1.2　國內外研究現狀及發展趨勢

1.2.1　生物地球氧化還原——全球物質循環的驅動力

許多元素如碳（C）、氮（N）、硫（S）、鐵（Fe）和錳（Mn）以及易于氧化還原的微量元素如砷（As）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鈾（U）的生物地球化學循環是由氧化還原過程驅使的。這些元素的化學形態、生物可利用性、毒性、在環境中的移動性直接受氧化還原反應的影響。此外，其他不具有氧化還原活性的元素和化合物的生物地球化學行為可能間接地與天然有機物和礦物的氧化還原轉換有關，特別是鐵的氫氧化物、錳礦物、含鐵黏土礦物、鐵硫化物。氧化還原活性基團與腐殖質和礦物表面相結合可進一步催化離子和分子，包括許多有機污染物的氧化或還原（Ginder-Vogel et al.，2005；Kappler and Haderlein，2003；Polizzotto et al.，2008；Wu et al.，2006）。由此可見，氧化還原過程可以為環境污染治理工程提供新的戰略機遇，了解環境中氧化還原界面的生物地球化學過程對保護環境生態系統健康是至關重要的。

1.2.1.1　氧化還原過程與碳、氮、磷元素循環

地球上所有生命的能量都來源于氧化還原過程。生物質的生產需要通過電子轉移將碳元素、常量營養元素（如N、S）和微量營養元素（如Fe、Mn）形成合適的氧化態進入生物分子中。地球誕生之前，生物氧化還原活性已經使氧化性的環境表面覆蓋了還原性物質，如有機物、硫化物和甲烷。沿著全球性的氧化還原梯度，許多潛在的電子供體、電子受體和碳源可以合成大量的在生態和代謝上具有多樣性的微生物（DeLong and Pace，2001）。

碳循環是由有氧光合作用驅動的，它通過失去水中的電子，固定二氧化碳，并產生氧氣。另外，非氧光合作用和化學無機自營養所固定的碳可能是局域性環境尤其是極端環境下最重要的生物質來源（D’Hondt et al.，2002）。有機質和其他還原性物質前期在沉積物中的埋藏以及后期隆起暴露在地球表面所發生的風化氧化過程是控制地質時間尺度上的大氣組成和地球氣候變化的關鍵過程（Berner，1999）。

環境中氮、磷的行為與碳的氧化還原過程密切相關。氮存在多種氧化態，它們的許多氧化還原過程，如固氮、硝化、反硝化、異化硝酸鹽還原為氨都是由微生物驅動的。這些微生物過程影響氮素的供應，進而影響當地乃至全球范圍內有機質的生產和循環（Howarth，2002）。類似這樣的關聯同樣存在于鐵、硫、磷和重金屬元素的氧化還原循環中（Moore，2014）。例如，黃鐵礦氧化作用是含水層中硝酸鹽循環的重要途徑，然而，該過程產生的硫酸鹽可能刺激硫酸鹽的微生物還原，這反過來可能會導致硫酸鹽將溶解態氫氧化鐵（Ⅲ）還原（Flynn et al.，2014；Friedrich and Finster，2014）。再有，當富含磷酸鹽的地下水排放進入地表水體可能會造成富營養化（Lucassen et al.，2004）。上述這些例子說明了生物地球化學氧化還原循環之間存在高度的耦合。

1.2.1.2　氧化還原過程與鐵、錳礦物的動態變化

作為地球表面最豐富的過渡金屬，鐵在環境生物地球化學中發揮著重要作用。氧化態鐵在極端酸性條件下可溶，但在近中性pH條件下Fe（Ⅲ）沉淀形成氫氧化鐵，氫氧化鐵表面能夠催化環境中許多重要的氧化還原反應。在還原條件下，氫氧化鐵會被無機物如硫化物還原，從而可能釋放出有害的吸附物（Afonso and Stumm，1992）。此外，Fe（Ⅲ）礦物可能作為終端電子受體被異化鐵還原細菌微生物還原。這些微生物在土壤、淡水和海洋環境中無處不在，它們能夠將有機化合物在細胞質內的氧化和細胞外難溶Fe（Ⅲ）礦物質的還原結合起來，從而通過磷酸化作用中的電子轉移獲得能量（DiChristina et al.，2005）。Fe（Ⅲ）礦物的還原產生可溶性Fe（Ⅱ）和各種次生礦物，包括Fe（Ⅱ）礦，如藍鐵礦［Fe₃（PO₄）₂］和菱鐵礦（FeCO₃），Fe（Ⅲ）礦物（如針鐵礦）和Fe（Ⅱ、Ⅲ）混合鐵礦，如磁鐵礦（Fe₃O₄）和綠鐵銹（層狀雙氫氧化物）。溶解態、吸附態和固態Fe（Ⅱ）在一系列生物氧化還原過程中可以作為強還原劑（Liger et al.，1999；Lloyd et al.，2000）。

Fe（Ⅱ）的氧化可由好氧微生物和厭氧微生物介導。微生物介導的Fe（Ⅱ）氧化在較低pH值環境下就可以進行，但在這樣的條件下化學氧化則無法進行。在近中性pH條件下，Fe（Ⅱ）的微生物氧化將會和Fe（Ⅱ）的快速化學氧化競爭。因此，在氧含量低的條件下特別是好氧-厭氧界面，例如被水淹沒的植物根部附近，這些氧化鐵（Ⅱ）的微生物將占據一定的優勢（Druschel et al.，2008）。在嗜中性、缺氧的環境中，硝酸鹽依賴型Fe（Ⅱ）氧化微生物可利用硝酸鹽和氧化錳（Ⅳ）作為電子穿梭體來促使Fe（Ⅱ）的氧化（Kappler and Straub，2005）。

