第二章　紅細(xì)胞血型系統(tǒng)

第一節(jié)　紅細(xì)胞血型免疫學(xué)基礎(chǔ)

一、紅細(xì)胞血型抗原

1．紅細(xì)胞血型抗原的分類及統(tǒng)一命名

2．紅細(xì)胞血型抗原的生化結(jié)構(gòu)

紅細(xì)胞抗原的生化結(jié)構(gòu)有兩組基本類型。一組類型的血型抗原的決定簇是結(jié)合到蛋白或脂上的碳水化合物(多糖)，這些血型抗原的特異性由碳水化合物(多糖)所決定，負(fù)責(zé)這些抗原的基因，編碼一個(gè)中間體分子，大多是酶，可轉(zhuǎn)移糖分子到蛋白或脂上而產(chǎn)生抗原的特異性，由暴露在紅細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)抗原，屬于這一組的抗原有ABO、Lewis、Rh等。另一組類型的抗原特異性由蛋白的氨基酸序列所決定，由基因直接控制抗原的多態(tài)性，大多數(shù)的血型抗原屬于這組結(jié)構(gòu)類型。

目前已清楚，攜帶血型抗原的蛋白是分別以單串通、多串通及連接于糖磷脂酰肌醇(GPI)三種方式嵌入紅細(xì)胞膜。表2-2匯總了目前已了解的紅細(xì)胞血型抗原的分子和生化特性，包括每個(gè)紅細(xì)胞上血型抗原的數(shù)量、分子量、攜帶抗原的紅細(xì)胞膜成分和抗原的生化成分。

3．血型抗原的基因?qū)W說

被ISBT認(rèn)可的血型系統(tǒng)中，每個(gè)系統(tǒng)都會(huì)有一個(gè)或一個(gè)以上的抗原，這些抗原由1～3個(gè)單基因緊密連鎖的同源基因所編碼，例如MNS、Rh、Chido-Rog-ers。一些表達(dá)不同血型系統(tǒng)抗原的基因可處于同一染色體上，有些甚至是連鎖的，但是它們之間通常有著可測(cè)的重組率。表達(dá)25個(gè)血型系統(tǒng)抗原的基因，至今除四個(gè)以外，均已被克隆，因此血型基因多態(tài)性的分子基礎(chǔ)能逐步地被闡明，血型多態(tài)性的產(chǎn)生大多由一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)義的突變而形成，單個(gè)核苷酸的堿基的改變導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變和產(chǎn)生抗原的多態(tài)性。其他涉及血型多態(tài)性的基因結(jié)構(gòu)，包括有單個(gè)核苷酸的缺失、整個(gè)基因的缺失、插入以及緊密連鎖的同源基因的遺傳物質(zhì)的改變等。在不同的種族、民族、地區(qū)和人群中，血型抗原頻率的分布可以不同，即使是同一血型抗原，其基因結(jié)構(gòu)也可能存在差別，這在非分泌型se基因、SHD基因等均有報(bào)道。

4．紅細(xì)胞抗原的生物功能和進(jìn)化

應(yīng)用血型抗原的分子結(jié)構(gòu)和血型基因多態(tài)性的研究成果，尤其是經(jīng)過與相似結(jié)構(gòu)的其他功能性分子的比較及類推，或通過一些血型抗原所在已知功能的蛋白的提示，推斷了許多血型抗原可能具備的生物功能。但是，大多數(shù)的血型系統(tǒng)都存在抗原全無的表現(xiàn)型(null型)，具有這種表現(xiàn)型的紅細(xì)胞上缺少相應(yīng)的血型蛋白以及血型抗原，可這類表現(xiàn)型通常是健康人，因此認(rèn)為盡管血型抗原可顯示出重要功能，但這些功能在紅細(xì)胞上或在其他組織上可能大多是多余的，在它們?nèi)狈r(shí)，其他的結(jié)構(gòu)能執(zhí)行這些生物功能，關(guān)于這一點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。目前所了解的血型抗原的生物功能可分成以下幾方面。

