1.5　運輸過程

代謝物的研究和生產往往注意微生物的生長條件，如培養基、氧的供給和細胞的代謝調節而忽略膜運輸過程。如圖1-39所示，為了生長繁殖和合成產物，需要不斷從外界吸收養分和合成產物所需的前體等，同時分泌代謝產物，排泄代謝廢物。除了O2、CO2、NH3、水和乙醇外，分子進出細胞不是靠擴散而是借特殊的運輸系統透過細胞膜的。擴散是指溶質的移動并未與膜蛋白直接相互作用，其轉移速率與溶質濃度成正比。載體運輸涉及膜的蛋白質組分的參與，載體蛋白一些性質與酶動力學相似。所有細胞都需要從其周圍吸收養分來維持其生長。保持細胞的完整性也需不斷地除去某些代謝物或離子。特別在生物工藝上代謝產物的分泌至關重要。

生物膜是細胞或胞內細胞器的外衣，故它們是所有活細胞的重要組分，不僅起被動的屏障作用，且具有繁多的復雜功能。膜中的一些蛋白質起選擇性泵的作用，可用于嚴密控制離子與小分子進出細胞的活動，并且能形成質子濃度梯度，這對由氧化磷酸化產生ATP反應是必要的。膜中的受體能識別胞外的信號，并將其傳遞到細胞內。

許多細菌具有結構不同的內外兩層膜。在這兩層膜的間隙中的液體含有一些能將特定的溶質帶到內膜的運輸蛋白質，于是溶質便可以通過需ATP過程穿過內膜。線粒體的平滑外膜具有構成液體通道的蛋白質；溶質可以有選擇性地透過其卷繞的內膜，此內膜含有許多與膜結合的酶。細胞核也含有雙層膜，核中的成分通過膜中的孔同胞質溝通。內質網的單層膜是高度卷繞的。

質膜將活的細胞同環境隔離。在真核生物的細胞內還存在由膜包裹的細胞器，如細胞核、線粒體等。膜的選擇性屏障限制大部分溶質的自由進出，其疏水的膜夾心區域阻礙大多數的極性或帶電荷的分子通過。這些溶質的通行只能依靠稱之為載體、透酶或易位子（translocator）的運輸蛋白，總稱為運輸器（transporter）。它們通過胞內吞（endocytosis）與胞外泌作用運輸極性溶質和離子。載體是一種可移動的蛋白質，在某一時刻，將其一個或以上的基質結合位點暴露在膜的一側或另一側，但不會同時面向兩側。

Escalante等［35］對細胞中的溶質運輸曾做過一篇系統、精辟的論述。對微生物基因組的分析表明，其中約有10％的編碼蛋白的基因參與運輸任務［36］。這些運輸系統也參與脂質、糖與蛋白質的分泌。它們可以在生物之間傳輸核酸，為微生物的多樣性做出貢獻。運輸器還能起各種信號分子，如警戒素（alarmone）和激素的傳遞作用。

在細胞內溶質的運輸與代謝是緊密關聯的。細菌的遺傳組織常反映出這些功能性偶合，即編碼運輸與代謝活性的基因聚合成基因簇。這種聚合作用常見于編碼碳源分解代謝的操縱子中［37］。運輸與調節系統能讓細菌細胞從培養基中選擇那些可以提供其最快生長的養分［38］。編碼獨特的用于運輸特殊化合物的運輸器的表達可以讓細胞根據其自身生理狀態與環境條件來選擇其運輸系統［39］。

改良運輸系統也是高產菌種選育的方向之一。這方面的改進可以改善細胞的生產性能：①擴大碳源的利用范圍［40］；②改善代謝前體的利用率，如莽草酸途徑的中間體［41］，TCA循環的中間體［42］，發酵產物乙醇［43］；③提高糖混合物的利用效率［44］；④控制溢流（overflow）代謝，從而減少乙酸的生成［45］。

