模塊一　光學(xué)分析法

項(xiàng)目一　紫外-可見分光光度法

【必備知識】

紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry）是根據(jù)溶液中物質(zhì)的分子或離子對200～760nm范圍電磁輻射的吸收而建立起來的一種定性和定量方法。

一、光的基本特性

1.光的基本性質(zhì)

光是一種電磁波，具有波粒二象性：波動性和粒子性。

光的波動性：光按波動形式傳播。例如：光的折射、衍射、偏振和干涉現(xiàn)象，就明顯地表現(xiàn)其波動性。光的波動性用波長λ、頻率ν及波數(shù)σ等主要參數(shù)來描述。在真空中波長、頻率或波數(shù)的相互關(guān)系為：

式中，λ為波長，cm；ν為頻率，Hz；c為光速，c≈3×108m·s-1。

光的粒子性：光的吸收、發(fā)射以及光電效應(yīng)等證明了光具有粒子性。光是由“光微粒子”（光量子或光子）所組成的。光量子的能量與波長的關(guān)系為：

式中，E為光量子的能量，erg（1erg=10-7J）；ν為頻率，Hz；h為普朗克常數(shù)，h=6.6262×10-34J·s。

2.物質(zhì)對光的選擇吸收

人眼能感覺到的光稱為可見光（其波長范圍大約在400～760nm）。如果讓一束白光（日光）通過棱鏡，于是發(fā)生折射作用，便分解為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等顏色的光。每種顏色的光具有一定的波長范圍，理論上將具有同一波長的光稱為單色光，包含不同波長的光稱為復(fù)合光。白光是復(fù)合光，它不僅可由上述七種顏色的光混合而成。如果把兩種特定顏色的單色光按一定強(qiáng)度比例混合，也可以得到白光，我們便稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光。如圖1-1中處于對角線關(guān)系的兩種特定顏色光互為互補(bǔ)色光，如藍(lán)色光和黃色光互補(bǔ)。

物質(zhì)的顏色就是因?yàn)槲镔|(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。對固體物質(zhì)來說，當(dāng)白光照射到物質(zhì)上時(shí)，如果物質(zhì)對各種波長的光完全吸收，則呈現(xiàn)黑色；如果完全反射，則呈現(xiàn)白色；如果對各種波長的光均勻吸收，則呈現(xiàn)灰色；如果選擇地吸收某些波長的光，則呈現(xiàn)反射或透射光的顏色。對溶液來說，溶液呈現(xiàn)不同的顏色是由于溶液中的質(zhì)點(diǎn)（離子或分子）對不同波長的光具有選擇性吸收而引起的。當(dāng)白光通過某種溶液時(shí)，如果它選擇性地吸收了白光中某種色光，則溶液呈現(xiàn)透射光的顏色，也就是說，溶液呈現(xiàn)的是它吸收光的互補(bǔ)色光的顏色。例如，硫酸銅溶液因吸收了白光中的黃色光而呈藍(lán)色；高錳酸鉀溶液因吸收了白光中的綠色光而呈現(xiàn)紫色。表1-1為物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與吸收光的對應(yīng)關(guān)系。

二、吸收光譜的產(chǎn)生

吸光物質(zhì)具有吸光作用的質(zhì)點(diǎn)是物質(zhì)的分子或離子，當(dāng)光照射到某物質(zhì)后，該物質(zhì)的分子就有可能吸收光子的能量而發(fā)生能級躍遷，這種現(xiàn)象叫作光的吸收。

分子具有電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級，這些能級都是量子化的。在每一電子能級上有許多間距較小的振動能級，在每一振動能級上又有許多更小的轉(zhuǎn)動能級。若用ΔE電子、ΔE振、ΔE轉(zhuǎn)分別表示電子能級、振動能級、轉(zhuǎn)動能級差，有ΔE電子>ΔE振>ΔE轉(zhuǎn)，如圖1-2所示。

圖中S代表電子能級，ν代表振動能級，r代表轉(zhuǎn)動能級，下標(biāo)0、1、2……代表相應(yīng)能級的基態(tài)、第一激發(fā)態(tài)、第二激發(fā)態(tài)……

分子吸收外來電磁輻射后，它的能量變化ΔE分子為其振動能量變化ΔE振、轉(zhuǎn)動能量變化ΔE轉(zhuǎn)以及電子能量變化ΔE電子的總和，即：

ΔE分子=ΔE振+ΔE轉(zhuǎn)+ΔE電子　　（1-1）

當(dāng)用波長為λ（或頻率ν）的電磁輻射照射分子時(shí)，該分子的較高能級與較低能級之差ΔE恰好等于該電磁波能量hν時(shí)，即有：

　　（1-2）

則該波長（或頻率）的光被該物質(zhì)選擇性地吸收，價(jià)電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。此時(shí)，在微觀上表現(xiàn)為分子由較低能級躍遷到較高能級。在宏觀上則體現(xiàn)為物質(zhì)吸收光。