(1)作為化學(xué)增活素受體　Duffy血型的糖蛋白，具備化學(xué)增活素受體的作用，其活性是在分子的氨基端上，已證實(shí)Duffy(a－b－)的紅細(xì)胞，不能結(jié)合化學(xué)增活素IL-8。

(2)運(yùn)輸功能(作為傳送蛋白)　一些血型抗原位于特異性的運(yùn)輸分子上，Diego和Wright血型抗原位于運(yùn)輸分子帶3上，帶3是一類主要的陰離子交換器。Colton抗原位于通道-形成完整蛋白(CHIP)上，這是一類主要的水通道蛋白，因此Colton抗原可能是水的傳送器。Kidd抗原可能是具有脲運(yùn)輸作用的蛋白的一部分，Rh抗原可能涉及銨的運(yùn)輸。

(3)補(bǔ)體通道作用　三個(gè)血型系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)是涉及補(bǔ)體通道的分子，Chido/Rogers抗原是G4分子的一部分。Cromer抗原位于衰變加速因子(DAF)紅細(xì)胞膜分子上。Knops抗原是G3b補(bǔ)體受體的一部分。DAF的作用是防止紅細(xì)胞受補(bǔ)體的破壞，已發(fā)現(xiàn)Cromer陰性的紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體敏感性有輕度增加的現(xiàn)象。

(4)黏附分子作用　Indian血型抗原位于黏附分子CD44上，Lutheran血型抗原是細(xì)胞內(nèi)核纖維蛋白結(jié)合的黏附分子，LW是β整合蛋白結(jié)合的黏附分子。

(5)結(jié)構(gòu)完整性作用　血型糖蛋白是紅細(xì)胞表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要作用，并且因其匯集了紅細(xì)胞表面陰性電荷的大部分，為防止不合適的紅細(xì)胞間的反應(yīng)作出貢獻(xiàn)。MN抗原是血型糖蛋白A的一部分，Ss抗原是血型糖蛋白B的一部分，Gerbich抗原是血型糖蛋白C和D的一部分，已發(fā)現(xiàn)缺少血型糖蛋白C和D將導(dǎo)致橢圓形紅細(xì)胞形成和減弱紅細(xì)胞變形能力。

(6)酶的活性　Cartwright血型抗原位于乙酰膽堿酯酶分子，Kell抗原的基因與鋅-結(jié)合肽酶的基因很相似，這些抗原與相關(guān)酶活性的聯(lián)系尚在研究中。

(7)微生物受體　Duffy抗原和Knops抗原是瘧原蟲的受體，Cromer抗原可能是大腸埃希菌的受體而與尿道感染有關(guān)。P血型抗原的糖苷脂可能是細(xì)小病毒19的受體；Cromer抗原的DAF分子可能是腸病毒如柯薩奇病毒或埃可病毒的受體。脊髓灰質(zhì)炎病毒在其黏附過程中，可能會(huì)使用含有Indian血型抗原的CD44分子。

(8)血型抗原多態(tài)性在進(jìn)化中的作用　在微生物入侵紅細(xì)胞的機(jī)制上，血型抗原多態(tài)性在進(jìn)化中的作用得到解釋。血型等位基因在進(jìn)化過程中存在選擇性優(yōu)勢(shì)，可使紅細(xì)胞難以與某些微生物結(jié)合。Duffy抗原的化學(xué)增活素是間日瘧原蟲的受體，在非洲黑人中，普遍存在Fy(a－b－)的表現(xiàn)型，紅細(xì)胞上缺乏Duffy抗原和糖蛋白，因此免受瘧原蟲的感染。

