第四節　細胞培養條件與影響因素

體外培養組織與細胞與體內環境不同，在保證細胞生長所需的各種營養成分的同時，也得模擬體細胞生長的環境，滿足基本的理化生存環境與無菌條件。

一、無菌環境

培養環境無毒和無菌是保證培養細胞生存的首要條件。人體內環境同樣需要無菌和無毒。但在有害物侵入體內或代謝產物積累時，由于體內存在著強大的免疫系統和解毒器官（肝臟等），對它們可進行抵抗和清除，使細胞不受危害。當細胞被置于體外培養后，便失去了對微生物和有毒物質的防御能力，一旦被污染或自身代謝物積累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養中，保持細胞生存環境無任何污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。

無菌操作基本要求：①手指不能觸及器材使用端；②減少手指與器材的接觸面積，學會手指操作；③一切操作，如打開或封閉瓶口、安裝吸管等，都要在火焰前方進行、使用端用前要經過火焰消毒；④瓶口要順風斜放在支架上；⑤細胞培養各種用液專管專用，并要勤換吸管，防止擴大污染和交叉污染；⑥瓶口液滴不能再倒回瓶內，要用干酒精棉球擦拭，瓶口要再經火焰消毒；⑦操作者動作要準確敏捷，盡量避免空氣流動。

二、細胞分離方法

細胞培養之前，首先要進行組織塊的分離，其主要方法包括：直接分離法（包括機械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和膠原酶消化）。

（1）直接分離法　該方法分離得到的細胞數量沒有酶消化法得到的多，但可滿足一般實驗的要求，該方法的優點是操作流程簡單，不需要復雜的儀器和昂貴的膠原酶。

（2）酶消化法　多用于新生動物組織或動物胚胎的肝細胞培養。胰蛋白酶消化法具有分離效果好、操作簡單和價格便宜的特點，因為胰酶消化的條件很難掌握，所以未被廣泛應用；膠原酶消化法具有分離效果好、細胞產量高（即時存活率高、對細胞損傷小）、維持細胞特異性功能的時間長等優點。

三、細胞培養溫度

不同種類的動物細胞對溫度的要求并不一致，如人和哺乳動物的細胞培養溫度為35～37℃，鳥類細胞培養溫度為38.5℃，鼠類細胞為34℃。一般來說，細胞對低溫的耐受力比高溫強。因此，在細胞的培養過程中要及時地根據細胞的類型調整適宜的溫度。在使用恒溫培養箱時，箱內溫度應維持在37℃、CO2體積分數為5%。

四、細胞培養基的成分

培養基既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質，也是培養細胞生長和繁殖的生存環境。培養基的種類很多，按其物質狀態分為半固體培養基和液體培養基，按其來源分為天然培養基和合成培養基。

1.天然培養基

最普遍的天然培養基是血清，基本以小牛血清最為普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及多種活性物質。與合成培養基合用，能使細胞順利增殖生長。質量好的血清應該是無溶血、橘黃色、清亮透明、無細菌、無支原體污染的黏稠狀液體。血清的體積分數要控制在5%～20%，當超過30%時反而不利于細胞生長，過高或過低的血清體積分數都不利于細胞的生長和增殖。一般將血清保存于－20℃以下，時間不宜過長。

2.合成培養基

合成培養基是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量元素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好地生長增殖。迄今為止，人工合成的培養基已有多種，如RPMI-1640、Eagle’s MEM、DMEM等，其主要差別在于氨基酸、維生素、無機鹽和能源物質的組成及含量不同。一般認為RPMI-1640營養全面，對各種組織生長都適用；Eagle’s MEM適合于細胞株的傳代培養；DMEM有利于細胞的分裂增殖；Ham’s F12能促進細胞的分化。也有學者將不同培養基混合應用，從而得到較好的培養效果。培養液中的抗生素是青霉素和鏈霉素。此外，卡那霉素、新霉素、兩性霉素、氯霉素等都可以防止細胞培養過程中細菌和真菌的污染。

五、接種密度

一定濃度的培養液僅能支持一定數量的細胞生長，細胞密度過大時，養分不足，使細胞迅速老化；而密度過小時不利于細胞單層的形成。在傳代培養中，細胞的密度取決于傳代的時間。一般分瓶的稀釋比例為1∶3至1∶6，依細胞種類而異。在細胞生長的外部條件完全相同的情況下，細胞分散比率不同會導致不同的增殖倍數，影響細胞產量，這對培養種細胞尤其重要。