錳氧化物礦物會參與環境中各種氧化還原反應，例如，水鈉錳礦（δ-MnO₂）直接氧化硒（Ⅳ）為硒（Ⅵ），氧化鉻（Ⅲ）為鉻（Ⅵ），氧化砷（Ⅲ）為砷（Ⅴ）（Post，1999）。錳（Ⅱ）的氧化可發生在各種環境中并可由多種細菌和真菌介導（Miyata et al.，2006）。生物介導的錳（Ⅱ）氧化所產生的最初產物通常結晶性很差，為層狀氧化錳（Ⅳ）礦物。雖然錳（Ⅱ）氧化的最終礦物形態往往取決于錳（Ⅱ）氧化期間及之后的地球化學條件，但生物介導的錳（Ⅱ）氧化通常被認為是環境中錳氧化物的主要來源途徑（Tebo et al.，2004）。

自然界水體中鐵（Ⅲ）和錳（Ⅲ、Ⅵ）礦表面結構和反應活性會受無機吸附物和天然有機物影響（Bauer and Kappler，2009；Borch et al.，2007）。腐殖質具有氧化還原活性，其作為微生物與礦物質之間的電子穿梭體能夠促進不溶性Fe（Ⅲ）礦物為微生物利用（Kappler et al.，2004）。腐殖質還可以通過絡合、增加金屬離子可溶性、在礦物表面吸附等方式進一步影響鐵、錳礦物的形成，進而導致結晶礦石無法形成（Eusterhues et al.，2008；Jones et al.，2009）。Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅳ）對天然有機物、磷酸鹽、碳酸鹽的強烈吸附可能會導致其所吸附的污染物發生解吸，但也可以阻止礦物對微生物的吸附，從而保護固相物質不被酶還原（Borch et al.，2007）。

1.2.1.3　氧化還原過程與重金屬轉化

一些微量重金屬，如鉻、銅、鈷、銀、锝和汞可能以一些氧化態存在，其還原轉化可能以化學方式進行，如銅（Ⅱ）可被二價鐵離子（Fe2+）或者硫氫酸（H₂S）還原為Cu（Ⅰ），Cu（Ⅱ）、Ag（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）可被由綠銹中存在的Fe（Ⅱ）還原為基本態（O’Loughlin et al.，2003）。此外，微生物也可以通過異化或者解毒途徑直接還原具有一定毒性甚至劇毒的金屬（如Cr、Hg、U）（Lovley，1993）。例如，最近基于X射線吸收近邊結構（XANES）和透射電鏡（TEM）的研究結果表明，洪澇時岸邊的污染土壤中金屬銅的形成可能是一種細菌解毒的結果（Weber et al.，2009a；Weber et al.，2009b）。微量金屬的還原可以降低其移動性，比如可溶性鉻（Ⅵ）還原為難溶性鉻（Ⅲ），Hg（Ⅱ）還原為揮發性Hg（0）（Lovley，1993）。

微生物硫酸鹽還原作用可能導致難溶性親銅重金屬元素的沉淀（Kirk，2004）。在富含硫的沉積物中，親銅重金屬元素可能與鐵硫化物發生共沉淀或者形成其他金屬的硫化物（Morse and Luther，1999）。然而，在被污染的淡水濕地中發現親銅重金屬元素的可利用性可能超過可還原硫化物，親銅重金屬元素的動態變化可能受生物硫化物共沉淀的競爭影響（Weber et al.，2009b）。與難溶金屬硫化物的共沉淀作用相比，金屬硫化物族的形成可能更會顯著提高金屬在厭氧環境中的流動性，而且由于其在動力學上的穩定性，使其可以在好氧水體中存在（Luther and Rickard，2005）。最近發現，在污染的河岸土壤中硫酸鹽的還原作用可通過促進富銅硫化物膠體的形成來提高銅、鉛和鎘的移動性（Weber et al.，2009a），這與金屬硫化物膠體能夠提高水體等其他環境介質中污染物的移動性的說法相吻合（Deonarine and Hsu-Kim，2009）。

砷的移動性、生物可利用性、毒性和環境命運受生物地球化學過程所控制，其控制方式主要是通過形成或者破壞砷的承載相、改變砷的氧化還原狀態與改變砷的化學組成（Dixit and Hering，2003）。在中性pH條件下，Fe（Ⅱ）的非生物和微生物氧化使之轉化為溶解性較小的Fe（Ⅲ）礦物，從而導致砷被吸附在次生鐵礦物中而被固定（Dixit and Hering，2003）。然而，厭氧光合細菌、硝酸還原菌、Fe（Ⅱ）氧化細菌也能耐受高濃度砷并提供合適的途徑來使得Fe（Ⅲ）與砷發生共沉淀（Hohmann et al.，2010）。在富含氫氧化物鐵（Ⅲ）的蓄水沉積物中，持續的、長期的還原條件可能會使得吸附劑耗盡，從而發生砷的移動（Tufano and Fendorf，2008），但這種現象是極其罕見的。總之，Fe（Ⅲ）和Fe（Ⅱ）直接的生物地球化學氧化還原過程能夠控制砷的移動性。

