第二章　生物科技實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一　CTAB法提取植物DNA

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（1）掌握CTAB法提取植物DNA的原理和方法。

（2）采用CTAB法從植物葉片中提取DNA。

實(shí)驗(yàn)原理

CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromid，十六烷基三甲基溴化銨）法是提取植物DNA的經(jīng)典方法。CTAB是一種陽離子去污劑，可以溶解細(xì)胞膜，將膜內(nèi)核蛋白釋放；同時(shí)，CTAB具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：①化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.0～11.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會(huì)使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸、過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。③酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來，它會(huì)降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫（0℃左右）下進(jìn)行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鈉鹽（ETDA-Na2）等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可使核酸酶被破壞而失活。

注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。

試劑與儀器

1.試劑與溶液

（1）2×CTAB提取緩沖液

2×CTAB提取緩沖液中各試劑的作用如下。

①Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。

②EDTA可以螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNase活性。

③NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNA核蛋白充分溶解。

④CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離。

⑤β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。

（2）TE緩沖液　10mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），1mmol/L EDTA，高壓滅菌，室溫保存。

（3）氯仿-異戊醇（24:1）。

（4）液氮。

（5）70％乙醇和無水乙醇、雙蒸水。

2.儀器設(shè)備

研缽、恒溫水浴鍋、冷凍離心機(jī)、移液器、移液管、1.5mL離心管、冰箱、培養(yǎng)箱。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）取兩片幼嫩新鮮葉片，70％乙醇清洗，雙蒸水沖洗干凈后，置于預(yù)冷的研缽中，倒入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，隨后加入3mL預(yù)熱的含有β-巰基乙醇的2×CTAB提取緩沖液，繼續(xù)研磨成略有流動(dòng)性的糊狀或粥狀，轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管中，于65℃水浴鍋中保溫約60min（期間定時(shí)上下翻轉(zhuǎn)5～10次）。

（2）待混合物冷卻至室溫后加入等600μL的氯仿-異戊醇溶液混勻，輕輕顛倒離心管幾次，使管內(nèi)混合物成乳濁液，常溫下10000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的離心管中。

（3）重復(fù)步驟（2）一次。

（4）取步驟（3）上清液加入2.5倍體積無水乙醇，仔細(xì)混勻，-20℃冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃ 12000r/min離心10min。

（5）棄去上層有機(jī)溶劑，加500μL 70％乙醇洗滌沉淀，4℃ 8000r/min離心5min，棄去上清液，洗滌沉淀3次。

（6）倒置或者37℃培養(yǎng)箱烘干。

（7）加50μL TE緩沖液溶解DNA，于-20℃冷藏備用。

思考題

在DNA提取過程中為什么動(dòng)作要輕柔？