實驗二　動物組織DNA的提取

實驗目的

（1）了解真核生物DNA提取的一般原理和方法。

（2）通過動物組織DNA的提取，掌握DNA提取的方法和步驟。

實驗原理

真核生物的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質結合形成核蛋白。因此，制備真核DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。

RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同濃度氯化鈉溶液中的溶解度有顯著區別。DNA核蛋白在0.14mol/L氯化鈉中溶解度低，但在1～2mol/L氯化鈉中溶解度高；RNA核蛋白在0.14mol/L氯化鈉中仍有相當大的溶解度，所以調節氯化鈉濃度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取。

提取DNA的一般過程是將分散好的組織在SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。其中，苯酚的作用是使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA連接鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相；氯仿可加速有機相與液相分層，最后用氯仿抽提去除核酸溶液中的酚（酚易溶于氯仿中）；異戊醇有助于消除抽提過程中產生的氣泡，同時，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含有DNA的水相、中間的變性蛋白質相及下層的有機溶劑相維持穩定。

試劑與儀器

1.試劑與溶液

（1）組織或細胞裂解緩沖液

（2）蛋白酶K　稱取20mg蛋白酶K溶解于1mL滅菌的雙蒸水中，-20℃保存備用。

（3）TE緩沖液（pH8.0）　高壓滅菌，室溫保存。

（4）酚:氯仿:異戊醇=25:24:1。

（5）異丙醇、冷無水乙醇、70％乙醇、滅菌水、7.5mol/L乙酸氨。

2.儀器與設備

恒溫水浴鍋、臺式離心機、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）、吸水紙、冰箱。

實驗步驟

（1）取新鮮或冰凍動物組織塊（如異育銀鯽肝臟或肌肉）0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1mL的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5mL離心管中，加入蛋白酶K（500μg/mL）20μL，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min（也可轉入37℃水浴12～24h），期間間歇振蕩離心管數次，12000r/min離心5min，取上清液轉入另一離心管中。

（2）加2倍體積異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100μL吸頭挑出，晾干，用200μL TE緩沖液重新溶解（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）。

（3）加等量的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）振蕩混勻，12000r/min離心5min。

（4）取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），振蕩混勻，12000r/min離心5min。

（5）取上層溶液至另一離心管中，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸銨（中和DNA表面的電荷，促進沉淀）和2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min，12000r/min離心10min。

（6）小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

（7）用1mL 70％乙醇洗滌沉淀物1次，12000r/min離心5min。

（8）小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

（9）加200μL TE緩沖液重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存備用。

思考題

（1）整個DNA提取過程中應該注意什么？

（2）列出DNA提取過程中所需的試劑及溶液，并說明各試劑或溶液的作用。