模塊一　光學分析法

項目一　紫外-可見分光光度法

【必備知識】

紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry）是根據溶液中物質的分子或離子對200～760nm范圍電磁輻射的吸收而建立起來的一種定性和定量方法。

一、光的基本特性

1.光的基本性質

光是一種電磁波，具有波粒二象性：波動性和粒子性。

光的波動性：光按波動形式傳播。例如：光的折射、衍射、偏振和干涉現象，就明顯地表現其波動性。光的波動性用波長λ、頻率ν及波數σ等主要參數來描述。在真空中波長、頻率或波數的相互關系為：

式中，λ為波長，cm；ν為頻率，Hz；c為光速，c≈3×108m·s-1。

光的粒子性：光的吸收、發射以及光電效應等證明了光具有粒子性。光是由“光微粒子”（光量子或光子）所組成的。光量子的能量與波長的關系為：

式中，E為光量子的能量，erg（1erg=10-7J）；ν為頻率，Hz；h為普朗克常數，h=6.6262×10-34J·s。

2.物質對光的選擇吸收

人眼能感覺到的光稱為可見光（其波長范圍大約在400～760nm）。如果讓一束白光（日光）通過棱鏡，于是發生折射作用，便分解為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色的光。每種顏色的光具有一定的波長范圍，理論上將具有同一波長的光稱為單色光，包含不同波長的光稱為復合光。白光是復合光，它不僅可由上述七種顏色的光混合而成。如果把兩種特定顏色的單色光按一定強度比例混合，也可以得到白光，我們便稱這兩種單色光為互補色光。如圖1-1中處于對角線關系的兩種特定顏色光互為互補色光，如藍色光和黃色光互補。

物質的顏色就是因為物質對不同波長的光具有選擇性吸收作用而產生的。對固體物質來說，當白光照射到物質上時，如果物質對各種波長的光完全吸收，則呈現黑色；如果完全反射，則呈現白色；如果對各種波長的光均勻吸收，則呈現灰色；如果選擇地吸收某些波長的光，則呈現反射或透射光的顏色。對溶液來說，溶液呈現不同的顏色是由于溶液中的質點（離子或分子）對不同波長的光具有選擇性吸收而引起的。當白光通過某種溶液時，如果它選擇性地吸收了白光中某種色光，則溶液呈現透射光的顏色，也就是說，溶液呈現的是它吸收光的互補色光的顏色。例如，硫酸銅溶液因吸收了白光中的黃色光而呈藍色；高錳酸鉀溶液因吸收了白光中的綠色光而呈現紫色。表1-1為物質呈現的顏色與吸收光的對應關系。

二、吸收光譜的產生

吸光物質具有吸光作用的質點是物質的分子或離子，當光照射到某物質后，該物質的分子就有可能吸收光子的能量而發生能級躍遷，這種現象叫作光的吸收。

分子具有電子能級、振動能級和轉動能級，這些能級都是量子化的。在每一電子能級上有許多間距較小的振動能級，在每一振動能級上又有許多更小的轉動能級。若用ΔE電子、ΔE振、ΔE轉分別表示電子能級、振動能級、轉動能級差，有ΔE電子>ΔE振>ΔE轉，如圖1-2所示。

圖中S代表電子能級，ν代表振動能級，r代表轉動能級，下標0、1、2……代表相應能級的基態、第一激發態、第二激發態……

分子吸收外來電磁輻射后，它的能量變化ΔE分子為其振動能量變化ΔE振、轉動能量變化ΔE轉以及電子能量變化ΔE電子的總和，即：

ΔE分子=ΔE振+ΔE轉+ΔE電子　　（1-1）

當用波長為λ（或頻率ν）的電磁輻射照射分子時，該分子的較高能級與較低能級之差ΔE恰好等于該電磁波能量hν時，即有：

　　（1-2）

則該波長（或頻率）的光被該物質選擇性地吸收，價電子從基態躍遷到激發態。此時，在微觀上表現為分子由較低能級躍遷到較高能級。在宏觀上則體現為物質吸收光。

若用連續的電磁輻射按波長大小順序分別照射分子，記錄物質分子對電磁輻射的吸收。物質分子對輻射的吸收程度隨波長變化的關系，稱為分子吸收曲線，又稱分子吸收光譜。

分子中電子能級間能差約為1～20eV（相應的波長為1.25μm～60nm），相當于紫外線和可見光的能量。因此，由電子能級躍遷產生的吸收光譜，稱為紫外-可見吸收光譜。

