第三節　細胞培養生物學

一、體外培養細胞與體內細胞的差異與分化

1.體外培養細胞與體內細胞的差異

細胞離體后，失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態平衡的相對穩定環境中，日久天長，易發生如下變化：分化現象減弱；形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此，培養中的細胞可視為一種在特定條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后，這種差異就開始發生了。

2.體外培養細胞的分化

正常個體發育開始于完成受精后的合子狀態，由合子經過細胞分裂與細胞分化過程逐漸形成細胞的多樣性，出現組織與器官的形態與結構。細胞分化是機體不同組織與器官發揮功能的先決條件，細胞分化的標志是特異性蛋白的合成。細胞離體培養環境的改變，失掉體內的調節系統，細胞的分化可能會發生其它方面的變化，如不適應、脫分化或去分化。

二、體外培養細胞的類型

根據體外培養的細胞能否貼附在培養容器上生長的特性，主要分為貼附型的生長細胞與非貼附型的生長細胞（懸浮型）兩大類。

（一）貼附型

細胞在培養時能貼附在支持物的表面生長，即只有依賴于貼附才能生長的細胞稱為貼附型細胞。貼附生長本是大多數有機體細胞在體內生存和生長發育的基本存在方式。貼附有兩種含義：一是細胞之間相互接觸；二是細胞與細胞外基質之間的相互接觸。動物細胞培養中，大多數哺乳動物細胞是必須附壁即附著在固體表面生長，當細胞布滿表面后即停止生長，這時若取走一片細胞，存留在表面上的細胞就會沿著表面生長而重新布滿創面。

目前已有很多種細胞能在體外培養生長，包括正常細胞和腫瘤細胞。例如成纖維細胞、骨骼組織、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺、皮膚、神經膠質細胞、內分泌細胞、黑色素細胞及各種腫瘤等。這些細胞在活體體內時，各自具有其特殊的形態，但是處于體外培養狀態下的貼附生長型細胞則常在形態上表現為比較單一化而失去其在體內原有的某些特征，并多反映出其胚層起源的情況。貼附生長的體外培養的細胞從形態上一般大體可分為上皮型細胞及成纖維型細胞，以及游走型和多形型。

1.成纖維型細胞

胞體呈梭形或不規則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態。另外，凡培養中細胞的形態與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2.上皮型細胞

細胞呈扁平不規則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形態。

3.游走型細胞

體外培養的游走型細胞具有類似巨噬細胞樣的特征。形態學特征為：游走型細胞在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落；細胞胞質常伸出偽足和突起；在培養器皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規則；細胞內易出現暗色的吞噬性顆粒。該類細胞不很穩定，外形不規則且不斷變化，當細胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細胞型或上皮細胞型。表現這種細胞形態的主要是具有吞噬作用的單核巨噬細胞系統的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等。

4.多形型細胞

有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。

以上分類僅是為了實際工作的方便而進行的籠統提法，體外的這些細胞類型并不能等同于體內相應類型的細胞，僅僅是描述培養細胞的形態而已。體外培養時所謂的上皮細胞型細胞或成纖維細胞型細胞，僅是因為其形態與體內的上皮細胞或成纖維細胞類似，并不能將體外培養的這些細胞與體內同名的細胞完全等同；而且，這種名詞系使用于描述細胞的外形而并非說明細胞的起源。

（二）懸浮型

少數類型細胞在體外培養時不需要附著于底物而于懸浮狀態下即可生長，包括一些取自血、脾或骨髓的培養細胞，尤其是血液白細胞，以及癌細胞。這些細胞在懸浮中生長良好，可以是單個細胞或為細小的細胞團，觀察時細胞呈圓形。由于懸浮生長于培養液之中，因此其生存空間大，具有能夠繁殖大量細胞、傳代繁殖方便（只需稀釋而不需消化處理）、易于收獲細胞等優點，并且適于進行血液病的研究。缺點是不如貼附生長型觀察方便，而且并非所有的培養細胞都能懸浮生長。

三、體外培養細胞的生長與增殖過程

體內細胞生長在動態平衡環境中，而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞特別是正常細胞，在體外的生存也不是無限的，存在著一個發展過程。所有這一切，使組織細胞在培養中有著一系列與體內不同的生存特點。

（一）培養細胞生命期

所謂培養細胞生命期，是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細胞在培養中生命期如何？這要看細胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細胞培養，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維持一年左右的生存時間，最后衰老凋亡。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養的為其它細胞如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發生遺傳性改變，如獲得永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發生改變。

正常細胞培養時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經歷以下三個階段（圖1-1）：

1.原代培養期

原代培養也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，一般持續1～4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。原代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養基中進行培養時，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。克隆形成率即細胞群被稀釋分散成單個細胞進行培養時，形成細胞小群（克隆）的百分數。原代培養細胞多呈二倍體核型；由于原代培養細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。

2.傳代期

體內細胞生長在動態平衡環境中，而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代。原代培養的細胞一經傳代后便改稱做細胞系。

傳代期特點：在全生命期中此期的持續時間最長，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。

3.衰退期

特點：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

（二）組織細胞培養一代生存期

“一代”指細胞從接種到分離再培養所需要的時間。與細胞倍增一代不是一個含義。在細胞一代中，細胞能倍增3～6次，經歷三個階段。置于體外培養的細胞，如條件合適，將生長繁殖。在培養器皿中，細胞繁殖到一定程度后，供培養生長的區域被細胞占滿，培養基中的營養物質將被耗盡，如不及時傳代，原代細胞將逐漸死亡。原代細胞培養傳代后即為細胞系。成為第二代的細胞，以后可能繼續傳代。有限細胞系經過一定的代數之后，最終衰退而死亡；無限細胞系或連續生長細胞系則因具不死性而可無限/永久地傳代、生長。在細胞的生長過程中，繁殖到一定密度后，將之分開而移至新的培養皿中（稱為接種），使之繼續繁殖生長，即為傳代細胞自接種至新培養皿中至其下一次再傳代接種的時間為細胞的一代。每代細胞的生長過程可分為三個階段（圖1-2）：細胞先進入生長緩慢的潛伏期，以后為增殖迅速的對數增生期，最后到達生長停止的穩定期。

