百里酚-硫酸試劑、酚-硫酸試劑等。噴后一般要在100℃左右加熱數分鐘至斑點顯出。

纖維素薄層色譜與紙色譜相似，也屬分配色譜，可用于糖的分離和鑒定。紙色譜所用的展開劑和顯色劑均能用于纖維素薄層色譜，但后者展開所需時間比前者顯著縮短。

2.4.2　確定苷鍵的構型

2.4.2.1　利用酶水解進行測定

如麥芽糖酶只能水解α-苷鍵，而苦杏仁酶能水解β-苷鍵。但應注意并非所有的β-苷鍵都能被杏仁苷酶所水解。

2.4.2.2　利用Klyne經驗公式進行計算

Klyne根據前人的經驗，得出一個經驗公式，可用以計算。即將未知苷鍵構型的苷及其水解所得的苷元，先測定其旋光度，再通過計算得到其分子比旋[M]D，然后再用苷的分子比旋減去苷元的分子比旋，求得其差值為Δ[M]D。公式如下：

將此差值與形成該苷的單糖的一對甲苷分子比旋相比較，如果α-甲苷的數值相近，可認為其苷鍵為α-苷鍵，反之則可認為其苷鍵為β-苷鍵。常見甲苷的分子比旋數值見表2.2。

【例】　黃甘草皂苷[glyeurysaponin]的苷鍵構型的計算。

黃甘草皂苷是存在于黃甘草（Glycyrrhiza eurycarpa P.C.Li）中的一種三萜酸葡萄糖醛酸苷。其苷鍵構型利用Klyne經驗公式，就可確定。

計算方法如下：

黃甘草皂苷

查表2.2，可知：

β-D-葡萄糖醛酸甲苷+β-D-葡萄糖醛酸甲苷[M]D=-411.8°

β-D-葡萄糖醛酸甲苷+α-D-葡萄糖醛酸甲苷[M]D=-110.2°

α-D-葡萄糖醛酸甲苷+α-D-葡萄糖醛酸甲苷[M]D=+191.4°

由于計算值-477.7°與-411.8°較接近，因此可確定其苷鍵為β型。

2.4.2.3　根據核磁共振譜中糖的端基質子的耦合常數或端基碳原子的化學

位移（或其耦合常數）進行判斷

（1）1H-NMR

利用1H-NMR譜中糖的端基質子的耦合常數判斷苷鍵的構型是目前最常用的方法。一般是采用全甲基化物進行測定。當糖與苷元相連接時，糖上端基質子與其他質子相比較，常位于較低磁場。

凡是H—2'為a鍵的糖，如木糖、葡萄糖、半乳糖等，當與苷元形成β-苷鍵時，其H—1'為a鍵，故H—1'與H—2'為aa鍵耦合系統，Jaa=6～9Hz并呈現為1個二重峰。當形成α-苷鍵時，其H—1'為e鍵，故H—1'與H—2'為ae鍵耦合系統，Jae=2～3.5Hz，故從J值可以確定苷鍵的構型。現以葡萄糖苷為例，從其透視式及部分紐曼投影式可以更清楚地看出以上的現象。

從紐曼投影式可以看出，在α-D-葡萄糖苷中，其C1上的e鍵氫（He）與C2上的a鍵氫（Ha）之間的夾角Φ為60°，J值為2～3Hz，而在β-D-葡萄糖苷中，其C1上的a鍵氫（Ha）與C2上的a鍵氫（Ha）之間的夾角Φ為180°，J值為6～9Hz。

C2上H為e鍵的某些糖，如鼠李糖等，由于它所形成的苷鍵的α構型與β構型的J值相近，因此也就無法利用其J值來確定其構型。例如鼠李糖苷。

從鼠李糖苷的部分紐曼投影式可以看出：在α-L-鼠李糖苷中，其C1'上的e鍵氫（He）與C2'上的e鍵氫（He）之間的夾角為60°，而在β-L-鼠李糖苷中，其C1'上的a鍵氫（Ha）與C2'上的e鍵氫（He）之間的夾角亦為60°，它們的J值都為2Hz左右，因此不能利用其J值確定其構型。

（2）13C-NMR

碳譜的化學位移值范圍較大，因此一種苷的α構型和β構型中端基碳原子的化學位移常用以判斷苷鍵的構型。糖和苷元連接后，糖中端基碳原子的化學位移明顯增加，而其他碳原子的化學位移則變動不大（見表2.3）。

在某些α和β構型的甲苷中，其端基碳原子的化學位移相差較大，常用以判斷苷鍵的構型。表2.4是一些常見的α-和β-甲基吡喃糖苷端基碳原子的化學位移。

從表2.4可以看出，除D-甘露糖甲苷和L-鼠李糖甲苷外，絕大多數單糖的甲苷，其α和β構型的端基碳原子的δ值都相差約4，因此可以用其δ值來確定其構型。在實際應用中，因溶劑及苷元結構的不同，δ值可有差別。

①呋喃糖甲苷。

②溶劑為吡啶-d。

此外，也可利用耦合常數來確定苷鍵的構型，表2.5是幾種甲苷的值。

從表2.5可以看出：α-甲苷端基碳原子的值約為170Hz，而β-甲苷端基碳原子的值約為160Hz，兩者相差較大，約10Hz，故可利用值確定苷鍵的構型。

2.4.3　確定糖和糖之間、糖與苷元之間的連接位置

糖與糖之間連接位置的確定已在前節多聚糖內容中介紹過。對于糖和苷元鍵合位置的測定，苷元分子中如果有兩個以上羥基，只通過水解反應就不能確定糖和苷元的結合位置，還必須結合其他方法。最常用的方法是先將苷進行全甲基化，然后用含6%～9%HCl的甲醇進行甲醇解，分解出甲基化的苷元，證明其結構式后，在其分子中唯一的羥基，就是和糖結合的位置。苷的甲基化反應常用的方法主要有以下四種，前兩種為經典的方法，后兩種是半微量的現代方法。

（1）Haworth法

用硫酸二甲酯和氫氧化鈉（或碳酸鈉、碳酸鉀）可使醇羥基甲基化，其缺點是如果欲進行全甲基化反應，必須進行多次反應才能達到目的。

（2）Purdie法

用碘甲烷和氧化銀為試劑（一般可在丙酮或四氫呋喃中進行），可使醇羥基甲基化，但因氧化銀具有氧化作用，故只能用于苷的甲基化，而不能用于還原糖的甲基化。

（3）Kuhn改良法

在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，加入碘甲烷和氧化銀或硫酸二甲酯及氫氧化鋇（或氧化鋇），在攪拌下進行甲基化，缺點是反應較為緩慢。

（4）箱守法（Hakomori）

在二甲基亞砜（DMSO）溶液中，加入氫化鈉，以碘甲烷進行甲基化反應。其反應機理是二甲基亞砜與氫化鈉先生成甲基亞磺酰碳負離子，然后在甲基亞磺酰碳負離子的存在下進行甲基化反應，因此氫化鈉的二甲基亞砜溶液又稱為甲基亞磺酰碳負離子溶液。

但因二甲基亞砜和NaH的堿性較強，有酯鍵的苷類易被破壞，不宜使用該法，而應采用Kuhn改良法。

2.4.4　苷中糖與糖之間連接順序的確定

決定苷中糖與糖之間連接順序的方法同前面所述及的多聚糖中糖與糖之間連接順序的確定一樣。