在電子能級躍遷過程中，還會伴隨有振動能級和轉動能級的躍遷，因而產生的一系列譜線連成譜帶。因此，紫外-可見吸收光譜實際上是電子-振動-轉動光譜。

三、 吸收定律

1.透光率和吸光度

當一束強度為I0的平行單色光通過一均勻、非散射的吸收介質時，由于吸光物質分子與光子作用，一部分光子被吸收；另一部分光子透過介質。如果吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，則它們之間的關系為：

I0=Ia+It　　（1-3）

透過光的強度It與入射光強度I0之比稱為透射比或透光率（transmittance），用T表示。

　　（1-4）

從式（1-4）可看出，溶液的透光率越大，表示溶液對光的吸收越少；反之，透光率越小，表示溶液對光的吸收越多。

透光率的倒數反映了物質對光的吸收程度，取它的對數稱為吸光度（absorbance），用A表示。

　　（1-5）

透光率T和吸光度A都是表示物質對光的吸收程度的一種量度。

2.朗伯定律

當一束某一波長的平行單色光通過液層（光吸收層）厚度為L的溶液后，由于溶液吸收了一部分光，光的強度就要減弱，它們之間的關系為：

　　（1-6）

式中，入射光的強度為I0；透過光的強度It；溶液厚度為L。式（1-6）反映的是在溶液濃度一定時，光吸收與液層厚度的關系，稱為朗伯（Lambert）定律。式中的k2為比例常數，它與入射光的波長以及物質的性質和溫度有關。

由朗伯定律可知，當入射光的波長、溶液的濃度和溫度一定時，有色溶液吸收光的程度與液層的厚度成正比。

3.比爾定律

當一束波長一定的平行單色光，通過液層厚度一定的均勻有色溶液時，溶液中的有色質點吸收一部分光能，使光強度減弱。顯然，溶液的濃度越大光被吸收的程度就越大。

如用It表示透過光的強度，則得：

　　（1-7）

式（1-7）反映的是在液層的厚度一定時，光吸收與溶液濃度的定量關系，稱為比爾（Beer）定律。式中的k4為比例常數，它與入射光的波長、物質的性質和溶液溫度有關。

比爾定律表明，當入射光的波長、液層厚度和溶液溫度一定時，溶液對光的吸收程度與溶液的濃度成正比。

4.朗伯-比爾定律

如果同時考慮溶液濃度和液層厚度的變化影響物質對光的吸收，則上述兩個定律可合并為朗伯-比爾定律，即將式（1-6）和式（1-7）合并，得到對數關系式：

　　（1-8）

式中，A為吸光度；L為吸光介質的厚度，亦稱光程，實際測量中為吸收池厚度，cm；c為吸光物質的濃度，mol·L-1、g·L-1或g·（100mL）-1；K為比例常數。

式（1-8）為光吸收定律的數學表達式。它表明，當一束平行單色光通過均勻、無散射現象的溶液時，在單色光強度、溶液溫度等條件不變的情況下，溶液吸光度與溶液濃度及液層厚度的乘積成正比。這是吸光光度法進行定量分析的理論基礎。

5.吸光系數的表示

在朗伯-比爾定律A=KcL中，比例常數K也稱為吸光系數。物理意義是吸光物質在單位濃度、單位液層厚度時的吸光度。為吸光物質的特征參數，與物質的性質、入射光波長、溫度及溶劑等因素有關，其值隨c的單位不同而不同，在一定條件下為常數。根據濃度單位不同，K值含義也不盡相同。常有摩爾吸光系數ε和百分吸光系數之分。