若用連續(xù)的電磁輻射按波長大小順序分別照射分子，記錄物質(zhì)分子對電磁輻射的吸收。物質(zhì)分子對輻射的吸收程度隨波長變化的關(guān)系，稱為分子吸收曲線，又稱分子吸收光譜。

分子中電子能級間能差約為1～20eV（相應(yīng)的波長為1.25μm～60nm），相當(dāng)于紫外線和可見光的能量。因此，由電子能級躍遷產(chǎn)生的吸收光譜，稱為紫外-可見吸收光譜。

在電子能級躍遷過程中，還會伴隨有振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，因而產(chǎn)生的一系列譜線連成譜帶。因此，紫外-可見吸收光譜實(shí)際上是電子-振動-轉(zhuǎn)動光譜。

三、 吸收定律

1.透光率和吸光度

當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的平行單色光通過一均勻、非散射的吸收介質(zhì)時(shí)，由于吸光物質(zhì)分子與光子作用，一部分光子被吸收；另一部分光子透過介質(zhì)。如果吸收光的強(qiáng)度為Ia，透過光的強(qiáng)度為It，則它們之間的關(guān)系為：

I0=Ia+It　　（1-3）

透過光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比稱為透射比或透光率（transmittance），用T表示。

　　（1-4）

從式（1-4）可看出，溶液的透光率越大，表示溶液對光的吸收越少；反之，透光率越小，表示溶液對光的吸收越多。

透光率的倒數(shù)反映了物質(zhì)對光的吸收程度，取它的對數(shù)稱為吸光度（absorbance），用A表示。

　　（1-5）

透光率T和吸光度A都是表示物質(zhì)對光的吸收程度的一種量度。

2.朗伯定律

當(dāng)一束某一波長的平行單色光通過液層（光吸收層）厚度為L的溶液后，由于溶液吸收了一部分光，光的強(qiáng)度就要減弱，它們之間的關(guān)系為：

　　（1-6）

式中，入射光的強(qiáng)度為I0；透過光的強(qiáng)度It；溶液厚度為L。式（1-6）反映的是在溶液濃度一定時(shí)，光吸收與液層厚度的關(guān)系，稱為朗伯（Lambert）定律。式中的k2為比例常數(shù)，它與入射光的波長以及物質(zhì)的性質(zhì)和溫度有關(guān)。

由朗伯定律可知，當(dāng)入射光的波長、溶液的濃度和溫度一定時(shí)，有色溶液吸收光的程度與液層的厚度成正比。

3.比爾定律

當(dāng)一束波長一定的平行單色光，通過液層厚度一定的均勻有色溶液時(shí)，溶液中的有色質(zhì)點(diǎn)吸收一部分光能，使光強(qiáng)度減弱。顯然，溶液的濃度越大光被吸收的程度就越大。

如用It表示透過光的強(qiáng)度，則得：

　　（1-7）

式（1-7）反映的是在液層的厚度一定時(shí)，光吸收與溶液濃度的定量關(guān)系，稱為比爾（Beer）定律。式中的k4為比例常數(shù)，它與入射光的波長、物質(zhì)的性質(zhì)和溶液溫度有關(guān)。

比爾定律表明，當(dāng)入射光的波長、液層厚度和溶液溫度一定時(shí)，溶液對光的吸收程度與溶液的濃度成正比。

4.朗伯-比爾定律

如果同時(shí)考慮溶液濃度和液層厚度的變化影響物質(zhì)對光的吸收，則上述兩個(gè)定律可合并為朗伯-比爾定律，即將式（1-6）和式（1-7）合并，得到對數(shù)關(guān)系式：

　　（1-8）

式中，A為吸光度；L為吸光介質(zhì)的厚度，亦稱光程，實(shí)際測量中為吸收池厚度，cm；c為吸光物質(zhì)的濃度，mol·L-1、g·L-1或g·（100mL）-1；K為比例常數(shù)。

式（1-8）為光吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式。它表明，當(dāng)一束平行單色光通過均勻、無散射現(xiàn)象的溶液時(shí)，在單色光強(qiáng)度、溶液溫度等條件不變的情況下，溶液吸光度與溶液濃度及液層厚度的乘積成正比。這是吸光光度法進(jìn)行定量分析的理論基礎(chǔ)。