1.5.1　細胞膜的結構與功能

細胞膜，又叫（胞）質膜、原生質膜，是使細胞成形、將原生質與環境隔離的一層薄膜。此膜一旦破裂，原生質泄漏，菌便死亡。膜的結構一般由磷脂雙層組成，含疏水脂肪酸與親水磷酸甘油成分。磷脂在水中能自發聚合排成兩行，形成所謂脂質雙層（lipid bilayer）。此磷脂分子行列中的脂肪酸端朝里形成疏水環境，而親水部分朝外，一側面向胞外，另一側面向胞內原生質。質膜的整個結構靠氫鍵與疏水性的相互作用維持穩定。借離子與磷脂的負電荷的相互作用，鎂離子與鈣離子也起穩定質膜的作用。圖1-40顯示革蘭氏陽性與陰性菌的脂膜結構模型［46～48］。

典型的細胞膜含有約200種不同的蛋白質，約占質膜重量的3/4。膜中的蛋白質分子排列方式各異。有些蛋白質完全包埋在膜內，因而稱膜內或跨膜蛋白。只有在脂質雙層瓦解后才能把它們分離出來。其中有的蛋白質具有通道，可讓溶質進出胞內。其他一些嵌在膜內/外表面上的蛋白質，有些是酶，相當于固定化于質膜內表面，有的蛋白質起膜形態變化過程中的傳遞質（mediators）作用。有些膜表面上具有蛋白脂質尾巴，這些蛋白質被稱為脂蛋白，能直接同胞內蛋白質相互作用，參與能量代謝等重要的細胞過程。在質膜的外膜上有許多蛋白質和脂質附著一些碳水化合物，分別稱為糖蛋白和糖脂。這些結構有助于保護細胞和參與細胞之間的相互作用。

細胞膜最重要的功能是作為一種屏障，有選擇性地讓溶質進出細胞。（細）胞質，也叫原生質，是含有各種生物大分子（如蛋白質、核酸）和糖、氨基酸、維生素、輔酶、鹽類等溶質的水溶液。質膜內側的疏水性質構成一層具有選擇性滲透的嚴格的擴散屏障，有選擇地允許某些分子與離子通過。有些較小的分子，如水、氧、CO2和簡單的糖通常可借擴散自由通過。對那些易溶于脂質中的分子，如氧、CO2和非極性有機分子也可以通過。相反，親水的分子和帶電荷的小分子，如H+，是不能通過質膜的，除非用特定的方法。水分子能自由透過質膜，借一種稱為水孔蛋白（aquaporin）的特殊運輸蛋白，水還能加速通過質膜。大多數親水溶質透過膜是靠運輸器做到的。

1.5.2　運輸器的分類系統

根據系統發育與功能分析數據進行的運輸器分類（TC）系統［49］曾獲得國際生物化學與生物分子學聯盟的認可，見表1-18。溶質運輸器的系統分類是根據運輸的模式、能量偶合方式和分子的種系生源學制定的。采用5個數字的TC系統來給每一種運輸器命名。第一個數字表示類別、運輸模式和能量偶合機制；第二個數字表示亞類，指運輸器的類型和能量偶合機制；第三個數字屬于總科或科；第四個數字表示總科下面的種系生源簇；最后一個數字是指運輸的基質和運輸的極性。例如半乳糖：H+同向轉運器（symporter）類型，大腸桿菌（GalP）的TC系統編號是2.A.1.1.1。此符號說明：2是電化學勢能驅動的運輸器類；2.A是運輸器亞類；2.A.1是主要易化運輸總科；2.A.1.1是糖運輸器科；2.A.1.1.1是指GalP.TC系統分類可以上網（http：/www.tcdb.org）從TCDB數據庫中查到［50］。