（1）摩爾吸光系數

當溶液的濃度c以物質的量濃度表示時，K稱為摩爾吸光系數，用符號ε表示。它的物理意義是指樣品濃度為1mol·L-1的溶液置于1cm樣品池中，在一定波長下測得的吸光度值。單位為L·mol-1·cm-1。此時朗伯-比爾定律為：

A=εcL

ε值越大，表示吸光質點對某波長的光吸收能力越強，光度法測定的靈敏度就越高。

（2）百分吸光系數

百分吸光系數也稱比吸光系數，它是指在波長一定時，溶液濃度為1%［g·（100mL）-1］，液層厚度為1cm時的吸光度，用表示，單位為100mL·g-1·cm-1。此時式（1-8）改為：

摩爾吸光系數與百分吸光系數的關系為：

　　（1-9）

式中，M為被測物質的摩爾質量。ε與均為吸光物質的特征參數。

四、有機化合物的紫外-可見吸收光譜

連續光譜中某些光子的能量被物質吸收后，就形成了分子吸收光譜。如果測量某物質對不同波長（400～760nm）單色光的吸收程度，以入射光波長λ（nm）為橫坐標，以該物質對應波長光的吸光度A為縱坐標作圖，可得到該物質的紫外-可見吸收曲線，也稱為紫外-可見吸收光譜（absorption spectrum）。如圖1-3所示。

吸收峰：曲線上吸收度最大的地方，它所對應的波長稱為最大吸收波長（λmax）。

吸收谷：峰與峰之間吸收度最小的部分，該處的波長稱為最小吸收波長。

肩峰：在一個吸收峰旁邊產生的一個曲折。

末端吸收：在圖譜短波端呈現強強吸收而不成峰形的部分。

吸收光譜描述了該物質對不同波長光的吸收能力。圖1-4是KMnO4溶液的吸收曲線。

由圖1-4可見，在可見光范圍內，KMnO4溶液對波長525nm附近的綠色光有最大吸收，而對紫色和紅色的吸收很弱，這是KMnO4溶液呈紫紅色的原因。不同濃度的同一物質，吸收曲線形狀相似，最大吸收波長相同，但吸光度值不同。在任一波長處，吸光度隨溶液濃度的增加而增大。在一定條件下，一定濃度范圍的稀溶液的吸光度與濃度成正比例，符合比爾定律，這是分光光度法定量分析的依據。

此外，不同物質的吸收曲線形狀和最大吸收波長不同，說明物質對不同波長光的吸收與物質結構有關，這是分光光度法對物質進行定性分析的依據。

五、紫外-可見分光光度計的基本組成及類型

（一）紫外-可見分光光度計的基本組成

紫外-可見分光光度計的類型很多，但其基本是由輻射光源、單色器、吸收池、檢測器、信號處理及顯示系統五部分組成。

1.輻射光源

輻射光源能提供激發能，使待測分子產生吸收。對光源的要求：在較寬的波長范圍內，能夠提供足夠強的連續光譜；有良好的穩定性、較長的使用壽命；輻射能量隨波長無明顯變化。

紫外-可見分光光度計常用的光源分為熱輻射光源和氣體放電光源兩種。熱輻射光源常用的有鎢燈和鹵鎢燈，氣體放電光源主要有氫燈和氘燈。

熱輻射光源可發出波長為320～2500nm的連續可見光譜，可用作可見光區的光源。氣體放電光源可發出波長為160～375nm的連續輻射，是紫外區的常見光源。在相同的條件下，玻璃對這段波長范圍內的輻射有強吸收，故必須采用石英光窗。