砷的移動性和毒性不僅受存在的合適的吸附劑的影響，同時也受其氧化還原形態的影響，通常認為砷還原態比其氧化態更易移動、具有更高毒性。許多生物地球化學過程可以直接或間接導致砷的氧化還原，例如Fe（Ⅱ）-針鐵礦系統，或過氧化氫反應形成的Fe（Ⅳ）可以氧化砷（Ⅲ）（Amstaetter et al.，2010；Hug and Leupin，2003）。還有學者提出細菌也可以通過將As（Ⅴ）還原或者As（Ⅲ）氧化而改變其氧化還原狀態來控制砷的移動性和毒性（Tufano et al.，2008），盡管這還不具有普遍性，但其反映出微生物對砷具有一定的解毒功能（Kulp et al.，2008）。此外，有些微生物還可以分泌活性有機或無機化合物與As（Ⅲ）或As（Ⅴ）發生氧化還原反應。最近研究還表明，腐殖質和醌模型化合物中的半醌自由基和氫醌也可以氧化砷（Ⅲ）為As（Ⅴ），或還原As（Ⅴ）為As（Ⅲ）（Jiang et al.，2009；Redman et al.，2002）。

在好氧環境中，鈾普遍以六價氧化態鈾［U］存在，U（Ⅵ）在大多數環境條件下是可溶的，尤其是當U（Ⅵ）與碳酸鹽結合時溶解性更大（Guillaumont et al.，2003）。相反，U（Ⅳ）溶解性較小，即使有地下水配體如碳酸鈣存在時，U（Ⅳ）仍趨于相對穩定（Wu et al.，2006；Wu et al.，2007）。事實上，目前正在探索一種可能的鈾微生物修復技術，實現原位修復U（Ⅵ）為U（Ⅳ）（Williams et al.，2013）。

在低溫地球化學環境中，非生物U（Ⅵ）的還原可通過若干途徑進行，但這些途徑會受到許多條件的限制（Borch et al.，2010）。相反，許多普通的金屬還原菌和硫酸鹽還原菌可以將有機質與H₂的氧化作用和鈾（Ⅵ）的還原作用聯系起來，從而生成鈾（Ⅳ）和晶體鈾礦沉淀（Gorby and Lovley，1992）。然而，作為電子受體的硝酸鹽或氫氧化鐵（Ⅲ）的存在和潛在的U（Ⅳ）氧化劑可能在一定程度上會阻礙U（Ⅵ）的生物還原（Stewart et al.，2009）。

潛在的UO₂氧化劑包括分子氧、硝酸鹽、硝酸鹽還原中間體、氫氧化錳（Ⅳ）和氫氧化鐵（Ⅲ）（Borch et al.，2010）。此外，UO₂還可以被生物活性物質催化氧化。硝酸鹽是一種常見的鈾的共污染物質，它不僅能夠阻礙鈾的生物還原，還有可能氧化鈾（Ⅳ）（Senko et al.，2005）。硝酸鹽氧化鈾在熱力學上是可行的，但在動力學上是受限的（Senko et al.，2005）。盡管由生物介導的將N轉化為N、NO和N₂O可以提高U（Ⅳ）的氧化速率，但與Fe（Ⅲ）和O₂氧化U（Ⅳ）的速率相比還是顯得相當緩慢。在普通地下水環境中，U（Ⅳ）/U（Ⅵ）的氧化還原電位和Fe（Ⅲ）氫氧化物/Fe（Ⅱ）的氧化還原電位相類似，因此，液相和固相的化學物質發生微小的變化都會導致Fe（Ⅲ）氫氧化物氧化UO₂的途徑在熱力學上時而可行、時而不可行（Ginder-Vogel et al.，2006）。脫氮硫桿菌和地桿菌能夠催化硝酸鹽而促進U（Ⅳ）的氧化，但目前尚不清楚這兩種細菌是否能夠從這個過程中獲得能量（Beller，2005）。

相對于U，Pu和Tc的生物地球化學循環的特點不明顯。在環境系統中Tc主要以可溶性Tc（Ⅶ）或相對可移動性Tc（Ⅳ）存在。在缺氧條件下，許多細菌能夠催化還原Tc（Ⅶ）為Tc（Ⅳ），形成Tc（Ⅳ）氧化物（Fredrickson et al.，2004）。此外，溶解的和吸附的Fe（Ⅱ）作為一種微生物的還原產物也是Tc（Ⅶ）的強還原劑，然而氧氣又會將Tc（Ⅳ）氧化可能是阻礙還原態锝固定的一個重大因素（Fredrickson et al.，2004）。

在環境中，Pu通常以Pu（Ⅲ）、Pu（Ⅳ）、Pu（Ⅴ）或Pu（Ⅵ）態形式存在。通常認為Pu（Ⅳ）移動性較差，而Pu（Ⅵ）移動性最強，而Pu（Ⅴ）通常只是在環境中短暫存在（Icopini et al.，2009）。Pu（Ⅲ）、Pu（Ⅳ）、Pu（Ⅴ）通常會被Mn（Ⅳ）氧化成Pu（Ⅵ）從而廣泛存在于環境中（Powell et al.，2006）。與U相似，氧化態Pu（Ⅴ、Ⅵ）也可以被金屬還原細菌如地桿菌和希瓦氏菌還原為Pu（Ⅳ）或Pu（Ⅲ）（Icopini et al.，2009）。

