1.4.4　基因編輯

基因編輯技術（gene editing technology）又稱為基因組編輯（genome editing），是一種以特異性改變遺傳物質靶向序列為目標基因，通過刪除、替換、插入等操作，獲得新的功能或表型，甚至創造新的物種。

從最初的基因打靶技術到鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、類轉錄激活因子效應核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）以及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9系統，再到以堿基編輯技術為代表的新興技術的出現，基因編輯技術經過不斷的發展和完善，變得更加靈活、高效。基因編輯技術的發展和應用在農業育種和作物改良以及人類疾病的基因治療方面展現出巨大的潛力，開創了全球生命科學研究的新時代。

（1）ZFN。作為第一代基因編輯技術，ZFN使用同時包含DNA識別結合域（鋅指蛋白結構域）和DNA裂解域的核酸酶（限制性核酸內切酶FokⅠ的核酸酶切活性區域）形成的能夠產生位點特異性DSB的系統來執行基因編輯功能。ZFN由Chandrasegaran團隊于1996年提出。ZFN的α螺旋中的1、3、6位的氨基酸分別特異性地識別并結合DNA序列中的3個連續的堿基，這也使得鋅指核酸酶能定位于復雜基因組內的獨特的靶向序列。利用內源DNA修復機制，鋅指核酸酶可用于精確修飾高等生物的基因組。然而，ZFN的序列特異性也使得其具有目標識別率低、成本高等特點，限制了它的大范圍應用。

（2）TALEN。TALEN同樣使用同時包含DNA識別結合域和DNA裂解域的核酸酶。與ZFN不同的是，TALEN將TALE蛋白與FokⅠ內切酶區域加以結合。由于4種堿基都有各自對應的TALE模塊，因此TALEN可以通過目標序列的不同組裝不同的TALE識別模塊，加強了其設計的簡便性。但其目標識別率低、成本高、脫靶概率高、結構復雜等問題仍未得到解決。

（3）CRISPR/Cas9系統。學術界對于便捷、識別率高的基因編輯技術的渴望推動了新一代基因編輯技術的發展，CRISPR/Cas9系統源于細菌中的適應性免疫系統，可直接用于基因突變或基因敲除。CRISPR/Cas9的基本原理是利用向導 RNA介導 Cas 蛋白在特定的靶標序列處引起 dsDNA的斷裂，然后利用同源重組方法進行精準的 DNA序列替換或利用非同源末端連接方法進行靶標基因的中斷。CRISPR/Cas9系統通過CRISPR RNA（crRNA）和trans-activating crRNA（tracrRNA）以及Cas9蛋白組成的復合體抵御外源性DNA的入侵。Cas9是一種與sgRNA結合的核酸酶，通過sgRNA中存在的一個20 bp的核苷酸序列，將Cas9激活并靶向到一個特定的基因組位點（稱為原間隔子鄰近基序或PAM位點）。Cas9隨后催化一個靠近PAM位點的DSB，NHEJ修復低保真度的DSB將在酶切位點形成一個小的插入/刪除，從而在目標位點內進行突變。與ZFN和TALENs相比，CRISPR/Cas9系統具有操作簡單、成本低、編輯位點精確、脫靶率低等特點，其基因編輯效率超過30%，大大降低了基因編輯的時間成本和經濟成本。其在抗生素耐藥菌、COVID-19檢測、癌癥治療、高產水稻品種的生產等方面皆有大量的應用。

（4）堿基編輯器。單堿基編輯技術可以實現對單堿基的精準編輯，大大降低了編輯過程中對靶基因功能的影響。2016年，美國哈佛大學David Liu的實驗室使用專門設計的Cas9融合蛋白開發了一個單堿基編輯器，即胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）。2017年，David Liu還公布了其開發的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE），該編輯器通過使用腺嘌呤脫氨酶促進腺嘌呤（A）突變為鳥嘌呤（G）。當含有腺嘌呤脫氨酶的Cas9融合蛋白被sgRNA靶向到基因組DNA時，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤脫氨生成肌苷（I），肌苷被讀取并復制為鳥嘌呤殘基。因此，在DNA復制后，A-T堿基對直接取代了G-C堿基對。目前，單堿基編輯器已應用于基因編輯、基因治療、生成相關動物模型和功能基因篩選。

2020年，Dali Li團隊通過融合激活誘導的人胞嘧啶脫氨酶、腺嘌呤脫氨酶和nCas9，開發了一種新型的雙功能、高活性堿基編輯器，并將其命名為A&C-BEmax。A&C-BEmax可以有效地轉化同一等位基因內目標序列上的C > T和A > G，雙堿基編輯技術由此應運而生。同時，中國科學院遺傳學研究所的Caixia Gao和Jiayang Li在nCas9的N端融合了胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ABE7.10，并通過此種方法成功構建了4種新型的飽和靶向內源性基因突變編輯器（saturated targeted endogenous mutagenesis editor，STEME），依次將其命名為STEME-1～STEME-4。這些堿基編輯器具有在單一sgRNA的引導下誘導C > T和A > G靶位點同時突變的明顯優勢，還顯著提高了靶基因的飽和度和突變類型的多樣性。

單堿基編輯器只能催化單一堿基類型的轉換，限制了其廣泛的應用。使用雙堿基編輯技術可以同時有效地產生兩種不同的堿基突變，極大地豐富了堿基編輯的手段，使得基因編輯過程在不失精準性的條件下更加快捷。

（5）轉座子類編輯技術。一般來講，基因編輯技術依賴于DNA斷裂，這通常會導致錯誤被放置在鏈斷裂修復部位的DNA中，同時會觸發DNA損傷反應，從而導致其他不良的細胞反應。因此，研究人員試圖利用轉位現象，在不破壞目標位點的情況下插入所需的DNA序列，而不破壞細胞。轉座子可以整合到細菌基因組的特定位點，而不需要消化DNA。重要的是，整合酶插入DNA的位點完全由它們相關的CRISPR系統控制。采用轉座子類編輯技術，可以將任何DNA序列插入細菌基因組中的任何位置。對編輯后的細菌進行測序，在非目標位置沒有額外的拷貝的條件下，證實了整合可以實現精確的插入。2019年6月，張鋒的團隊從一種藍細菌——賀氏偽枝藻（Scytonema hofmanni）中獲得了與CRISPR效應蛋白Cas12k相關的轉座酶，并構建了名為CAST的系統，該系統將nCas9與單鏈DNA轉座子TNPA偶聯，然后檢測大腸桿菌基因組中的蛋白復合物，促進了外源DNA的位點特異性整合。