由于同種光源不能同時產生紫外線和可見光，因此，紫外-可見分光光度計需要同時安裝兩種光源。

2.單色器（分光系統）

單色器的作用是將光源發出的復合光分解成單色光并可從中選出任一波長單色光的光學系統。通常由入射狹縫、準直鏡、色散元件、聚焦透鏡和出射狹縫構成，如圖1-5所示。入射狹縫用于限制雜散光進入單色器，準直鏡將入射光束變為平行光束后進入色散元件。色散元件將復合光分解成單色光，然后通過聚焦透鏡將平行光聚焦于出射狹縫。出射狹縫用于限制譜帶寬度。常用的色散元件是光柵（raster）和棱鏡（prism）。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測量的靈敏度、選擇性及校準曲線的線性關系等。

3.吸收池（比色皿）

吸收池是用于盛放待測溶液和決定透光液層厚度的器件。通常有玻璃和石英比色皿兩種。在可見光區進行測定時，可選用兩種中的任一種使用。在紫外線區測定時，由于玻璃對這段波長范圍的輻射有強吸收，故只能選用石英比色皿進行測定。

吸收池的主要規格有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm，常用的吸收池厚度為1.0cm，根據被測試樣的濃度和吸收情況來選擇合適的吸收池。

使用吸收池時，應先用溶劑洗滌吸收池，然后再用被測試樣溶液潤洗3次。拿取吸收池時，應拿吸收池毛玻璃的兩面，不要觸摸透光面。吸收池外沾有液體時，應小心地用擦鏡紙或脫脂棉擦凈，保證其透光面上沒有斑痕。避免測定含強酸或強堿的溶液。

4.檢測器

又稱光電轉換器（photoelectric transducer），它的功能是檢測透過吸收池的光信號，并將光信號轉變成可測量的電信號。常用的有光電池、光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，它具有響應速度快、放大倍數高、頻率響應范圍廣的優點，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導攝像管或光電二極管陣列作檢測器，具有快速掃描功能。

5.信號處理及顯示系統

它的作用是放大電信號，并以適當方式顯示或記錄下來。由于透過試樣后的光很弱，所以射到光電管產生的光電流很小，因此需要放大才能測量出來，放大后的信號可直接輸入記錄式電位計。常用的信號處理及顯示系統有檢流計、數字顯示儀、微型計算機等。

（二）紫外-可見分光光度計的類型

紫外-可見分光光度計，可分為單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。

1.單光束紫外-可見分光光度計

經單色器分光后的一束平行單色光，輪流通過參比溶液和試樣溶液，以進行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計結構簡單，操作方便，易于維修，適用于測定特定波長的吸收，進行定量分析。其原理如圖1-6（a）所示。

2.雙光束紫外-可見分光光度計

雙光束儀器中，從光源發出的光經單色器分光后，再經旋轉折光器分成兩束，交替通過參比池和試樣池，測得的是透過試樣溶液和參比溶液的光信號強度之比。雙光束儀器克服了單光束儀器由于光源不穩引起的誤差，并且可以對全波段進行掃描。其原理如圖1-6（b）所示。

3.雙波長紫外-可見分光光度計

該儀器既可用作雙波長分光光度計，又可用作雙光束儀器。其原理如圖1-6（c）所示。由同一光源發出的光被分成兩束，分別經過兩個單色器，得到兩個不同波長的單色光λ1和λ2，由折光器并束，使其在同一光路交替通過同一吸收池，由光電倍增管檢測信號，得到的信號是兩波長處吸光度之差ΔA。雙波長儀器的主要特點：

①不需參比液，克服了電源不穩而產生的誤差，靈敏度高、選擇性高。

②對渾濁試樣進行測定時，可消除背景吸收。

③適當選擇波長，簡化混合組分同時測定過程。

④可測定導數光譜（derivative spectrum）。

六、定性、定量、結構分析

（一）定性分析

1.光譜比較法

在相同的實驗條件下，分別測定未知純化合物和已知純化合物的吸收光譜，根據圖譜中吸收峰的位置、數目、相對強度及吸收峰的形狀進行比較，如果兩者的吸收圖譜完全一致，則可初步認定兩者系同一物質。如果沒有已知的標準物，則可與《中華人民共和國藥典》中收錄的標準圖譜比較，如果二者的圖譜有明顯的差異，即可認定二者并非同一物質。