注：分類6和7的空缺是為未來新發現運輸器類型預留的類別。

1.5.3　運輸機制

Escalante［35］將溶質運輸器的運行機制分成：①通道與孔中進行的被動擴散；②載體介入的溶質-H+同向轉移；③載體介入的溶質-H+同向轉移并帶有外界溶質識別受體；④初級主動吸收ABC運輸器，由ATP水解驅動；⑤PEP:糖磷酸轉移酶系統（PST）的基團轉移透酶。圖1-41顯示各種運輸的模式。

Kraemer等［51］將溶質運輸系統分為：①簡單擴散；②初級運輸過程，其化學反應與向量溶質移動直接有關；③次級運輸過程，其載體將溶質移動和其他物質的移動偶合在一起。次級運輸又可再分為單向轉移（uniport）、同向轉移（symport）和逆向轉移（antiport）。單向轉移只是參與溶質的電化學平衡，而同向轉移和逆向轉移借與相同或相反方向的離子流偶合能催化基質的“上山”或“下山”運動。表1-19舉例說明載體機制的分類。第一類是呼吸和光合作用質子移位機制。另外一些細菌，如Vibrio alginolyticus用這些系統來偶合Na+，而不是H+。鹵細菌的H+和Na+的運輸系統中H+的轉移是與光吸收直接偶合的。第二類是異型的，其初級運輸系統與ATP水解偶合。ATP的水解是由ATPase催化的，但這里用到的ATPase通常用于運輸或ATP的合成，而不是用于ATP的水解。它們主要用于單價和兩價陽離子（H+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+）的轉移，將ATP的自由能轉化為溶質的電化學梯度。

ATPase又可細分為三類不同的系統：①F-型ATPase（F1F0-ATPase）是涉及主要能量轉換的多組分系統，如在真細菌、線粒體和葉綠素中與呼吸和光合作用偶合的H+和Na+的移動。②P-型ATPase（如真核生物Na+/K+-ATPase）常見于質膜中，只含有一個或兩個亞單位。它們利用高能磷酸化中間體，通常用于K+、Na+和Ca2+的轉移。③V-型ATPase存在于真核生物空泡膜中，與弧形細菌（Archaebacteria）來的ATPase非常相似。借氧化磷酸化或光合磷酸化產生能量的細胞通常用F-型ATPase產生ATP，用P-型和V-型ATPase消耗它。

第三類初級運輸系統也直接與ATP的水解偶合，是細菌中依賴結合蛋白的運輸系統，見圖1-42。這些系統存在于革蘭氏陽性細菌。它是由外膜孔徑通道、結合蛋白、內膜膜蛋白和外圍蛋白組成，它們負責溶質的轉移并消耗ATP。有許多基質，如氨基酸、肽、單糖和雙糖、核苷酸、輔酶、無機離子（如硫酸鹽或磷酸鹽）等均用此系統運輸。

現按Escalante的膜運輸機制分類作扼要介紹。

1.5.3.1　通道與孔

通道與孔是最簡單的溶質通過易化擴散輸送模式運輸。通道的概念是指膜上的一種固定結構，充滿水的通道，分子可從兩個方向進出。圖1-43解釋了載體和通道運輸的若干假設。一般載體是不會移動的，但它們可能含有通道。此通道設有閘門，否則分子自由進出會使所有跨膜梯度不起作用。纈氨霉素、短桿菌肽便是各種離子通道的經典“載體”。

易化擴散不與代謝能偶合，因而不能形成跨膜的溶質（輸送對象）梯度。溶質靠受限制的擴散方式從膜的這一端經通道或孔道運輸到另一端。在這些通道中含有能識別親水、疏水與兩親性基質的組成型蛋白的氨酰殘基。有一種稱為孔蛋白的通道型蛋白參與溶質的被動轉移，能讓糖、氨基酸和簡單的離子穿過外層質膜。大腸桿菌含有多到105拷貝的孔蛋白，如OmpF、OmpC或PhoE，形成反向平行β-折疊的屏障，含有相同亞單位的三聚體復合物，約有35kDa，1nm的直徑，允許大到600Da的分子通過。