5.吸光系數(shù)的表示

在朗伯-比爾定律A=KcL中，比例常數(shù)K也稱為吸光系數(shù)。物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸光度。為吸光物質(zhì)的特征參數(shù)，與物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溫度及溶劑等因素有關(guān)，其值隨c的單位不同而不同，在一定條件下為常數(shù)。根據(jù)濃度單位不同，K值含義也不盡相同。常有摩爾吸光系數(shù)ε和百分吸光系數(shù)之分。

（1）摩爾吸光系數(shù)

當(dāng)溶液的濃度c以物質(zhì)的量濃度表示時(shí)，K稱為摩爾吸光系數(shù)，用符號ε表示。它的物理意義是指樣品濃度為1mol·L-1的溶液置于1cm樣品池中，在一定波長下測得的吸光度值。單位為L·mol-1·cm-1。此時(shí)朗伯-比爾定律為：

A=εcL

ε值越大，表示吸光質(zhì)點(diǎn)對某波長的光吸收能力越強(qiáng)，光度法測定的靈敏度就越高。

（2）百分吸光系數(shù)

百分吸光系數(shù)也稱比吸光系數(shù)，它是指在波長一定時(shí)，溶液濃度為1%［g·（100mL）-1］，液層厚度為1cm時(shí)的吸光度，用表示，單位為100mL·g-1·cm-1。此時(shí)式（1-8）改為：

摩爾吸光系數(shù)與百分吸光系數(shù)的關(guān)系為：

　　（1-9）

式中，M為被測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量。ε與均為吸光物質(zhì)的特征參數(shù)。

四、有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜

連續(xù)光譜中某些光子的能量被物質(zhì)吸收后，就形成了分子吸收光譜。如果測量某物質(zhì)對不同波長（400～760nm）單色光的吸收程度，以入射光波長λ（nm）為橫坐標(biāo)，以該物質(zhì)對應(yīng)波長光的吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，可得到該物質(zhì)的紫外-可見吸收曲線，也稱為紫外-可見吸收光譜（absorption spectrum）。如圖1-3所示。

吸收峰：曲線上吸收度最大的地方，它所對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長（λmax）。

吸收谷：峰與峰之間吸收度最小的部分，該處的波長稱為最小吸收波長。

肩峰：在一個(gè)吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個(gè)曲折。

末端吸收：在圖譜短波端呈現(xiàn)強(qiáng)強(qiáng)吸收而不成峰形的部分。

吸收光譜描述了該物質(zhì)對不同波長光的吸收能力。圖1-4是KMnO4溶液的吸收曲線。

由圖1-4可見，在可見光范圍內(nèi)，KMnO4溶液對波長525nm附近的綠色光有最大吸收，而對紫色和紅色的吸收很弱，這是KMnO4溶液呈紫紅色的原因。不同濃度的同一物質(zhì)，吸收曲線形狀相似，最大吸收波長相同，但吸光度值不同。在任一波長處，吸光度隨溶液濃度的增加而增大。在一定條件下，一定濃度范圍的稀溶液的吸光度與濃度成正比例，符合比爾定律，這是分光光度法定量分析的依據(jù)。

此外，不同物質(zhì)的吸收曲線形狀和最大吸收波長不同，說明物質(zhì)對不同波長光的吸收與物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，這是分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定性分析的依據(jù)。

五、紫外-可見分光光度計(jì)的基本組成及類型

（一）紫外-可見分光光度計(jì)的基本組成

紫外-可見分光光度計(jì)的類型很多，但其基本是由輻射光源、單色器、吸收池、檢測器、信號處理及顯示系統(tǒng)五部分組成。

1.輻射光源

輻射光源能提供激發(fā)能，使待測分子產(chǎn)生吸收。對光源的要求：在較寬的波長范圍內(nèi)，能夠提供足夠強(qiáng)的連續(xù)光譜；有良好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命；輻射能量隨波長無明顯變化。

紫外-可見分光光度計(jì)常用的光源分為熱輻射光源和氣體放電光源兩種。熱輻射光源常用的有鎢燈和鹵鎢燈，氣體放電光源主要有氫燈和氘燈。

熱輻射光源可發(fā)出波長為320～2500nm的連續(xù)可見光譜，可用作可見光區(qū)的光源。氣體放電光源可發(fā)出波長為160～375nm的連續(xù)輻射，是紫外區(qū)的常見光源。在相同的條件下，玻璃對這段波長范圍內(nèi)的輻射有強(qiáng)吸收，故必須采用石英光窗。