2.特征數據的比較

用于定性鑒別的主要數據有最大吸收波長λmax和吸光系數（ε、）。在不同化合物的紫外吸收光譜中，可能最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數ε很接近，但因物質的分子量不同，百分吸光系數的數值會有差別，故在進行比較的時候，要同時比較物質的最大吸收波長λmax和百分吸光系數。例如：醋酸甲羥孕酮和炔諾酮，在無水乙醇中測得λmax都在（240±1）nm，而且ε相差不大，但是差別很大，可以由此來進行鑒別。

（二）定量分析

根據朗伯-比爾定律，在一定條件下待測溶液的吸光度和溶液的濃度呈線性關系，據此可對待測組分進行定量分析。

1.吸光系數法

如果待測樣品的吸光系數已知，由紫外-可見分光光度法測得樣品的吸光度，根據朗伯-比爾定律A=KcL，可計算出待測樣品的濃度。

2.標準對比法

在相同條件下，配制濃度為cs的標準溶液和濃度為cx的待測溶液。分別測定吸光度，根據朗伯-比爾定律：

As=KLcs

Ax=KLcx

由于標準溶液和待測溶液當中所含的物質為同一物質，故吸光系數相同，如果選用相同的比色皿，兩式相消，即可求得待測物質的濃度。

3.標準曲線法

首先，配制一系列濃度不同的標準溶液，分別測定對應的吸光度，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，在一定范圍內，可得到一條過原點的直線，稱之為標準曲線。然后再在相同的實驗條件下測定待測溶液的吸光度，從上述標準曲線得出的回歸方程計算出待測溶液的濃度。

標準曲線法需要有標準物質，適用于大批量樣品的測定。

（三）紫外吸收光譜法結構分析

紫外吸收光譜往往要與其他儀器聯用才能準確地對一種化合物作出鑒定，但是對于化合物中官能團及共軛體系的確定是十分有效的，規律如下：

①在220～280nm范圍內無吸收，可推斷該化合物不含苯環、共軛雙鍵、醛基、酮基、溴、碘。

②在210～250nm范圍內有強吸收，表示含有共軛雙鍵。

③在270～300nm范圍內有一個隨溶劑極性增大而向短波移動的弱吸收帶，說明有羥基的存在。

④在260nm左右處具有精細結構的弱吸收帶表明有苯環的存在。

⑤如果化合物有許多吸收峰，或者延伸到可見光區，可能為多環芳烴。

⑥還可用于互變異構體的判斷。

七、分光光度計的使用及維護

（一）分光光度計的使用程序

1.開機

分別開啟計算機和儀器主機。進入操作系統，預熱20min。

2.儀器設置

設置的主要參數包括：①波長的選擇；②吸光度數值的設置；③測量模式的設置；④掃描速度等的設置。

3.將待測試液放入樣品池中并測試

根據設置好的參數進行測試，窗口出現掃描譜圖或者吸光度數值，根據需要進行保存或者是數據的導出。

4.數據處理

將導出的數據輸入到作圖軟件之中作圖。

5.關機

①關閉運行軟件，退出操作系統。

②關閉儀器主機和計算機主機。

（二）分光光度計儀器維護

分光光度計是精密光學儀器，正確安裝、使用和保養對保持儀器良好的性能和保證測試的準確度有重要的作用。

分光光度計應安裝在穩固的工作臺上（周圍不應有強磁場，以防電磁干擾），室內溫度宜保持在15～28℃。室內應干燥，相對濕度宜控制在45%～65%，不應超過70%。室內應無腐蝕性氣體，應與化學分析操作室分開，室內光線不宜過強。

