2.1.2　實驗設計

質量分數2%的稻秸作為底物，共接種物質量分數為8%（VS）。不同瘤胃菌群（RM）和厭氧污泥（AS）比設為1∶1、1∶2、2∶1、1∶0和0∶1（基于VS比），分別表示為I1、I2、I3、I4和I5。I1、I2、I3屬于共接種體系，I4和I5分別屬于瘤胃對照和厭氧污泥對照。

體系中添加營養元素滿足微生物生長需要，包括NaCl（1.02g/L）、（NH₄）₂SO₄（0.26g/L）、CaCl₂·2H₂O（0.13g/L）、MgSO₄·7H₂O（0.20g/L）及體積分數為15%的無菌瘤胃上清液；添加強化產甲烷途徑的金屬輔因子，包括ZnSO₄·7H₂O（1.00mg/L）、CuSO₄·5H₂O（0.10mg/L）、FeSO₄·7H₂O（1.00mg/L）、NiSO₄·6H₂O（0.30mg/L）、CoCl₂·6H₂O（1.00mg/L）、NaMoO₄·2H₂O（0.10mg/L）、Na₂WO₄·2H₂O（0.20mg/L）。添加K₂HPO₄·3H₂O（1.34g/L）、KH₂PO₄（0.51g/L）和NaHCO₃（5.00g/L）組成緩沖體系，使初始pH維持在6.8～7.1之間。因為接種物沒有經過脫氣處理，每個體系設一個空白對照，只添加相同VS質量的接種物而不加稻秸底物，實驗在39℃下厭氧發酵44d。

實驗分別在兩套裝置上進行。產甲烷分析和微生物分析取樣使用甲烷潛力測試系統（AMPTS，瑞典），如圖2-1所示，有效體積250mL。而常規指標取樣使用125mL血清瓶裝置（80mL有效體積），在TS-2112B型大容量恒溫搖床（上海天呈實驗儀器，中國）上進行；每隔4d，每個體系取一瓶樣品終止反應用于指標分析。在AMPTS系統中，產生的沼氣通過4mol/L NaOH吸收后自動測量甲烷體積。每個體系甲烷體積要扣除相應空白對照數值。發酵結束后樣品在離心力800g下離心15min，沉淀作為固相樣品（IS），并通過SEM（FEI Quanta 200，荷蘭）觀察形態特征。上清液在離心力27000g下離心30min，沉淀作為液相樣品（IL）[149]。兩類樣品儲存在-20℃下用于DNA提取。

圖2-1　甲烷潛力測試系統（AMPTS）示意圖