由于同種光源不能同時(shí)產(chǎn)生紫外線和可見光，因此，紫外-可見分光光度計(jì)需要同時(shí)安裝兩種光源。

2.單色器（分光系統(tǒng)）

單色器的作用是將光源發(fā)出的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出任一波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。通常由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、聚焦透鏡和出射狹縫構(gòu)成，如圖1-5所示。入射狹縫用于限制雜散光進(jìn)入單色器，準(zhǔn)直鏡將入射光束變?yōu)槠叫泄馐筮M(jìn)入色散元件。色散元件將復(fù)合光分解成單色光，然后通過聚焦透鏡將平行光聚焦于出射狹縫。出射狹縫用于限制譜帶寬度。常用的色散元件是光柵（raster）和棱鏡（prism）。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測量的靈敏度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。

3.吸收池（比色皿）

吸收池是用于盛放待測溶液和決定透光液層厚度的器件。通常有玻璃和石英比色皿兩種。在可見光區(qū)進(jìn)行測定時(shí)，可選用兩種中的任一種使用。在紫外線區(qū)測定時(shí)，由于玻璃對這段波長范圍的輻射有強(qiáng)吸收，故只能選用石英比色皿進(jìn)行測定。

吸收池的主要規(guī)格有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm，常用的吸收池厚度為1.0cm，根據(jù)被測試樣的濃度和吸收情況來選擇合適的吸收池。

使用吸收池時(shí)，應(yīng)先用溶劑洗滌吸收池，然后再用被測試樣溶液潤洗3次。拿取吸收池時(shí)，應(yīng)拿吸收池毛玻璃的兩面，不要觸摸透光面。吸收池外沾有液體時(shí)，應(yīng)小心地用擦鏡紙或脫脂棉擦凈，保證其透光面上沒有斑痕。避免測定含強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的溶液。

4.檢測器

又稱光電轉(zhuǎn)換器（photoelectric transducer），它的功能是檢測透過吸收池的光信號，并將光信號轉(zhuǎn)變成可測量的電信號。常用的有光電池、光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，它具有響應(yīng)速度快、放大倍數(shù)高、頻率響應(yīng)范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導(dǎo)攝像管或光電二極管陣列作檢測器，具有快速掃描功能。

5.信號處理及顯示系統(tǒng)

它的作用是放大電信號，并以適當(dāng)方式顯示或記錄下來。由于透過試樣后的光很弱，所以射到光電管產(chǎn)生的光電流很小，因此需要放大才能測量出來，放大后的信號可直接輸入記錄式電位計(jì)。常用的信號處理及顯示系統(tǒng)有檢流計(jì)、數(shù)字顯示儀、微型計(jì)算機(jī)等。

（二）紫外-可見分光光度計(jì)的類型

紫外-可見分光光度計(jì)，可分為單光束分光光度計(jì)、雙光束分光光度計(jì)和雙波長分光光度計(jì)。

1.單光束紫外-可見分光光度計(jì)

經(jīng)單色器分光后的一束平行單色光，輪流通過參比溶液和試樣溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，易于維修，適用于測定特定波長的吸收，進(jìn)行定量分析。其原理如圖1-6（a）所示。

2.雙光束紫外-可見分光光度計(jì)

雙光束儀器中，從光源發(fā)出的光經(jīng)單色器分光后，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)折光器分成兩束，交替通過參比池和試樣池，測得的是透過試樣溶液和參比溶液的光信號強(qiáng)度之比。雙光束儀器克服了單光束儀器由于光源不穩(wěn)引起的誤差，并且可以對全波段進(jìn)行掃描。其原理如圖1-6（b）所示。

3.雙波長紫外-可見分光光度計(jì)

該儀器既可用作雙波長分光光度計(jì)，又可用作雙光束儀器。其原理如圖1-6（c）所示。由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個(gè)單色器，得到兩個(gè)不同波長的單色光λ1和λ2，由折光器并束，使其在同一光路交替通過同一吸收池，由光電倍增管檢測信號，得到的信號是兩波長處吸光度之差ΔA。雙波長儀器的主要特點(diǎn)：