1.2.1.4　氧化還原過程與有機污染物降解

有機污染物在環境中廣泛分布，錳、鐵等礦物質以及腐殖質可能會大大影響到眾多有機污染物的氧化和還原轉化過程。這些反應途徑與速率取決于礦物類型、化學溶液和微生物活性。同樣該過程也可以設計成修復策略，如通過可滲透性反應層（PRB）來減小地下水中有機（和無機）污染物的蔓延。

幾項研究結果已經表明，相對于純凈的Fe2+，Fe（Ⅲ）氧化態，如與Fe（Ⅱ）反應的赤鐵礦可以顯著提高許多還原性污染物如硝基芳烴、氯化溶劑、農藥和消毒劑的轉化速度（Amonette et al.，2000；Borch et al.，2005；Hakala et al.，2007），但還沒有研究清楚的是與Fe（Ⅱ）反應為何會提高Fe（Ⅲ）氧化物的表面活性。Vikesland和Valentine（2002）研究了各種鐵氧化表面Fe（Ⅱ）和氯胺反應的動力學，發現鐵的氧化物對這些反應起著至關重要的作用。此外，針鐵礦活化的Fe（Ⅱ）還原硝基苯反應只能發生在Fe（Ⅱ）水溶液中（Williams and Scherer，2004）。Fe（Ⅱ）氧化還原活性的增強不僅在氧化物存在時能觀察到，在其他主要鐵礦物存在時也能觀察到。六氯乙烷和4-氯硝基苯的表面反應速率順序為：Fe（Ⅱ）+菱鐵礦<Fe（Ⅱ）+鐵氧化物<Fe（Ⅱ）+鐵硫化物（Elsner et al.，2004）。磁鐵礦的粒徑大小和聚集狀態會影響四氯甲烷的還原轉化（Vikesland et al.，2007）。另外，最近的一項研究表明，磁鐵礦中Fe（Ⅱ）/Fe（Ⅲ）的化學計量比可能會改變磁鐵礦顆粒的氧化還原性質，從而更有利于硝基苯還原（Gorski and Scherer，2009）。

細菌與厭氧性有機污染物如甲苯和氯乙烯相結合能夠還原電子載體（如腐殖質），被還原的電子載體可以進一步轉移電子到一些吸電子化合物中，如偶氮染料、多鹵代化合物、硝基芳烴（Van der Zee and Cervantes，2009）。研究顯示，氫醌基團還原的胡敏酸和模型化合物（如AQDS）會對硝基化合物的還原動力學和降解途徑都產生顯著影響（Borch et al.，2005；Van der Zee and Cervantes，2009）。

除了通過金屬氧化物和有機物質在自然條件下轉化污染物，PRB代表了處理污染地下水的一種環境修復技術（Gillham and Ohannesin，1994）。以零價鐵為基礎的PRB已經被證明可以有效去除包括鹵化有機溶劑在內的多種污染物（O’Hannesin and Gillham，1998）。通常情況下，隨著時間的推移，零價鐵被氧化形成氫氧化鐵導致PRB反應活性降低。然而，最近的研究表明，通過鐵還原細菌的生物強化作用有可能改善PRB性能（Van Nooten et al.，2008）。

相對于零價鐵對有機污染物的還原處理，高錳酸鹽是通常用于有機化合物的原位化學氧化劑，其有效pH值范圍寬，易于處理，而成本相對較低。高錳酸鉀能夠氧化多種有機污染物，如1，4-二氧雜環己烷、甲基叔丁基二甲醚、甲基乙基酮、爆炸物［如三硝基甲苯（TNT）］、農藥（如涕滅威和敵敵畏）、酚類化合物（如對硝基苯酚）和氯化物（如四氯乙烯）（Waldemer and Tratnyek，2005）。另外，最近的研究還表明，土壤中常見的錳氧化物（如水鈉錳礦）也可以氧化常見的污染物如抗菌藥物（如酚、氟喹諾酮類、芳香性的N-氧化物和四環素類）、雙酚A以及17α-炔雌醇（Lin et al.，2009；Zhang et al.，2008）。

1.2.2　微生物胞外呼吸——基于界面電子轉移的氧化還原過程

微生物胞外呼吸（extracellular respiration）是近年來新發現的在厭氧條件下微生物能量代謝的方式，指厭氧條件下微生物在胞內徹底氧化有機物釋放電子，產生的電子經胞內呼吸鏈傳遞到胞外電子受體使其還原，并產生能量維持微生物自身生長的過程。它是一種涉及電子在微生物細胞與胞外電子受體/電子供體之間傳遞的呼吸方式。從化學角度來看，微生物胞外呼吸本質上是一種由微生物介導的氧化還原過程。在理論方面，微生物胞外呼吸的發現為呼吸鏈電子傳遞、胞外電子轉移、能量產生途徑等科學問題提供了新的視角。在應用方面，微生物胞外呼吸在碳、氮、硫等元素生物地球化學循環、污染物轉化消減和微生物產電等方面發揮了積極作用（Lovley et al.，2004），表現出巨大的應用潛力。