保養和維護方法如下：

①儀器工作電源一般為220V，允許±10%的電壓波動。為保持光源燈和檢測系統的穩定性，在電源電壓波動較大的實驗室，最好配備穩壓器。

②為了延長光源使用壽命，在不使用時不要開光源燈。如果光源燈亮度明顯減弱或不穩定，應及時更換新燈。更換后要調節好燈絲位置，不要用手直接接觸窗口或燈泡，避免油污粘附，若不小心接觸過，要用無水乙醇擦拭。

③不要在儀器上方傾倒測試樣品，以免樣品污染儀器表面，損壞儀器。

④在可見光區進行測量時，要把氫燈或者氘燈關掉。

⑤在進行測試前，先打開儀器主機進行預熱后再進行測定。

⑥光電轉換元件不能長時間曝光，應避免強光照射或受潮積塵。

【任務操作】

任務一　鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵

【任務目標】

1.正確使用分光光度計，了解工作原理。

2.正確繪制吸收曲線及標準曲線。

3. 能夠利用鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵的含量。

【測定原理】

由朗伯-比爾定律A=KLc可知，在一定條件下，有色物質的吸光度A與該物質的濃度c成正比。繪制出以吸光度A為縱坐標、濃度c為橫坐標的標準工作曲線，測出待測液的吸光度，就可由標準曲線查得對應的濃度，此濃度即為待測樣品的含量。

鄰二氮菲分光光度法是化工產品中測定微量鐵的通用方法，在pH值為2～9的溶液中，鄰二氮菲和二價鐵離子結合生成紅色配合物：

此配合物的lgK穩=21.3，摩爾吸光系數ε510=1.1×104L·mol-1·cm-1，而Fe3+能與鄰二氮菲生成3∶1配合物，呈淡藍色，lgK穩=14.1。所以在加入顯色劑之前，應用鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）將Fe3+還原為Fe2+，其反應式如下：

2Fe3++2NH2OH·HCl2Fe2++N2+2H2O+4H++2Cl-

【儀器與試劑】

TU-1810型分光光度計、酸度計、50mL比色管、容量瓶、吸量管（1mL、2mL、5mL、10mL）、比色皿、洗耳球。

1×10-3mol·L-1鐵標準溶液、100μg·mL-1鐵標準溶液、10%鹽酸羥胺、1mol·L-1 NaAc、0.15%鄰二氮菲水溶液。

【任務操作步驟】

1.準備工作

打開儀器電源開關，預熱，調試儀器。

2.測量工作

（1）吸收曲線的繪制和測量波長的選擇

用吸量管吸取2.00mL 1.0×10-3mol·L-1鐵標準溶液，注入50mL比色管中，加入1mL 10%鹽酸羥胺溶液，搖勻；加入2mL 0.15%鄰二氮菲溶液；5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀釋至刻度。在分光光度計上以水為參比溶液，在440～580nm范圍內進行光譜掃描，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標、繪制吸收曲線。在紫外-可見分光光度法定量分析選擇測量的適宜波長時，一般選用最大吸收波長λmax為測定波長。

（2）顯色劑條件的選擇（顯色劑用量）

在6支比色管中，各加入2.00mL 1.0×10-3mol·L-1鐵標準溶液和1mL 10%鹽酸羥胺溶液，搖勻。分別加入0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL及4.00mL 0.15%鄰二氮菲溶液；5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計上用1cm比色皿，采用試劑空白為參比溶液，測吸光度。以鄰二氮菲體積為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制吸光度-顯色劑用量曲線，從而確定最佳顯色劑用量。

（3）溶液pH的確定

取8支50mL比色管，各加入2mL 1.00×10-3mol·L-1鐵標準溶液和1mL 10%的鹽酸羥胺溶液，搖勻。放置2min，加入2mL 0.15%鄰二氮菲，搖勻，分別加入0.00mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL 1mol·L-1的NaAc溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計上，在其他條件一定的前提下，分別測其吸光度。以鄰二氮菲體積為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制A-pH曲線，從而確定最佳顯色劑用量。