①不需參比液，克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈敏度高、選擇性高。

②對渾濁試樣進(jìn)行測定時(shí)，可消除背景吸收。

③適當(dāng)選擇波長，簡化混合組分同時(shí)測定過程。

④可測定導(dǎo)數(shù)光譜（derivative spectrum）。

六、定性、定量、結(jié)構(gòu)分析

（一）定性分析

1.光譜比較法

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，分別測定未知純化合物和已知純化合物的吸收光譜，根據(jù)圖譜中吸收峰的位置、數(shù)目、相對強(qiáng)度及吸收峰的形狀進(jìn)行比較，如果兩者的吸收圖譜完全一致，則可初步認(rèn)定兩者系同一物質(zhì)。如果沒有已知的標(biāo)準(zhǔn)物，則可與《中華人民共和國藥典》中收錄的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，如果二者的圖譜有明顯的差異，即可認(rèn)定二者并非同一物質(zhì)。

2.特征數(shù)據(jù)的比較

用于定性鑒別的主要數(shù)據(jù)有最大吸收波長λmax和吸光系數(shù)（ε、）。在不同化合物的紫外吸收光譜中，可能最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數(shù)ε很接近，但因物質(zhì)的分子量不同，百分吸光系數(shù)的數(shù)值會有差別，故在進(jìn)行比較的時(shí)候，要同時(shí)比較物質(zhì)的最大吸收波長λmax和百分吸光系數(shù)。例如：醋酸甲羥孕酮和炔諾酮，在無水乙醇中測得λmax都在（240±1）nm，而且ε相差不大，但是差別很大，可以由此來進(jìn)行鑒別。

（二）定量分析

根據(jù)朗伯-比爾定律，在一定條件下待測溶液的吸光度和溶液的濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此可對待測組分進(jìn)行定量分析。

1.吸光系數(shù)法

如果待測樣品的吸光系數(shù)已知，由紫外-可見分光光度法測得樣品的吸光度，根據(jù)朗伯-比爾定律A=KcL，可計(jì)算出待測樣品的濃度。

2.標(biāo)準(zhǔn)對比法

在相同條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為cx的待測溶液。分別測定吸光度，根據(jù)朗伯-比爾定律：

As=KLcs

Ax=KLcx

由于標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液當(dāng)中所含的物質(zhì)為同一物質(zhì)，故吸光系數(shù)相同，如果選用相同的比色皿，兩式相消，即可求得待測物質(zhì)的濃度。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

首先，配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定對應(yīng)的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，在一定范圍內(nèi)，可得到一條過原點(diǎn)的直線，稱之為標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后再在相同的實(shí)驗(yàn)條件下測定待測溶液的吸光度，從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的回歸方程計(jì)算出待測溶液的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法需要有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，適用于大批量樣品的測定。

（三）紫外吸收光譜法結(jié)構(gòu)分析

紫外吸收光譜往往要與其他儀器聯(lián)用才能準(zhǔn)確地對一種化合物作出鑒定，但是對于化合物中官能團(tuán)及共軛體系的確定是十分有效的，規(guī)律如下：

①在220～280nm范圍內(nèi)無吸收，可推斷該化合物不含苯環(huán)、共軛雙鍵、醛基、酮基、溴、碘。

②在210～250nm范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收，表示含有共軛雙鍵。

③在270～300nm范圍內(nèi)有一個(gè)隨溶劑極性增大而向短波移動的弱吸收帶，說明有羥基的存在。

④在260nm左右處具有精細(xì)結(jié)構(gòu)的弱吸收帶表明有苯環(huán)的存在。

⑤如果化合物有許多吸收峰，或者延伸到可見光區(qū)，可能為多環(huán)芳烴。

⑥還可用于互變異構(gòu)體的判斷。

七、分光光度計(jì)的使用及維護(hù)

（一）分光光度計(jì)的使用程序

1.開機(jī)

分別開啟計(jì)算機(jī)和儀器主機(jī)。進(jìn)入操作系統(tǒng)，預(yù)熱20min。

2.儀器設(shè)置

設(shè)置的主要參數(shù)包括：①波長的選擇；②吸光度數(shù)值的設(shè)置；③測量模式的設(shè)置；④掃描速度等的設(shè)置。

3.將待測試液放入樣品池中并測試

根據(jù)設(shè)置好的參數(shù)進(jìn)行測試，窗口出現(xiàn)掃描譜圖或者吸光度數(shù)值，根據(jù)需要進(jìn)行保存或者是數(shù)據(jù)的導(dǎo)出。

4.數(shù)據(jù)處理

將導(dǎo)出的數(shù)據(jù)輸入到作圖軟件之中作圖。

5.關(guān)機(jī)

①關(guān)閉運(yùn)行軟件，退出操作系統(tǒng)。

②關(guān)閉儀器主機(jī)和計(jì)算機(jī)主機(jī)。

（二）分光光度計(jì)儀器維護(hù)