此類通道運輸系統又分為：①α-型通道蛋白，存在于細菌和真核生物中；②β-桶型孔蛋白，存在于革蘭氏陰性細菌、線粒體和質粒的外膜中；③形成一種含有兩親性螺旋結構的穿孔性蛋白（蛋白質與肽），這些蛋白質所形成的孔道允許電解質和小分子透過對象的膜或允許毒蛋白進入對象細胞原生質內，從而殺死或控制該細胞；④非核糖體合成的通道，這是一種寡聚體膜轉移通道，由L-與D-氨基酸鏈或小分子羥乳酸或β-羥丁酸聚合物組裝成孔道結構，是細菌或真菌用于制敵的生物武器。表1-20顯示由擴散控制和載體介入的穿過細菌質膜的物流數據。

1.5.3.2　電化勢能驅動的運輸器（次級運輸過程）

微生物可用化學、光或電能來把溶質運輸到細胞內。有些運輸是由電化勢能，如質子與鈉離子梯度驅動的。溶質濃度梯度驅動的易化擴散是不需要消耗ATP的，可以允許溶質逆濃度梯度透過膜，這類運輸被稱為次級運輸，可以單向、同向和逆向方式運輸（見圖1-41）。這類運輸器相當簡單，通常由單個帶有幾個圈孔的跨膜蛋白組成。次級運輸系統是一種小型的單一亞單位載體蛋白，其共同特點是跨膜的蛋白質均為12α-螺旋，其分子質量45～50kDa。原則上它們只催化易化運輸，但由于其固有結構，它可將不同離子的流動偶合在一起，如圖1-44所示的單向、同向和逆向轉移。對同向或逆向運輸，兩種被運輸的離子的自由能是相等的。因此，溶質的平衡濃度梯度［S］in/［S］ex取決于偶合離子的電化學梯度。溶質的同向轉移系統廣泛分布于細菌與真核生物中。大多數氨基酸的吸收采用與H+或Na+同向運輸的方式。

ΔGcoupling ion=ΔGsolute

逆向轉移系統的典型例子是細菌中的前體/產物逆向轉移，它參與各自代謝途徑的基質與相關產物的交換（例如丙-乳酸發酵中的蘋果酸和乳酸），以及線粒體中的核苷酸、無機離子、羧酸和氨基酸的交換載體。單向轉移通常存在于真核生物中，如在各種細胞中的葡萄糖運輸，但在細菌中少見。典型的系統是運動發酵單胞菌的葡萄糖載體和大腸桿菌中的甘油運輸系統。革蘭氏陰性細菌的外膜中的“孔隙”蛋白（起過篩孔的作用）并不完全屬于這一類。孔隙蛋白應劃分到“通道”型蛋白中。

顯然，以上只討論了吸收運輸系統，并不是代謝物的分泌不重要。但有關分泌系統的資料較少。用于溶質吸收的機制原則上也適用于分泌。疏水性代謝終產物，如醇類（乙醇、丁醇）、丙酮和若干有機酸（非解離型）可以采用簡單擴散方法排出細胞外。越來越多的證據說明，許多代謝產物，如谷氨酸或賴氨酸等氨基酸，實際上是由載體參與的系統分泌的。

有些分泌系統采用離子/溶質同向轉移方式。大腸桿菌和乳酸乳球菌在葡萄糖發酵中生成的乳酸的分泌是與質子以同向轉移方式分泌的，這導致質子擴散電位的形成。若干抗生素，如四環素的分泌則運用逆向轉移，以質子交換方式分泌的。前體/產物逆向轉移系統也是屬于這一類的。近來發現越來越多的分泌系統與ATP直接偶合。例如，有毒的重金屬離子的排泄是由所謂“輸出ATPase”（這屬于P-型ATPase）參與的。在真核生物中發現的載體系統（MDR，多重抗藥性蛋白）和原核生物中的載體系統顯示出結合蛋白依賴系統的能量偶合亞單位的序列相似性。由于ATP-結合位點的共同序列基本結構，這類ATPase運輸機制稱為ABC-簇（ATP-結合匣）。