六、培養基的pH值

在培養動物細胞時，不同種動物或是同一種動物的不同部位對pH值的要求各不相同。一般認為，動物細胞培養基的pH值一般在7.2～7.4，呈弱堿性。培養過程中pH值低于6.8時對細胞生長會有抑制作用，細胞生長緩慢；而當pH高于7.6時則細胞不能生長，這可能是由于空氣的接觸而導致培養基中的營養成分被氧化所致。

七、細胞的凍存與復蘇

細胞凍存和復蘇的基本原則是“慢凍快融”，實驗證明這樣可以最大限度地保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質都能提高細胞膜對水的通透性。緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

1.細胞凍存

傳代培養的細胞，如果暫時不用，可以冷凍保存。利用凍存技術將細胞置于－196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，在需要的時候再復蘇細胞后用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其它意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。細胞凍存時向培養基中加入保護劑至終體積分數5%。15%的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。標準冷凍速度開始為－1℃/min或者－2℃/min，當溫度低于－25℃時可加速，到－80℃之后可直接投入液氮內（－196℃）。

2.細胞復蘇

復蘇細胞的原則為快速解凍，從液氮中取出細胞凍存管之前應準備好38℃的溫水，凍存管取出后用鑷子夾住頂端迅速放入溫水中，結束后還要在75%酒精中清洗幾次，除去透明過程中染上的雜質。凍存復蘇后的狀態主要與凍存保護劑的種類、濃度以及細胞復蘇方法和復蘇后培養液中小牛血清濃度等有關。二甲基亞砜（DMSO）是一種具有非常強的溶解能力和非凡滲透能力的化學物質，也是應用最廣泛的體外培養細胞凍存保護劑，其常用體積分數為10%～20%，不同種屬細胞的最適濃度也存在一定差別。

八、附著底物

除少數懸浮型細胞外，絕大多數體外培養細胞需附著在適宜的底物上才能生長。細胞貼附在底物上生長的性質稱錨著依賴性。原則上講，凡對細胞無毒性的物質都可用作底物，但不同的細胞，對底物要求各異，底物不適，細胞生長不良。根據所培養細胞的種類和培養的目的，常用底物有以下幾種。

1.玻璃

這是最常用的底物，有透明、便于觀察、易洗滌和能反復使用等優點，質地以中性玻璃為上。玻璃底物適于各種細胞附著生長，玻璃用強堿如NaOH處理后，性質能受一定影響，需用酸中和后才可用。缺點是易破碎。

2.一次性塑料

塑料種類很多，常用有聚苯乙烯，歐美等國已廣泛使用，我國也開始生產。聚苯乙烯材料具有疏水性，制成培養瓶（皿）后，需加工處理，使表面帶有電荷，遂產生疏水性。由聚苯乙烯制成的培養瓶（皿），光潔平坦，用于培養正常細胞、無限細胞系、轉化細胞和腫瘤細胞均可。市售包裝好的消毒商品，使用方便，一般限一次使用，消耗量大，不甚經濟，不同廠家產品，尚有質量上的差異。此外還有聚四氟乙烯制品，有充電荷和非充電荷兩種，前者具有親水性，適合一般單層細胞培養，后者具有疏水性，適合巨噬細胞和轉化細胞培養。聚四氟乙烯透氣性好，還可制成薄膜，剪成小塊后能置入各種瓶（皿）中，適于細胞貼附生長，便于取出、染色和做電鏡切片。塑料瓶（皿）用后，必要時尚可重用；用水沖洗干凈，如有殘余細胞附著牢固，可用膜蛋白酶消化去除，晾干包裝后，鈷60輻射滅菌，但僅限一兩次，使用次數過多，易出劃痕和破壞疏水性。一次性塑料為理想的培養器皿。隨著經濟條件改善，有日趨普遍應用和取代其它培養器皿之趨勢。

3.微載體

微載體是由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球體，附著面大，利于大量增殖細胞。

4.飼養細胞

飼養細胞也稱滋養細胞，可用成纖維細胞或其它細胞長成單層后，再用大劑量射線照射，使細胞失去增殖能力但尚存活和有代謝活動。令其作為底物，將其它細胞接種于其上；飼養細胞的代謝產物利于其它細胞生長，從而被稱為飼養細胞。飼養細胞可用于培養特殊難培養的細胞。

九、細胞供體年齡

原則上所有個體都可作為組織細胞的供體，但同樣培養物，來自幼年個體比老年者易于培養；來自同一個體的組織，分化低的組織細胞比分化高的容易培養。同一個培養物中的細胞成分性狀是不均一的，即存在著異質性，表現在分化程度、生物性狀、增殖能力和對體外培養環境的適應能力不同等。如皮膚組織培養時，成纖維細胞大多先生長，并能壓過表皮細胞的生長；干細胞比非干細胞易生長增殖等。