1.2.2.1　微生物胞外呼吸菌

微生物胞外呼吸菌在環境中廣泛存在，人們已經在土壤、泥炭、污泥、湖泊沉積物、河流沉積物、海洋沉積物以及水體等環境介質中分離富集出了許多具有胞外呼吸功能的微生物。根據胞外電子受體的不同，微生物胞外呼吸菌主要分為腐殖質還原菌、異化金屬還原菌和產電微生物。除了常規微生物，許多極端環境微生物也具有胞外電子傳遞能力，如嗜熱菌、嗜酸菌、嗜堿菌等。按照對氧氣的需求，胞外呼吸菌又分為兼性厭氧菌和嚴格厭氧菌。胞外呼吸菌大部分集中在變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Acidobacteria）與厚壁菌門（Firmicutes）三個門。已發現的胞外呼吸菌種大多數為革蘭氏陰性菌，只有少數為陽性菌。產電微生物主要是人工馴化產生的，通過對各種沉積物進行電極富集培養實驗發現，大部分產電微生物菌種的16S rRNA基因序列與δ-變形菌（Desulfoarculus baarsii）的相似度可達76%～95%（Holmes et al.，2004）。目前報道的胞外呼吸菌的數量僅占自然界的極小部分，而且很多菌的功能機制還不完全清楚。隨著研究的不斷深入以及微生物分離方法和分子生物學方法的不斷完善，胞外呼吸菌資源將會持續不斷被發現和豐富。

有些微生物有多種胞外呼吸途徑的功能，例如希瓦氏菌屬（Shewanella）和地桿菌屬（Geobacter）。這兩種菌屬也是目前研究最深入和最系統的胞外呼吸菌，已經成為異化金屬還原菌群中的模式菌（Weber et al.，2006），而且希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）和地桿菌（Geobacter sulfurreducens PCA）的基因組已經全部測序完成（Heidelberg et al.，2002；Meth?? et al.，2003）。兩種微生物基因組的研究發現，在希瓦氏菌和地桿菌中分別有42個和111個與細胞膜相關的細胞色素c基因，但已經確定功能的細胞色素c只有幾種，大量的基因功能還不完全清楚，需要進一步探索。正是由于這些大量蛋白酶參與了無氧呼吸過程，使得微生物的胞外呼吸途徑研究變得非常復雜。

希瓦氏菌是兼性厭氧菌，較容易培養，在厭氧條件可以利用金屬氧化物［包括Fe（Ⅲ）、Cr（Ⅵ）、U（Ⅵ）、Mn（Ⅲ）及Mn（Ⅳ）礦物氧化物］、延胡索酸鹽、硝酸鹽、氧化三甲胺、硫酸二甲酯、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽以及單質硫等作為胞外電子受體（Myers and Nealson，1988），具有如此多樣的胞外電子受體是其他任何胞外呼吸菌所不具備的。地桿菌被認為是環境中最主要的鐵還原類群，可以利用有機物/有機污染物、乙酸鹽、H₂等作為電子供體，除了可以還原Fe（Ⅲ）外，還可還原重金屬（Williams et al.，2011）。

1.2.2.2　微生物胞外呼吸電子傳遞過程

（1）胞內電子傳遞過程

隨著希瓦氏菌屬全基因組序列的測定和分析，對胞內電子傳遞過程的認識已經深入到分子水平。胞內電子傳遞過程中的第一步是脫氫酶從電子供體脫下電子，傳遞給醌類中間體。胞內電子傳遞過程中的第二步是電子從醌類中間體傳遞給CymA（位于內膜多血紅素細胞色素c，是電子通過醌向周質傳遞的切入點）。胞內電子傳遞過程中的第三步是電子從CymA傳遞至周質細胞色素，目前已經發現的周質細胞色素主要是四血紅素黃素細胞色素（Ifc3）和四血紅素細胞色素（Cct）（Dobbin et al.，1999；Reyes-Ramirez et al.，2003）。胞內電子傳遞過程中的第四步是電子由周質細胞色素向外膜蛋白傳遞，目前發現鑲嵌在周質和外膜上的色素蛋白（MtrA，位于周質，是可溶性的細胞色素c，含有10個血紅素）是這一過程的主要電子受體，MtrA缺失將導致細胞與胞外電子受體之間的電子傳遞下降90%以上（Beliaev et al.，2001；Myers and Myers，2002；Pitts et al.，2003）。在還原可溶性電子受體時，與MtrA序列同源性較高的MtrD和DmsE可以部分代替MtrA，但還原不溶性電子受體時MtrD和DmsE則不能代替MtrA（Coursolle and Gralnick，2010）。胞內電子傳遞過程中的第五步是電子從MtrA向胞外傳遞，即外膜電子傳遞。盡管目前關于外膜電子傳遞的機制還不甚清楚，但有一個共同的認識是，無論是將電子直接傳遞至不同的電子受體或是傳遞至可溶性的電子穿梭體，外膜蛋白細胞色素c（OM c-Cyt）在這一過程中扮演著至關重要的角色（Lovley et al.，2011）。MtrB（非細胞色素，預測為跨膜蛋白）接受MtrA的電子，并傳遞給外膜的OmcA和MtrC（位于外膜表面，均為脂蛋白，每個多肽包含10個血紅素），后兩者通常被認為是希瓦氏菌胞外電子傳遞的末端還原酶，它們經常以2∶1的復合體出現。體外實驗表明，OmcA和MtrC單獨作用時也可以還原不溶性三價鐵，但二者結合后的復合體的電子傳遞能力遠大于單獨作用時的電子傳遞能力（Shi et al.，2006）。OmcA或MtrC的缺失都會導致產電量的大幅下降，但兩者共同突變不會導致產電的完全消失，表明產電過程中存在多種的電子傳遞機制共存的現象或者OmcA或MtrC并不是唯一的末端還原酶（Coursolle and Gralnick，2010）。地桿菌屬的胞內電子傳遞機制與希瓦氏菌屬類似，但在具體細胞色素類型上有所不同，一般認為地桿菌屬細胞質膜蛋白酶為MacA，周質蛋白酶為PpcA，外膜終端還原酶為OmcB、OmcC、OmcE、OmcS、OmcT與OmcZ（Inoue et al.，2010）。此外，在地桿菌屬細胞外膜上還發現一對了解不多但十分重要的多銅蛋白酶OmpC和OmpB，它們對Fe（Ⅲ）的還原和電子轉移到陽極都是非常重要的。