（1）運輸蛋白　有些糖、氨基酸、核酸與小分子，如鈉離子是通過單向運輸蛋白運輸的，溶質是從較高濃度的一端向較低的一端轉移透過膜的。其機制是溶質與單向運輸蛋白之間的相互作用導致后者構象適應性改變，從而讓溶質穿過質膜，這就是單向轉移。另一些糖、氨基酸、離子（如硫酸鹽、磷酸鹽）是利用質子的驅動力使溶質逆濃度梯度透過膜，即進行同向轉移。逆向轉移是指質子被輸入胞內，由此產生的勢能，使溶質，如Na+逆濃度梯度同時排出胞外。

（2）非核糖體合成的運輸蛋白　這些跨膜運輸蛋白是肽類或小分子聚合物。這些像陽離子的復合溶質，能讓此內部親水、外部疏水的復合物移位，從一側穿過脂質雙層膜到另一側。若運輸器是非復合形式，溶質的跨膜運輸是電泳式的。

（3）離子驅動的催滲劑　這是一簇像TonB那樣的輔助蛋白，利用外膜接收器它們能履行主動運輸，經活化后這些輔助蛋白能逆高濃度梯度將溶質聚集于周質內。活化是通過質子或鈉離子流（即質子動力）來激活外膜接收器或孔蛋白。接收器構象的改變可讓質子進行電泳式運輸。

1.5.3.3　初級主動運輸器

這些運輸系統利用原始能源來驅動溶質逆濃度梯度進行主動運輸。已知的能偶合到運輸系統中的原始能源有化學能、電能和光能。在細菌中初級運輸系統的種類繁多。

按驅動勢能初級運輸器又可分為：①雙磷酸鍵水解驅動的運輸器，這些運輸系統借ATP等核苷三磷酸的水解來驅動溶質的吸收或排泄。②脫羧驅動的運輸器，這類運輸系統是通過胞內基質的脫羧反應驅動離子的吸收與排泄工作的，如運輸Na+的羧酸脫羧（NaT-DC）系統催化草酰乙酸、甲基丙二酰CoA、戊烯二酰CoA和丙二酸脫羧，釋放出的能量用于驅動Na+的排泄。這些運輸器的亞單位是生物素。③甲基轉移驅動的運輸器，如運輸Na+的甲基四氫甲烷蛋白：輔酶M甲基轉移酶（NaTMMM）。④氧化還原反應驅動的運輸器，質子或離子的輸送由還原性基質氧化產生的放熱的電子流驅動。這些運輸器存在于細菌、真核生物的線粒體和細胞色素中。⑤光吸收驅動的運輸器，這類運輸器由光驅動離子移位透過質膜，或當作光接收器，如3.E.1轉移離子的微生物紫膜質和3.E.2光合反應中心（PRC）簇。

不同的系統用于不同的目的，它取決于基質的可利用性。按其分子結構的差異，初級運輸系統具有高的基質親和力，其本質是單向性的，故積累比例很高。次級系統通常是可逆的，故在低基質濃度或低能量下此系統可能導致運輸基質的泄漏。

1.5.3.4　基團轉運蛋白

基團轉移系統與初級運輸系統很相近。溶質在此系統轉移透過膜的過程中被磷酸化。故進入胞內的溶質的化學結構與外面的不同。真細菌中的依賴磷酸烯醇式丙酮酸的糖運輸系統（PTS）便是典型的例子，見圖1-45。PTS主要用于己糖、糖醇和β-糖苷的運輸。