1.潛伏期

細胞接種培養后，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此期細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼壁速度不同，這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。貼附現象是非常復雜和受多種因素影響的。

細胞潛伏期具有如下特點：

（1）細胞貼附后進入潛伏期，細胞無增殖。少見分裂相，細胞有運動活動。

（2）初代培養細胞潛伏期約為24～96h或更長，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期約6～24h。

（3）細胞接種密度大潛伏期短。

（4）細胞出現分裂相增多時，標志細胞進入指數增生期。

2.對數增生期

又稱指數增生期。是細胞增殖最旺盛的階段，分裂相細胞增多。對數生長期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，原代細胞分裂指數較低，而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達3%～5%。對數生長期是細胞活力最好的時期，是進行各種實驗的最佳時期，也是凍存細胞的最好時機。在接種細胞數量適宜情況下，對數增生期持續3～5h后，隨著細胞數量不斷增多、生長空間減少，最后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現象稱接觸抑制現象。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象（圖1-3），能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積。細胞接觸匯合成片后，雖然發生接觸抑制，但只要營養充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養枯竭和代謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現象稱密度抑制現象。

3.穩定期

細胞數量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入穩定期。此時細胞數持平，故也稱平臺期。穩定期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養液中營養耗盡、代謝產物積聚、pH下降等因素中毒，出現形態改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發生死亡，因此，應及時傳代。

細胞穩定期特點：細胞不增殖，有代謝活動。培養液中的營養已逐漸耗盡，代謝產物積累增多，pH值降低，此時需要傳代，否則細胞將會中毒，發生形態改變，細胞會從底板脫落死亡。傳代過晚將影響下一代細胞的生長，至少要再傳1～2代，通過換液可淘汰死細胞和受損較輕的細胞。待細胞全部恢復后再用。

四、細胞周期

細胞周期即一個母細胞分裂結束后形成的細胞至其下一次再分裂結束形成兩個子細胞的這段時期，可分為間期和M期（分裂期）兩個階段。細胞群中多數細胞處于間期，少數細胞處于M期。一般間期的時間較長，而M期的時間較短。在間期，細胞完成生長過程，主要為DNA的合成，即遺傳物質DNA的復制。在M期，細胞所完成的主要是分裂，即遺傳物質的分配。在間期中，DNA合成僅占其中的一段時間，稱為DNA合成期（S期）；在S期之前和S期之后，分別有兩個間隙階段，稱為DNA合成前期（G1期）及DNA合成后期（G2期）。因此，可將細胞周期歸納如下：

間期=G1期+S期+G2期

細胞周期=間期+M期=G1期+S期+G2期+M期

1.G1期

從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點是物質代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質，細胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備。各種細胞G1期持續時間的長短差異較大，短者4～5h，長者可達數日。增殖旺盛細胞的G1期持續時間短，衰退細胞則時間長。

2.S期

即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。DNA復制所需要的酶都在這一時期合成。在S期的開始階段，DNA合成的強度較大，以后逐漸減少，至S期結束時DNA含量將加倍。本期為遺傳物質較易受損的時期，因DNA在合成過程中，其核苷酸雙鏈分離，易于受到致突變或致癌物的影響。各種細胞的S期持續時間差別較小，在2～30h之間，平均6～8h。

3.G2期

為DNA合成后期，是有絲分裂的準備期。在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質，包括微管蛋白和促成熟因子等。在G2期，蛋白質的合成與細胞的分裂有關，若此期內蛋白質的合成受阻，將影響細胞進行分裂。細胞于本期中對周圍環境較敏感，易因溫度、pH等因素的影響而受干擾，停阻于G2期，但當這些不利的作用因素去除后常能恢復。本期持續時間較短，為2～3h或略長。

4.M期

為細胞分裂期。細胞的有絲分裂需經前、中、后、末期，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。細胞處于分裂時稱為分裂相。細胞分裂相的多少可作為細胞生活狀態和增殖旺盛情況判斷的重要參考指標。M期整個持續時間很短，也較穩定，一般需1～2h。

（1）前期　染色質絲高度螺旋化，逐漸形成染色體。染色體短而粗，強嗜堿性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。前期持續時間為20～30min。

（2）中期　細胞變為球形，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發出的微管附著于每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群，共46個，其中44個為常染色體，2個為性染色體。男性的染色體組型為44+XY，女性為44+XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發夾狀，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構成。中期持續時間為20～30min。

（3）后期　由于紡錘體微管的活動，著絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，并向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，并由于赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞鈴形。后期持續時間最短，僅5～6min。

（4）末期　染色單體逐漸解螺旋，重新出現染色質絲與核仁；內質網囊泡組合為核被膜；細胞赤道部縮窄加深，最后完全分裂為兩個2倍體的子細胞。本期持續的時間為20～30min。

整個細胞周期的持續時間和細胞周期中各期的持續時間因不同細胞類型而異。一般說來，哺乳動物細胞的細胞周期為10～30h。其中S期、G2期及M期一起為10h左右，不同細胞的變異程度較小；而G1期持續的時間差別則較明顯。因此，某種細胞的細胞周期時間的長短主要與G1期的關系密切。