所有OM c-Cyt都呈現出類似的結構，由具有氧化還原活性的血紅素分子和氨基酸組成的肽鏈纏繞形成，其中血紅素的中心位置Fe軸向配位了雙組氨酸殘基接入肽鏈中（Clarke et al.，2011；Leys et al.，2002；Richardson et al.，2012；Shaik，2010）。這些具有氧化還原活性中心的蛋白位于細胞膜上，是電子從胞內到胞外的通道，這些蛋白中暴露于溶劑中的血紅素分子在電子傳遞過程中可能會直接接觸電子受體分子或界面，但其中的相互作用機制還有待研究。

Shewanella屬包含編碼為mtfDEF-omcA-mtfCAB的基因族（Coursolle and Gralnick，2010；Shi et al.，2007）。MtrA與MtrB組成了跨外膜的電子傳遞復合體，包括β-折疊的孔蛋白（MtrB）以及嵌在其中的十血紅素輔基細胞色素（MtrA）（Hartshorne et al.，2009；Ross et al.，2007）。MtrC則是一個胞外十血紅素輔基細胞色素，作為這個復合體的終端。MtrF、MtrD與MtrE分別是MtrC、MtrA與MtrB的同源蛋白。操縱子mfrDEF在生物膜的生長中呈現出最高表達（McLean et al.，2008），但是會在MtrCAB和MtrFDE之間形成雜化復合體（Bücking et al.，2010；Coursolle and Gralnick，2010）。OmcA蛋白是MtrC和MtrF的同源蛋白，能夠與MtrC或MtrF相互作用，從MtrCAB或MtrFDE復合體接受電子（Shi et al.，2006），也可以在ΔmtrC或ΔmtrF突變株中替代這些蛋白（Coursolle and Gralnick，2010）。

目前已經對其中外膜電子傳遞通道中的一種十血紅素輔基細胞色素（MtrF）進行了X射線晶體結構解析。根據這個結構模型，可以研究不同類型的胞內電子傳遞或解析可能的胞內電子傳遞發生機制。MtrF晶體結構的解析第一次確定了10個血紅素的空間排布構型，其中血紅素以一種獨特的交叉構型貫穿在四個結構域（Domains Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）中（Clarke et al.，2011）。這個結構可以為我們提供分子水平研究的可能性，用于分析胞外呼吸菌如何還原不溶性底物（如礦物）、可溶性底物（如黃素）以及與細胞表面不同氧化還原細胞色素終端之間形成的電子傳遞鏈（Clarke et al.，2011）。

根據MtrF的晶體結構，Richardson等（2012）提出了一種可能的外膜蛋白組成的電子傳遞通道復合體的分子結構，由MtrC、OmcA、MtrA與MtrB構成，其中MtrA是基于兩個五血紅素輔基NrfB單體末端相連組成的（Clarke et al.，2007），MtrC與MtrA嵌入孔蛋白的深度是未知的。目前實驗方法還無法研究蛋白內沿著血紅素組成的通道進行的電子傳遞，而高性能計算則可以從分子水平解析血紅素分子之間電子傳遞的熱力學和動力學性質（Breuer et al.，2014）。采用這些蛋白組成獨特的分子機器進行長距離的電子傳輸，轉移電子的距離可以超過100?（1?=10-10m，下同），這對于生物納米技術設備的設計具有明顯的科學意義。

雖然目前對于胞內電子傳遞過程已經有很充分的探索，但是對于該過程涉及的界面過程和控制因素仍然很不清楚，而計算化學可以為實驗結果提供充分而有力的證明與解釋，能夠為實驗研究提供有指導價值的成果。在電子傳遞過程中可以對電子給體分子與電子受體分子以及固相界面組成的體系進行量子化學計算（Vondrasek et al.，2005），可以獲得體系分子的電子結構與幾何結構信息，從而分析分子軌道能級、原子的電子密度分布、電子傳遞反應過程的熱力學和動力學性質（Zeng et al.，2009）。自然體系中的電子傳遞過程一般發生在水溶液環境中，而分子動力學模擬可以構建較大的模型體系，以考慮真實環境體系中水溶液中近程水分子的影響，分析分子間作用力以及離子或分子在液體或固體中的擴散。通過有效的預測可以揭示其內在規律性。理論計算可以得到實驗技術無法或者較難測定的物化性質。將計算模擬方法與精湛的實驗技術有效結合，能夠為研究提供更具優勢的工具，加快研究成果的實際應用。

（2）胞外電子傳遞過程

微生物胞外呼吸菌將細胞代謝產生的電子從胞內傳遞到細胞外膜后，可以通過直接接觸機制、納米導線機制、應電運動機制和電子穿梭機制將電子轉移給胞外電子受體（圖1-1）。

實際環境介質中，各種微生物以群落形式存在，在它們所形成的代謝及呼吸網絡中，上述各種電子傳遞機制將同時存在并相互協調。例如，非產電細菌可能會分泌某些電子穿梭體促進產電細菌的電子傳遞過程，而產電細菌的不完全代謝產物可能會為非產電細菌提供營養物質，細胞與細胞之間的納米導線也可能會促使細胞之間發生電子傳遞。