磷酸轉移驅動的基團轉運蛋白，如PEP：糖PTS［見圖1-41（e）］存在于細菌中。PTS運輸機制涉及一些糖的運輸與磷酸化。其反應產物是糖磷酸酯，隨后進入分解代謝途徑。此系統由可溶性和非糖專一性蛋白組分酶Ⅰ（EⅠ）與耐熱的或磷酸組氨酸載體蛋白（HPr）組成。PTS機制的第一步是由在組氨酸殘基上的EⅠ的PEP進行自磷酸化反應。第二步是EⅠ將磷酸基轉移給HPr中的組氨酸殘基。然后，HPr將磷酰基轉移給酶ⅡA和酶ⅡB（這些酶屬于PTS復合體的糖專一的部分），最后轉移給ⅡC或ⅡD。這些膜內在蛋白能識別和輸送經組分ⅡB磷酸化的糖分子，見圖1-46。各種微生物的PTS所含的酶Ⅱ組分不一樣，每一種酶通常對單一糖基質是特異的。如大腸桿菌含有26種其主要成分不同的酶Ⅱ復合體。圖1-46顯示大腸桿菌的麥芽糖/葡萄糖PTS復合體缺少ⅡA部分區域。這或許是葡萄糖復合酶（ⅡAGlc）的ⅡA蛋白與ⅡBMal區域的磷酸化作用有關。從細菌基因組的研究發現，不同微生物的PTS組分有很大的差異。PTS蛋白很可能具有調節作用［52］。

由PTS催化的需PEP的磷酸化作用導致糖的運輸同其隨后的代謝緊密地聯系，見圖1-47。PEP在EMP途徑與PTS間聯絡上起重要作用，是一些生物合成途徑的前體，直接參與產能反應。例如，ADP的基質水平的磷酸化或間接作為乙酰CoA的前體。代謝流分析揭示，當大腸桿菌生長在以葡萄糖為碳源的最低培養基中時PTS消耗50％可利用的PEP，而用于合成草酰乙酸、丙酮酸、細胞壁組分和芳香化合物時前三種大致消耗15％，最后一種3％［53］。由此可見，PTS主要影響PEP/丙酮酸的比值和從這兩處節點的碳流分布。可預料，對PTS組分的修飾或消除將會顯著影響中樞代謝。據此，已作為一種策略，用于改進工業菌種的生產性能。在缺失PTS活性的菌種中，無需PEP的攝取及磷酸化活性的表達，可以顯著改進一些代謝產物的產率與得率［54］。

大腸桿菌的ⅡAGlc蛋白在碳分解代謝物阻遏上起主要作用。當培養基中含有葡萄糖時EⅠ、HPr與ⅡAGlc以非磷酸化的狀態存在，因PEP的磷酸基經ⅡBCGlc被轉移給葡萄糖。在這種情況下，ⅡAGlc與一些非PTS透酶結合，抑制非PTS糖的吸收［圖1-48（a）］。去磷酸化的ⅡAGlc也能與甘油激酶（GK）結合，抑制其活性。蛋白EⅠ與Hpr也具有調節作用，并受磷酸化作用的控制。去磷酸化的EⅠ能結合具有趨化性的蛋白CheA，抑制其自磷酸化活性。若被去磷酸化，Hpr能激活糖原磷酸化酶（GP）［55］。