分光光度計(jì)是精密光學(xué)儀器，正確安裝、使用和保養(yǎng)對保持儀器良好的性能和保證測試的準(zhǔn)確度有重要的作用。

分光光度計(jì)應(yīng)安裝在穩(wěn)固的工作臺上（周圍不應(yīng)有強(qiáng)磁場，以防電磁干擾），室內(nèi)溫度宜保持在15～28℃。室內(nèi)應(yīng)干燥，相對濕度宜控制在45%～65%，不應(yīng)超過70%。室內(nèi)應(yīng)無腐蝕性氣體，應(yīng)與化學(xué)分析操作室分開，室內(nèi)光線不宜過強(qiáng)。

保養(yǎng)和維護(hù)方法如下：

①儀器工作電源一般為220V，允許±10%的電壓波動。為保持光源燈和檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在電源電壓波動較大的實(shí)驗(yàn)室，最好配備穩(wěn)壓器。

②為了延長光源使用壽命，在不使用時(shí)不要開光源燈。如果光源燈亮度明顯減弱或不穩(wěn)定，應(yīng)及時(shí)更換新燈。更換后要調(diào)節(jié)好燈絲位置，不要用手直接接觸窗口或燈泡，避免油污粘附，若不小心接觸過，要用無水乙醇擦拭。

③不要在儀器上方傾倒測試樣品，以免樣品污染儀器表面，損壞儀器。

④在可見光區(qū)進(jìn)行測量時(shí)，要把氫燈或者氘燈關(guān)掉。

⑤在進(jìn)行測試前，先打開儀器主機(jī)進(jìn)行預(yù)熱后再進(jìn)行測定。

⑥光電轉(zhuǎn)換元件不能長時(shí)間曝光，應(yīng)避免強(qiáng)光照射或受潮積塵。

【任務(wù)操作】

任務(wù)一　鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵

【任務(wù)目標(biāo)】

1.正確使用分光光度計(jì)，了解工作原理。

2.正確繪制吸收曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 能夠利用鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵的含量。

【測定原理】

由朗伯-比爾定律A=KLc可知，在一定條件下，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。繪制出以吸光度A為縱坐標(biāo)、濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測出待測液的吸光度，就可由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度，此濃度即為待測樣品的含量。

鄰二氮菲分光光度法是化工產(chǎn)品中測定微量鐵的通用方法，在pH值為2～9的溶液中，鄰二氮菲和二價(jià)鐵離子結(jié)合生成紅色配合物：

此配合物的lgK穩(wěn)=21.3，摩爾吸光系數(shù)ε510=1.1×104L·mol-1·cm-1，而Fe3+能與鄰二氮菲生成3∶1配合物，呈淡藍(lán)色，lgK穩(wěn)=14.1。所以在加入顯色劑之前，應(yīng)用鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）將Fe3+還原為Fe2+，其反應(yīng)式如下：

2Fe3++2NH2OH·HCl2Fe2++N2+2H2O+4H++2Cl-

【儀器與試劑】

TU-1810型分光光度計(jì)、酸度計(jì)、50mL比色管、容量瓶、吸量管（1mL、2mL、5mL、10mL）、比色皿、洗耳球。

1×10-3mol·L-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液、100μg·mL-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液、10%鹽酸羥胺、1mol·L-1 NaAc、0.15%鄰二氮菲水溶液。

【任務(wù)操作步驟】

1.準(zhǔn)備工作

打開儀器電源開關(guān)，預(yù)熱，調(diào)試儀器。

2.測量工作

（1）吸收曲線的繪制和測量波長的選擇

用吸量管吸取2.00mL 1.0×10-3mol·L-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入50mL比色管中，加入1mL 10%鹽酸羥胺溶液，搖勻；加入2mL 0.15%鄰二氮菲溶液；5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀釋至刻度。在分光光度計(jì)上以水為參比溶液，在440～580nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)、繪制吸收曲線。在紫外-可見分光光度法定量分析選擇測量的適宜波長時(shí)，一般選用最大吸收波長λmax為測定波長。

（2）顯色劑條件的選擇（顯色劑用量）

在6支比色管中，各加入2.00mL 1.0×10-3mol·L-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和1mL 10%鹽酸羥胺溶液，搖勻。分別加入0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL及4.00mL 0.15%鄰二氮菲溶液；5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計(jì)上用1cm比色皿，采用試劑空白為參比溶液，測吸光度。以鄰二氮菲體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度-顯色劑用量曲線，從而確定最佳顯色劑用量。