（4）顯色時間及有色溶液的穩定性

用吸量管吸取2mL 1.00×10-3mol·L-1鐵標準溶液于50mL比色管中，加入1mL 10%的鹽酸羥胺溶液，搖勻。再加入2mL 0.15%鄰二氮菲溶液，5mL 1mol·L-1 NaAc溶液，以水稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白為參比，靜置，每2min測一次吸光度。以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制A-t吸收曲線，選擇測量適宜的顯色時間。

（5）標準曲線的制作

在6個50mL的容量瓶中，用1mL吸量管分別加入0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL 100μg·mL-1鐵標準溶液，各加入1mL 10%鹽酸羥胺，搖勻。再加入2mL 0.15%的鄰二氮菲溶液和5mL 1mol·L-1NaAc溶液，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。放置一段時間。以試劑空白為參比，在選定的波長、適宜顯色劑用量、適宜顯色時間下測定各溶液的吸光度，繪制c-A標準曲線。

（6）試液含鐵量的測定

準確吸取適量試液（如工業鹽酸）代替標準溶液，其他步驟同上，平行三次測定其吸光度。記錄計算機顯示的含鐵量，計算試液中鐵的含量（以mg·L-1表示）。

【數據處理】

1.鄰二氮菲-Fe2+吸收曲線的繪制

①數據記錄。

②吸收曲線圖，由圖得出最大吸收波長λmax。

2.分析條件的選擇

①顯色劑用量。

②溶液pH。

③顯色時間。

3.工業鹽酸中鐵含量的測定（見表1-2和表1-3）

【注意事項】

1.各種試劑的加入順序。

2.測量條件選擇好后不要再改變。

【任務思考】

1.分光光度法測定微量鐵時為什么要選擇在pH=2～9？

2.參比溶液的作用是什么？

任務二　產品中苯甲酸含量的測定

【任務目標】

1.正確使用分光光度計，了解工作原理。

2.熟練繪制標準曲線，能進行樣品含量的測定。

【測定原理】

含有苯環和共軛雙鍵的有機化合物在紫外區有特征吸收，未知結構不同對紫外-可見光的吸收曲線不同。苯甲酸及其鹽對紫外線有選擇性吸收，最大吸收波長在225nm處左右。

【儀器與試劑】

TU-1810型紫外分光光度計、酸度計、50mL容量瓶、移液管、比色皿、洗耳球。

1mg·mL-1苯甲酸儲備液：稱取0.5g苯甲酸，加水溶解后用水稀釋至500mL，搖勻后備用。取此儲備液25.00mL于250mL容量瓶中，用水稀釋至250mL，搖勻后備用。此時標準溶液中苯甲酸含量為100μg·mL-1。

【任務操作步驟】

1.苯甲酸系列工作溶液的配制

在7支50mL的容量瓶中，分別加入0.00mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL、15.00mL、20.00mL的100μg·mL-1苯甲酸溶液，用水稀釋至刻度，搖勻備用。

2.苯甲酸吸收曲線的繪制

在分光光度計上，以水為參比溶液，用1cm的石英吸收池，在200～400nm波長范圍內測定并記錄10.0μg·mL-1苯甲酸工作溶液在不同波長下相應的吸光度A。以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制吸收曲線，并在曲線上找出最大吸收波長，用λmax表示。

3.苯甲酸標準曲線的繪制

在分光光度計上，用1cm的石英比色皿，在最大吸收波長處，測定系列標準溶液的吸光度，以苯甲酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準工作曲線。