蛋白ⅡBCGlc具有調節PTS的作用，因而在CCR中起間接作用。此蛋白與轉錄阻遏物Mlc互相作用，從而調節ptsHI、ptsG、mlc、manXYZ和malT等基因。在此條件下，葡萄糖的存在引起ⅡBGlc的去磷酸化；它與Mlc結合，從而解除其阻遏作用。此響應的凈效應是增加PTS酶和那些參與葡萄糖、甘露糖、麥芽糖運輸的酶的表達［56］。若培養基中不含葡萄糖，ⅡAGlc和ⅡBGlc將會以其磷酸化的形式存在［圖1-48（b）］。這樣，ⅡAGlc～P結合到腺苷酸環化酶（AC）上激活其cAMP的生物合成能力。因此，cAMP在胞內增加，與cAMP受體蛋白結合，誘導分解代謝物阻遏基因［57］。即使沒有ⅡAGlc～P激活作用也存在低濃度的AC。因此，當細胞生長在含葡萄糖的培養基時會出現低濃度的cAMP。在缺乏葡萄糖的情況下ⅡBGlc～P失去其結合Mlc的能力，故此調節蛋白易于結合到其目標操縱基因上，導致參與葡萄糖吸收的基因的阻遏。當Hpr被磷酸化時它結合到BglG上并將其激活，BglG是編碼β-糖苷類糖吸收與利用的蛋白的bgl操縱子的轉錄激活劑。

PTS是復雜調節網絡的組成部分。此網絡涉及細胞對碳源的選擇、運輸與代謝的調整功能。因此，對PTS組分的直接修飾會廣泛影響細胞的生理。由于碳分解代謝物阻遏，生長在含有混合糖的培養基中的大腸桿菌能順序利用各種糖。同時利用各種糖會有利于發酵生產過程，因這能避開二次生長，減少運轉時間，增加產率。對大腸桿菌的葡萄糖PTS組分的修飾會解除CCR作用。曾將此策略應用于在含有混合糖（葡萄糖、阿拉伯糖、木糖）中的乙醇和乳酸的生產菌種的改良上［44，58］。相信此策略也可以改進其他含有PTS的細菌的生產性能。

1.5.3.5　跨膜電子流系統

此系統是指電子從膜一側的給體，經催化穿過膜流向另一側的受體。此系統能提高或降低膜的勢能，這取決于電子的流向，是細胞熱力學的重要元素。根據TCDB，這類系統又可分為兩個亞類：①跨膜雙電子載體；②跨膜單電子載體，詳見文獻［35］。

1.5.3.6　大分子的運輸

大分子的運輸對細胞同樣重要。其機制繁多，包括蛋白質、復合脂質以及核酸的運輸。至少有三種不同的系統來解釋蛋白質轉移的機制：①蛋白質分泌到真核生物的內質網的腔內；②蛋白質輸入到真核生物的細胞器（如線粒體和葉綠體）內；③細菌中的蛋白質輸出。圖1-49顯示大腸桿菌中分泌性蛋白的合成和分泌期間的反應順序。在多肽的N端合成附加序列（引導序列）是進入膜中被輸出機器識別的主要信號。胞液蛋白因子（chaperone）的存在保證多肽維持一種松弛折疊和勝任運輸的構型。分泌蛋白是質膜中的復合機構，它是由固有的膜組分（通道）和能量偶合單位（ATPase）組成。在胞外由一種特殊的蛋白酶（引導肽酶）將引導序列切除，蛋白質再折疊如初，有時需借助附加的輔因子。對革蘭氏陰性細菌需用到第二個運輸步驟來穿過這些生物的外膜。

1.5.4　運輸過程動力學

膜內含有蛋白質的溶質運輸系統可被看作是膜結合蛋白。每一種蛋白質對特定的基質的親和力與特異性不一樣。常見對一種溶質可以有多種具有不同親和力與特異性的運輸器，用于驅動溶質運輸的能量偶合機制也各異。有些描述運輸過程的模型有助于了解其分子輸送的基本過程［59］。按Escalante［35］運輸器的功能可分成三步：溶質的結合、移位和釋放。移位步驟有可能涉及運輸蛋白的構象改變。擴散在溶質透過脂質雙層膜上起重要作用。此過程可在有或無特殊蛋白運輸器下進行。借溶質運輸速率的測量可以辨別這兩者。對不需運輸器的過程，隨溶質濃度增加，擴散速率也呈線性增加，見圖1-50。相反，需運輸器的溶質輸送會出現運輸速率的高峰。此現象說明，溶質濃度高到一定的程度時運輸蛋白結合位點被飽和了。