圖1-1中，①為好氧微生物的電子轉移途徑；②為硝酸鹽呼吸菌和硫酸鹽呼吸菌的電子轉移途徑；③～⑦為胞外呼吸菌的電子轉移途徑，其中③為胞外電子的直接接觸傳遞方式，④為胞外電子的應電運動傳遞方式，⑤為胞外電子的納米導線傳遞方式，⑥與⑦為胞外電子的電子穿梭體傳遞方式，⑥中的電子穿梭體在胞外環境介質中可移動，而⑦中的電子穿梭體在胞外環境介質中不可移動。

1）直接電子傳遞機制

直接電子傳遞機制是通過外膜上的活性蛋白將電子直接傳遞給電子受體，這類蛋白主要是末端還原酶和外膜表面黏性蛋白，目前研究發現希瓦氏菌屬和地桿菌屬多使用這種方式（Shi et al.，2006；Inoue et al.，2010）。微生物細胞外膜與電子受體的接觸是直接電子傳遞的前提條件，也是其限速步驟，任何與接觸蛋白有關的因子都會影響到直接電子傳遞的效率。直接電子傳遞機制與電子受體種類有關，例如，希瓦氏菌外膜終端還原蛋白OmcA或MtrC都可以還原核胞外的核黃素類物質促進產電，但在ΔmtrC突變株可以表現出與野生型相當的核黃素還原能力，由此認為OmcA在核黃素還原過程中起到主要作用（Coursolle and Gralnick，2010）。希瓦氏菌通過直接電子傳遞方式不僅可以將電子傳遞給可溶性的胞外電子受體，而且還可以傳遞給固相的胞外電子受體［例如Fe（Ⅲ）氧化物］，但與固相電子受體產生直接接觸的外膜蛋白主要是MtrC（White et al.，2013）。同時，研究還發現，只要有連續的電子供應，微生物就完全能夠在厭氧環境中通過直接接觸固相鐵礦物的方式維持生命（White et al.，2013）。理論上，在胞外直接電子傳遞的過程中會導致大量的胞外物質的產生，希瓦氏菌生物膜胞外物質主要以蛋白和多糖類等物質（Cao et al.，2011）為主，這些不導電物質的產生可能會阻礙生物膜細胞與電子受體的有效接觸，從而抑制直接電子傳遞過程。此外，直接電子傳遞方式與細胞生物膜的形成也存在密切關系，希瓦氏菌的直接電子傳遞方式所必需的細胞外膜色素蛋白在生物膜的形成過程中會顯著上調，其生物膜形成能力及其構成是影響直接電子傳遞的重要因素（Newton et al.，2009），也是一個容易被忽視的方面。

2）應電運動機制

某些微生物胞外呼吸菌可以將氧化底物所產生的電子儲存在細胞表面，形成所謂的生物電容器，然后通過接觸-傳遞的方式將電子轉移給胞外電子受體，或者通過細胞鞭毛瞬間觸及胞外電子受體的方式將電子釋放，并迅速脫離電子受體表面，參與下次循環的電子傳遞。這種電子傳遞機制與電子穿梭機制有著明顯的不同，無需電子穿梭體，是依靠微生物本身的應電運動方式傳遞電子。目前已經確定能夠產生應電運動方式傳遞電子的微生物主要是希瓦氏菌，包括MR-1、SB2B與CN32，尤其是MR-1更為突出。研究發現，三種希瓦氏菌ΔmtrA、ΔmtrB與ΔcymA突變株都無法通過應電運動方式向胞外電子受體傳遞電子，這說明細胞外膜蛋白MtrA、MtrB與CymA在應電運動電子傳遞過程中是必不可少的部件。然而，并不是任何情況下都能夠發生應電運動電子傳遞，合適的胞外電子受體才可以激發應電運動的發生，但這種應電運動又不同于微生物的趨藥性和趨電性。研究表明，當MnO₂和微生物燃料電池的石墨電極作為胞外電子受體時，只能激發很少一部分的希瓦氏菌以應電運動方式進行傳遞電子，而當加入可溶性的胞外電子穿梭體（例如AQDS）后，以應電運動方式進行胞外電子傳遞的希瓦氏菌數目將大大增加，從而加速了MnO₂的還原和增加了微生物燃料電池的電流，這是由于在這種體系下希瓦氏菌首先是將電子以應電運動方式傳遞給電子穿梭體，然后再通過電子穿梭體傳遞給最終受體，而可溶性的電子穿梭體可能比固相的MnO₂和電極更能夠激發應電運動的發生。不僅如此，可溶性的電子穿梭體也可以激發希瓦氏菌ΔmtrB突變株產生應電運動（Harris et al.，2009），但這與希瓦氏菌ΔmtrB突變株無法還原AQDS電子穿梭體（Lies et al.，2005）似乎是相矛盾的，關于其確切的原因目前還不甚清楚。