二、紅細(xì)胞血型抗體

血型抗體是在血型抗原物質(zhì)刺激下形成，并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白(immunoglobulin，簡(jiǎn)稱Ig)。免疫球蛋白是血液、組織液和分泌液中的一類糖蛋白，血清電泳時(shí)抗體活性主要在γ-球蛋白區(qū)，也有少量可延伸到β區(qū)及α2-球蛋白區(qū)。免疫球蛋白不耐熱，在60～70℃被破壞，能被多種蛋白酶水解，使抗體活性破壞。

抗體是免疫球蛋白的主體，是體液免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)分子，它們能特異性地結(jié)合或識(shí)別入侵的病原體(抗原)，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。紅細(xì)胞血型抗體的另一主要功能是與紅細(xì)胞的表面抗原結(jié)合，通過補(bǔ)體作用，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，產(chǎn)生血管內(nèi)或血管外溶血。

紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中有大量的抗原，相應(yīng)地也有大量的特異性抗體識(shí)別這些抗原，血型抗體在紅細(xì)胞血型的研究和應(yīng)用中占有十分重要的地位，因而需要了解免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及它們作為血型抗體的免疫反應(yīng)特征。

1．IgG

人體的總血清免疫球蛋白中IgG約占75%，且亦發(fā)現(xiàn)于血管外液內(nèi)。它是2條重鏈與2條輕鏈的單獨(dú)基本的免疫球蛋白單位，有4個(gè)IgG分子亞類(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，其相對(duì)的IgG分子濃度依次為60%～70%、14%～20%、4%～8%及2%～6%。此亞類的重鏈氨基酸順序與鏈間雙硫鍵的排列各異。輕鏈可為κ、λ或兩者都有，能在各種免疫球蛋白中發(fā)現(xiàn)。IgG是唯一能通過母體胎盤到達(dá)胎兒的免疫球蛋白，在其亞類中以IgG2通過胎盤的效率最低。

IgG有結(jié)合補(bǔ)體的能力，其能力由強(qiáng)至弱依次為IgG3、IgG1、IgG2。IgG4不能以經(jīng)典路徑使補(bǔ)體固定，但可在替代路徑中參與。

2．IgM

IgM約占人體總血清免疫球蛋白的10%，并以5個(gè)基本免疫球蛋白單位組成的五聚體特征出現(xiàn)，且有一個(gè)額外的短多肽鏈，稱為J鏈。雖然此五聚體分子具有10個(gè)抗原結(jié)合部，但在任一分子上的全部10個(gè)單位只能同時(shí)與較小的抗原(如半抗原)起反應(yīng)。當(dāng)同時(shí)與較大的抗原起反應(yīng)時(shí)，價(jià)數(shù)(結(jié)合部位的利用度)降到5，這可能是由于這個(gè)分子各個(gè)μ鏈內(nèi)部的彎曲性有限，使可連接抗原結(jié)合部位的數(shù)目因空間限制而減少。雖然IgM的抗原結(jié)合部位通常具有低的結(jié)合吸引力，但為多個(gè)抗體結(jié)合部位所均衡。

IgM是胎兒免疫系統(tǒng)成熟時(shí)最早出現(xiàn)的免疫球蛋白，且是原發(fā)性抗體反應(yīng)早期產(chǎn)生的主要類別。IgM大部分存在于血液內(nèi)(80%)，而血管外IgM僅為20%；IgG在血管內(nèi)、外各為50%。IgM與IgG都是在B細(xì)胞表面上所表現(xiàn)的主要免疫球蛋白。

IgM抗體是高度有效的凝集素，可極有效率地使補(bǔ)體活化。一單獨(dú)的IgM分子與一紅細(xì)胞的表面結(jié)合，能引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解現(xiàn)象。IgM受2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol, 2-Me)或二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)的部分還原作用使5個(gè)單位分開，釋放出J鏈。溶血素和直接凝集活性因這種處理而破壞。