4.未知樣品苯甲酸含量的測定

準確吸取未知樣品試液代替標準溶液，其他步驟同上，平行三次測定其吸光度，計算未知樣品試液中苯甲酸的含量（以μg·L-1表示）。

【數據處理】

1.苯甲酸吸收曲線的繪制

①數據記錄。

②吸收曲線圖，由圖得出最大吸收波長λmax。

2.產品中苯甲酸含量的測定（見表1-4和表1-5）

【任務思考】

1.本實驗可否選用玻璃比色皿進行測定？為什么？

2.如果樣品的吸光度在標準溶液最大吸光度之外，能否將標準曲線外延求得樣品的含量？

任務三　棗果皮中總黃酮含量的測定

【任務目標】

1.掌握紫外-可見分光光度法的基本原理和定量分析方法。

2.了解紫外-可見分光光度計的構造及使用方法。

3.學會紫外-可見分光光度分析最佳條件的選擇。

【測定原理】

根據朗伯-比爾定律A=KLc，在一定條件下待測溶液的吸光度和溶液的濃度呈線性關系，據此可對棗果皮中總黃酮的含量進行定量分析。

【儀器與試劑】

棗果皮；蘆丁（上海晶純實業有限公司，純度>99%）；無水乙醇；甲醇；氫氧化鈉；亞硝酸鈉；硝酸鋁； TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BS210S電子分析天平（北京賽多利斯公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；TDL-5-A臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

【任務操作步驟】

①選取實驗（棗果皮中總黃酮含量的測定）。

②打開電腦主機和儀器電源。

③打開工作站軟件，進行自檢。

④參數設置。

⑤光譜掃描，試劑空白進行基線校正。

⑥根據光譜掃描結果，選擇適宜的測定波長。

⑦光度測定。

⑧選用試劑空白作為參比，進行調零。

⑨標準品及樣品吸光度的測定。

⑩數據處理（記錄濃度、吸光度、線性回歸方程及相關系數）。

實驗完畢，關閉儀器。

【任務提示】

在操作的過程中，應重點提示操作的步驟及儀器的使用，讓學生知道規范操作的標準。

【任務檢測】

①檢查操作是否規范。

②查看數據處理是否正確。

【任務報告】

學生能夠熟練操作儀器及學會數據的處理。

【任務評價】

①實訓前資料的收集。

②獨立操作及動手能力。

③實訓操作的規范性。

④實訓的紀律性。

⑤實訓報告。

【目標檢測】

一、名詞解釋

透過率，吸光度，摩爾吸光系數，百分吸光系數，吸收光譜

二、填空題

1.在吸收光譜分析技術中，常因波長范圍不同而選用不同材料制作的吸收池。可見光譜分析技術中選用____________吸收池，紫外光譜分析技術中選用____________吸收池。

2.紫外-可見分光光度計中，可見光區常用的光源為_______，可見光波長范圍為_______，紫外線區常用的光源為_______，紫外線波長范圍為_______。

3.紫外-可見分光光度計的類型很多，但其基本是由_______、_______、_______、_______、_______五部分組成。

4.當吸光度A=0時，透過率T為_______。

5.在紫外-可見吸收光譜分析技術中，進行含量測定時，吸光度的最適宜范圍是_______。

6.朗伯定律是說明在一定條件下，光的吸收與_______成正比，比爾定律說明在一定條件下，光的吸收與_______成正比，二者合為一體稱為朗伯-比爾定律。

三、計算題

1.已知Fe2+濃度為1.0mg·L-1的溶液，用鄰二氮菲在一定條件下顯色，用厚度為2cm的吸收池在510nm處測得吸光度為0.380，試計算其摩爾吸光系數。

2.為檢測某鋼廠生產的一批彈簧鋼中錳含量是否達標，現取鋼試樣1.00g溶解于酸中，將其中的錳氧化成KMnO4，準確配制成250mL溶液，測得其吸光度為1.00×10-3mol·L-1 KMnO4溶液吸光度的1.5倍，計算鋼中錳的質量分數。

3.稱取維生素C 0.05g溶于100mL的0.005mol·L-1硫酸溶液中，再準確量取此溶液2.00mL稀釋至100mL，取此溶液于1cm吸收池中，在245nm處測得A值為0.551，求試樣中維生素C的百分含量。