常用動力學來揭示載體系統在運輸中的作用。運輸動力學與酶動力學相似之處有：①飽和動力學；②基質特異性；③受特殊試劑的抑制；④逆流動力學的存在。當胞外溶質濃度［Sx］0大于胞內濃度［Sx］1時便會有凈Sx進入細胞內。Sx的物流JSx，用（mol/cm2）/s表示。膜脂質對溶質的溶解度（Sx的脂質-水分配系數）與擴散系數越高，膜的厚度越薄，透過膜屏障的物流也越大。由此三項因素構成的參數稱為溶質滲透系數PSx。JSx可用Fick方程表達：

JSx=PSx（［Sx］0-［Sx］1）　　（1-36）

凈擴散只出現在從具有高濃度的間室到低濃度的間室中，一般這種擴散是非特異性的。下面的公式可以用來計算溶質的電化勢能（ΔμSx）對物流的影響，此參數整合了跨膜的濃度與電壓梯度。

ΔμSx=RTln（［Sx］1/［Sx］0）+zxF（Ψ1-Ψ0）　　（1-37）

式中，zx是溶質的電荷；T是熱力學溫度；R是氣體常數；F是法拉第常數；（Ψ1-Ψ0）是跨膜的電位差Vm。

公式（1-37）右側前半項用于描述溶質跨膜時的化能變化；后半項描述1mol帶電顆粒跨過膜時的電能變化。

按定義，當時，跨膜兩側的Sx處于平衡狀態。若，其數值表示使溶質跨膜移動的凈驅動力。

方程（1-37）可能出現兩種情況：此方程的化學或電位項為零，在第一例中，溶質，如葡萄糖未帶電荷（zx=0），則只有在膜兩側的［Sx］相等時此式才達到平衡；另一種情況是溶質是帶電荷的，如Na+，則電位差，Vs為零，同樣，只有在膜兩側的［Sx］相等時此式才達到平衡。在第二例中，式（1-37）的化學或電位項均為零；當這兩項相等時便達到平衡，只是符號相反。此關系式便是Nernst方程，從式（1-37）得：

　　 （1-38） 　　

因此，能斯特方程用于描述跨膜兩側離子相等的情況。若［Sx］1和［Sx］0為已知，只有在跨膜的電位差等于平衡電位，又稱Nernst電位時，［Sx］才會平衡［60］。如同酶動力學研究那樣對試驗數據進行數學與圖形分析，如用米-孟模型，將基質濃度對速度作曲線，見圖1-51和式（1-39）。

v=vmax［Sx］/（Km+［Sx］）　　（1-39）

式中，Km值隨運輸器、溶質的不同而變化。Km被定義為運輸反應最大速率一半所需溶質的濃度。換句話說，Km代表在穩態下運輸器的一半被溶質所占據。因此，Km常數可被看作是基質親和力的相對度量。

在測量由一可逆的載體（大多數為次級運輸載體）催化的膜兩側溶質的凈轉移時必須考慮到溶質的移位是雙向的。在運用試驗數據進行作圖分析時需注意兩點：①在解釋米-孟動力學上必須謹慎，因在這類分析中易忽視多向運輸的存在；②在分析分泌系統時應考慮到擴散成分的存在，它隨溶質的類型而有所不同，見圖1-50。

如已知一運輸蛋白在催化循環中的各個步驟，可用圖1-52的模型來解釋這類動力學。這類模型對了解載體機制是非常有用的，雖然它們是基于運輸的“載體概念”，載體（C）的移動只是一種形式。說明在這些模型中載體（C）的構型在運輸催化期間是變化的。在進行詳細的動力學分析時需考慮一整套催化循環中的不同結合與解離以及易位步驟，并用試驗來鑒別。