3．IgA

分泌液中的主要免疫球蛋白為IgA。它有單體與多聚體兩種形式。大部分血清的IgA為單體型；小部分具有J鏈，以基本單位的多聚體存在。在唾液、淚液、支氣管分泌液、鼻黏膜、前列腺液、陰道分泌液及小腸黏膜分泌液中，IgA主要以雙聚體存在，不僅包括J鏈，且亦有上皮細(xì)胞起源的多肽鏈，稱為分泌鏈。IgA在這些分泌液中的濃度大，推想這種免疫球蛋白的主要功能是阻止外來病原體進(jìn)入身體的免疫系統(tǒng)。聚集的IgA能經(jīng)替代活化途徑激活補(bǔ)體。在人類有兩種抗原不同的亞類，命名為IgA1及IgA2。

三、紅細(xì)胞抗原和抗體的鑒定

在常規(guī)的血型血清學(xué)鑒定中，大多采用三種肉眼可見的特異性反應(yīng)，即凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和溶血反應(yīng)，其中以特異性的凝集反應(yīng)最為重要，應(yīng)用也較普遍。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，采用DNA技術(shù)，直接對(duì)血型抗原的基因做檢測(cè)，然后判斷血型抗原的表型，已成為血型抗原鑒定的先進(jìn)技術(shù)。

抗體的檢出及特異性鑒定所用的血清學(xué)技術(shù)很多，實(shí)驗(yàn)室中常采用的有代表性的技術(shù)如下。

(1)生理鹽水法　IgM免疫球蛋白的抗體在鹽水介質(zhì)中能直接凝集相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞，通常在22℃以下反應(yīng)性較強(qiáng)，但有的IgM抗體(如抗-kell及抗-D)在37℃也有較大活性，這些抗體有重要的臨床意義，用蛋白水解酶法或抗球蛋白試驗(yàn)也能檢出這些抗體。

(2)白蛋白凝集試驗(yàn)　采用血清白蛋白的溶液作為膠體介質(zhì)代替生理鹽水，能增強(qiáng)IgG抗體的凝集反應(yīng)，通常使用22%或30%牛血清白蛋白。

(3)低離子強(qiáng)度試驗(yàn)(low ionic-strength solution，LISS)　抗原和抗體在低離子強(qiáng)度的條件下能加速反應(yīng)，增加紅細(xì)胞凝集的強(qiáng)度。

(4)蛋白水解酶的方法　使用蛋白水解酶能增強(qiáng)多數(shù)紅細(xì)胞血型抗體的反應(yīng)性，特別是對(duì)Rh和Kidd等血型系統(tǒng)的抗體，能有助于抗體的有效檢出，但由于蛋白水解酶對(duì)M、N、S、Fya及Fya，抗原的決定簇有破壞作用，不利于這些抗原的抗體檢出。蛋白水解酶技術(shù)在血型血清學(xué)中的應(yīng)用通常分一步法和二步法兩種。酶的一步法是在被檢血清和紅細(xì)胞的反應(yīng)系統(tǒng)中，直接加入蛋白水解酶液，置37℃水浴中孵育后離心觀察凝集反應(yīng)結(jié)果。酶的二步法是指先將紅細(xì)胞置37℃中使用酶液處理，然后經(jīng)洗滌和配制成紅細(xì)胞懸液后與被檢血清反應(yīng)，經(jīng)37℃孵育后，離心觀察反應(yīng)結(jié)果。

(5)抗球蛋白試驗(yàn)　血型血清學(xué)中常用的抗球蛋白技術(shù)分為直接法和間接法兩種。直接法通常用于檢查受檢者紅細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)是否被抗體致敏，在新生兒溶血病、溶血性輸血反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血等診斷試驗(yàn)中以及藥物致敏紅細(xì)胞的檢查中常見使用。間接法是證實(shí)紅細(xì)胞在體外被抗體結(jié)合的試驗(yàn)，是檢查血清中抗體特異性或紅細(xì)胞抗原的重要手段，通常用于未知抗體的檢出及確認(rèn)、交叉配合試驗(yàn)以及紅細(xì)胞抗原如Duffy、Kell和Kidd等血型抗原的鑒定試驗(yàn)。