（3）溶液pH的確定

取8支50mL比色管，各加入2mL 1.00×10-3mol·L-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和1mL 10%的鹽酸羥胺溶液，搖勻。放置2min，加入2mL 0.15%鄰二氮菲，搖勻，分別加入0.00mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL 1mol·L-1的NaAc溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計(jì)上，在其他條件一定的前提下，分別測其吸光度。以鄰二氮菲體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-pH曲線，從而確定最佳顯色劑用量。

（4）顯色時(shí)間及有色溶液的穩(wěn)定性

用吸量管吸取2mL 1.00×10-3mol·L-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL比色管中，加入1mL 10%的鹽酸羥胺溶液，搖勻。再加入2mL 0.15%鄰二氮菲溶液，5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白為參比，靜置，每2min測一次吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-t吸收曲線，選擇測量適宜的顯色時(shí)間。

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在6個(gè)50mL的容量瓶中，用1mL吸量管分別加入0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL 100μg·mL-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入1mL 10%鹽酸羥胺，搖勻。再加入2mL 0.15%的鄰二氮菲溶液和5mL 1mol·L-1NaAc溶液，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。放置一段時(shí)間。以試劑空白為參比，在選定的波長、適宜顯色劑用量、適宜顯色時(shí)間下測定各溶液的吸光度，繪制c-A標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（6）試液含鐵量的測定

準(zhǔn)確吸取適量試液（如工業(yè)鹽酸）代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟同上，平行三次測定其吸光度。記錄計(jì)算機(jī)顯示的含鐵量，計(jì)算試液中鐵的含量（以mg·L-1表示）。

【數(shù)據(jù)處理】

1.鄰二氮菲-Fe2+吸收曲線的繪制

①數(shù)據(jù)記錄。

②吸收曲線圖，由圖得出最大吸收波長λmax。

2.分析條件的選擇

①顯色劑用量。

②溶液pH。

③顯色時(shí)間。

3.工業(yè)鹽酸中鐵含量的測定（見表1-2和表1-3）

【注意事項(xiàng)】

1.各種試劑的加入順序。

2.測量條件選擇好后不要再改變。

【任務(wù)思考】

1.分光光度法測定微量鐵時(shí)為什么要選擇在pH=2～9？

2.參比溶液的作用是什么？

任務(wù)二　產(chǎn)品中苯甲酸含量的測定

【任務(wù)目標(biāo)】

1.正確使用分光光度計(jì)，了解工作原理。

2.熟練繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，能進(jìn)行樣品含量的測定。

【測定原理】

含有苯環(huán)和共軛雙鍵的有機(jī)化合物在紫外區(qū)有特征吸收，未知結(jié)構(gòu)不同對紫外-可見光的吸收曲線不同。苯甲酸及其鹽對紫外線有選擇性吸收，最大吸收波長在225nm處左右。

【儀器與試劑】

TU-1810型紫外分光光度計(jì)、酸度計(jì)、50mL容量瓶、移液管、比色皿、洗耳球。

1mg·mL-1苯甲酸儲備液：稱取0.5g苯甲酸，加水溶解后用水稀釋至500mL，搖勻后備用。取此儲備液25.00mL于250mL容量瓶中，用水稀釋至250mL，搖勻后備用。此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸含量為100μg·mL-1。

【任務(wù)操作步驟】

1.苯甲酸系列工作溶液的配制

在7支50mL的容量瓶中，分別加入0.00mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL、15.00mL、20.00mL的100μg·mL-1苯甲酸溶液，用水稀釋至刻度，搖勻備用。

2.苯甲酸吸收曲線的繪制

在分光光度計(jì)上，以水為參比溶液，用1cm的石英吸收池，在200～400nm波長范圍內(nèi)測定并記錄10.0μg·mL-1苯甲酸工作溶液在不同波長下相應(yīng)的吸光度A。以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，并在曲線上找出最大吸收波長，用λmax表示。

3.苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在分光光度計(jì)上，用1cm的石英比色皿，在最大吸收波長處，測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以苯甲酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

4.未知樣品苯甲酸含量的測定

準(zhǔn)確吸取未知樣品試液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟同上，平行三次測定其吸光度，計(jì)算未知樣品試液中苯甲酸的含量（以μg·L-1表示）。

【數(shù)據(jù)處理】

1.苯甲酸吸收曲線的繪制

①數(shù)據(jù)記錄。

②吸收曲線圖，由圖得出最大吸收波長λmax。

2.產(chǎn)品中苯甲酸含量的測定（見表1-4和表1-5）

【任務(wù)思考】

1.本實(shí)驗(yàn)可否選用玻璃比色皿進(jìn)行測定？為什么？

2.如果樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)溶液最大吸光度之外，能否將標(biāo)準(zhǔn)曲線外延求得樣品的含量？

