1.4.3　DNA組裝

DNA組裝（DNA assembly）是指通過特定技術實現DNA序列的“切”和“連”，其是合成生物學的基礎技術之一。在合成生物學和生物工程領域，遺傳元件無縫拼接以及重復DNA序列串聯，都需要用到高效的 DNA 組裝技術，只有這樣，才能滿足發展迅速的基因組設計合成領域的需求。

基于酶切連接策略的DNA組裝方法廣泛應用于迭代DNA組裝，主要有寡核苷酸組裝方法、BioBrick方法、Golden Gate方法、Gibson方法以及TPA方法。現有的DNA合成方法較為有限，無法直接準確合成長片段DNA。對此，我們可以采用分級的體外與體內組裝技術，將分段合成的寡核苷酸片段組配成長片段DNA，進而實現長片段基因甚至基因組的合成。

（1）寡核苷酸組裝方法。寡核苷酸組裝方法主要應用于長片段基因或基因組的合成。目前應用得較為廣泛的寡核苷酸組裝方法有連接酶組裝法（ligase chain reaction，LCR）和聚合酶組裝法（polymerase cycling assembly，PCA）兩種。LCR通過DNA連接酶將首尾相連、重疊雜交的5′磷酸化寡核苷酸片段連接成雙鏈DNA；PCA則利用DNA聚合酶延伸雜交的重疊寡核苷酸片段獲得不同長度的混合物，最后用引物擴增出成功組裝的基因全長片段。PCA具有良好的兼容性，也被應用于芯片合成的寡核苷酸組裝。

（2）BioBrick方法。雙鏈 DNA的拼接是依靠限制性內切酶產生的黏性末端來串聯DNA片段。基于這一方法發展而來的BioBrick技術由Knight研究組于2003年提出。該方法通過一對同尾酶和兩個非同尾酶將載體和DNA元件標準化并形成元件庫，隨后標準化的元件通過DNA連接酶作用根據順序依次組裝起來。基于作用位點的不同，BioBrick技術可以使用不同的同尾酶發揮不同的作用。雖然該方法實現了元件的標準化和DNA組裝的便捷化，但由于兩個DNA元件之間有6個堿基對的殘痕，元件組裝通量較低。之后出現的BglBrick方法和ePathBrick方法通過將殘痕轉化為融合蛋白的連接肽，成功解決了這個問題，推動了組裝技術的發展。

（3）Golden Gate方法。Golden Gate 方法采用IIS型限制性內切酶切割產生的黏性末端來實現組裝，由于IIS型限制性內切酶識別位點與切割位點有所不同，Golden Gate 技術可以自由地設計黏性末端，從而實現同時組裝多個DNA片段，大大提高了DNA組裝的效率。例如，Engler 等人用Golden Gate方法進行一步酶切連接，結合基因改組（gene shuffling）技術，一次性完成了3個片段與載體的拼接，構建了理論上可達19683種不同的重組胰蛋白酶原基因，得以篩選高效表達的胰蛋白酶突變體。

（4）Gibson方法。Gibson方法由Gibson于2009 年開發，是一種簡單、快速、高效的DNA定向無縫克隆技術，可將插入片段（PCR產物）定向克隆至任意載體的任意位點。Gibson方法的原理可以概括為三步反應：首先，T5核酸外切酶從DNA片段的5′端切割一條鏈，產生的單鏈DNA末端（overhang）兩兩配對，形成一個有間隙（gap）的環狀DNA；其次，Phusion DNA聚合酶通過DNA合成填補間隙，產生一個只有缺刻（nick）的環狀DNA；最后，Taq DNA連接酶通過形成磷酸二酯鍵修復缺刻，得到一個完整的雙鏈DNA或質粒。相比其他DNA組裝方法，Gibson方法連接利用的是片段間的長重疊區域，更特異性地確保了連接順序，同時做到了無縫拼接，使得組裝尺度擴大到了百kb級左右。

（5）TPA（Twin-Primer Assembly）方法。與上述幾種酶依賴性DNA組裝方法不同，TPA方法不需要酶的參與。TPA方法是由趙惠民團隊于2017年提出的一項雙引物非酶促DNA組裝的高效準確的多片段DNA組裝方法。其原理可分為兩步：首先，設計出長短、上下不同的4種引物，并利用聚合酶鏈式反應，分別對設計的片段進行擴增；其次，將得到的正確的擴增片段通過退火組裝成一個質粒，驗證正確后轉化到菌內即可。TPA方法在不使用酶的條件下，將聚合酶鏈式反應擴增的片段組裝成質粒，具有廣闊的應用前景。