任務(wù)三　棗果皮中總黃酮含量的測定

【任務(wù)目標(biāo)】

1.掌握紫外-可見分光光度法的基本原理和定量分析方法。

2.了解紫外-可見分光光度計(jì)的構(gòu)造及使用方法。

3.學(xué)會紫外-可見分光光度分析最佳條件的選擇。

【測定原理】

根據(jù)朗伯-比爾定律A=KLc，在一定條件下待測溶液的吸光度和溶液的濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此可對棗果皮中總黃酮的含量進(jìn)行定量分析。

【儀器與試劑】

棗果皮；蘆丁（上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，純度>99%）；無水乙醇；甲醇；氫氧化鈉；亞硝酸鈉；硝酸鋁； TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BS210S電子分析天平（北京賽多利斯公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；TDL-5-A臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

【任務(wù)操作步驟】

①選取實(shí)驗(yàn)（棗果皮中總黃酮含量的測定）。

②打開電腦主機(jī)和儀器電源。

③打開工作站軟件，進(jìn)行自檢。

④參數(shù)設(shè)置。

⑤光譜掃描，試劑空白進(jìn)行基線校正。

⑥根據(jù)光譜掃描結(jié)果，選擇適宜的測定波長。

⑦光度測定。

⑧選用試劑空白作為參比，進(jìn)行調(diào)零。

⑨標(biāo)準(zhǔn)品及樣品吸光度的測定。

⑩數(shù)據(jù)處理（記錄濃度、吸光度、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)）。

實(shí)驗(yàn)完畢，關(guān)閉儀器。

【任務(wù)提示】

在操作的過程中，應(yīng)重點(diǎn)提示操作的步驟及儀器的使用，讓學(xué)生知道規(guī)范操作的標(biāo)準(zhǔn)。

【任務(wù)檢測】

①檢查操作是否規(guī)范。

②查看數(shù)據(jù)處理是否正確。

【任務(wù)報(bào)告】

學(xué)生能夠熟練操作儀器及學(xué)會數(shù)據(jù)的處理。

【任務(wù)評價(jià)】

①實(shí)訓(xùn)前資料的收集。

②獨(dú)立操作及動手能力。

③實(shí)訓(xùn)操作的規(guī)范性。

④實(shí)訓(xùn)的紀(jì)律性。

⑤實(shí)訓(xùn)報(bào)告。

【目標(biāo)檢測】

一、名詞解釋

透過率，吸光度，摩爾吸光系數(shù)，百分吸光系數(shù)，吸收光譜

二、填空題

1.在吸收光譜分析技術(shù)中，常因波長范圍不同而選用不同材料制作的吸收池。可見光譜分析技術(shù)中選用____________吸收池，紫外光譜分析技術(shù)中選用____________吸收池。

2.紫外-可見分光光度計(jì)中，可見光區(qū)常用的光源為_______，可見光波長范圍為_______，紫外線區(qū)常用的光源為_______，紫外線波長范圍為_______。

3.紫外-可見分光光度計(jì)的類型很多，但其基本是由_______、_______、_______、_______、_______五部分組成。

4.當(dāng)吸光度A=0時(shí)，透過率T為_______。

5.在紫外-可見吸收光譜分析技術(shù)中，進(jìn)行含量測定時(shí)，吸光度的最適宜范圍是_______。

6.朗伯定律是說明在一定條件下，光的吸收與_______成正比，比爾定律說明在一定條件下，光的吸收與_______成正比，二者合為一體稱為朗伯-比爾定律。

三、計(jì)算題

1.已知Fe2+濃度為1.0mg·L-1的溶液，用鄰二氮菲在一定條件下顯色，用厚度為2cm的吸收池在510nm處測得吸光度為0.380，試計(jì)算其摩爾吸光系數(shù)。

2.為檢測某鋼廠生產(chǎn)的一批彈簧鋼中錳含量是否達(dá)標(biāo)，現(xiàn)取鋼試樣1.00g溶解于酸中，將其中的錳氧化成KMnO4，準(zhǔn)確配制成250mL溶液，測得其吸光度為1.00×10-3mol·L-1 KMnO4溶液吸光度的1.5倍，計(jì)算鋼中錳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3.稱取維生素C 0.05g溶于100mL的0.005mol·L-1硫酸溶液中，再準(zhǔn)確量取此溶液2.00mL稀釋至100mL，取此溶液于1cm吸收池中，在245nm處測得A值為0.551，求試樣中維生素C的百分含量。