3）納米導線機制

納米導線（nanowire）電子轉移機制最初是在地桿菌G.sulfurreducens中發現的，它是指一定條件下微生物形成類似菌毛的導電附屬肢體，這種導電附屬肢體被稱為納米導線（Reguera et al.，2005），其作為電子導管可遠距離向胞外電子受體傳遞電子，從而克服了細胞表面無法與電子受體直接接觸的問題。通常情況下，納米導線的直徑只有3～5nm，長度是直徑的1000多倍，且非常耐用。除地桿菌之外，希瓦氏菌MR-1、光合藍綠菌中集胞藻（Synechocysti）和喜溫發酵菌（Pelotomaculum thermopropionicum）在一定條件下也可以產生納米導線（Gorby et al.，2006），表明納米導線不只是異化金屬還原菌的專屬物，而可能是細菌有效獲得電子的共同策略（見圖1-2）。希瓦氏菌納米導線與地桿菌納米導線在結構和組成上都存在差別，希瓦氏菌納米導線呈電纜狀，由多束更纖細的絲狀物組成一股較粗的菌毛狀結構，而地桿菌納米導線則是呈單根狀的表面附生結構，菌毛較細（Gorby et al.，2006）。然而，最近通過對希瓦氏菌MR-1活體細菌進行熒光測量、免疫標記以及定量基因表達分析，發現MR-1的納米導線并非是之前一直認為的鞭毛結構，而是細胞外膜和周質的延伸，而且同樣承載有CymA、MtrA、MtrB、MtrC和OmcA蛋白酶（Pirbadian et al.，2014）。

納米導線可以進入土壤和沉積物的納米孔隙，不僅有利于細胞吸附于不溶性電子受體表面，而且可以傳遞電子進行還原作用（Reguera et al.，2005）。原子力掃描隧道顯微鏡證明了納米導線具有較強的導電性能（Reguera et al.，2005），最近研究顯示細菌納米導線傳輸電子可達厘米級范圍，是細菌自身大小的數千倍（Malvankar et al.，2011），說明相對于其他電子傳遞方式，納米導線具有更優良的導電性。納米導線主要是通過類似金屬導電的形式或通過細胞色素間電子躍遷的形式進行傳輸電子（Malvankar et al.，2012）。前人研究發現細胞外膜蛋白OmcA或MtrC缺陷型的希瓦氏菌仍然可以產生納米導線類似結構，但不具有導電性（Gorby et al.，2006），表明OmcA或MtrC是希瓦氏菌納米導線傳遞電子所必須的，但關于其具體作用目前尚不清楚，有可能是參與的細菌納米導線的構成。研究發現培養于不溶性鐵氧化物的G.sulfurreducens可產生納米導線，而可溶性的鐵溶液中卻沒有此現象（Reguera et al.，2005），這顯示微生物納米導線的產生是可控制的。Reguera等（2005）對編碼納米導線蛋白亞組的基因GSU1496 進行了檢測實驗，發現當缺乏該基因時，G.sulfurreducens就不能產生納米導線且不再還原不溶性電子受體，由此可見，通過轉基因技術及環境誘導，使微生物長出納米導線是可能的。此外，細菌納米導線的導電性能還與環境條件存在密切關系，尤其是溫度，這可能是由于溫度過高會導致納米導線產生無序的結構（Malvankar et al.，2011）。

微生物納米導線還可以促進微生物燃料電池產電以及生物膜的形成，甚至可能形成細胞與細胞之間的鏈接及電子傳遞網絡。細菌納米導線的發現改變了微生物控制電子傳輸的傳統理解，有益于納米電子技術的應用發展，今后可從遺傳上修改細菌納米導線結構或合成不同功能的納米導線，應用于納米電子設備、微生物燃料電池、能源污染處理、微環境傳感器等領域（Malvankar and Lovley，2012，2014）。

4）金屬配位體增溶機制

金屬配位體增溶機制對于微生物異化金屬是非常重要的。Fe（Ⅲ）氧化物可與許多螯合劑形成鐵配位體，該配位體的存在：一是可以增加反應體系中Fe（Ⅲ）的生物可利用性；二是可以提高Fe（Ⅲ）與異化鐵還原菌直接接觸的概率，從而提高鐵還原的速率。Arnold等（1988）在研究希瓦氏菌SP200還原赤鐵礦的實驗中發現，加入等濃度的氮三乙酸（NTA），鐵礦物溶解速率可提高20倍。在腐殖質土壤中NTA促進Fe（Ⅲ）還原不是因為增溶鐵，而是因為NTA的加入增加了從土壤腐殖質向水溶液中的溶解，進而通過溶解性的腐殖質作為電子穿梭體來加速鐵（Ⅲ）還原。除NTA外，乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇二氨基乙酸（EDG）、六偏磷酸鈉（Calgon）、甲基亞氨基二乙酸（MIDA）與多磷酸鹽等螯合物也能夠促進Fe（Ⅲ）氧化物的溶解及還原（Lovley et al.，1996）。同時，自然界中也存在多種鐵螯合物，如麥芽糖醇與鄰苯二酚等（Dobbin et al.，1999）。另外，有些微生物能分泌螯合物，如高鐵載體（siderophores），它是微生物在缺鐵的情況下分泌到細胞外的低分子量有機化合物，可與Fe（Ⅲ）進行配位而增溶鐵。盡管上述這些螯合物改變了環境中鐵的存在狀態，促進了鐵元素及其他元素的循環，但它們在環境中也可能受到其他物質或微生物的影響，使其作用力損耗，限制了對不溶性Fe（Ⅲ）的還原轉化。

5）電子穿梭機制

上述各種電子傳遞方式只能在細胞與電子受體直接接觸或者納米級的距離內進行，而事實上，許多不溶性的電子受體的還原可在一定距離外進行，這暗示著微生物可以通過電子穿梭體物質還原不溶性電子受體。電子穿梭機制是指微生物利用自然環境中廣泛存在的腐殖質、植物根系分泌物、或細胞自身合成的電子穿梭體（Lovley et al.，1996；Marsili et al.，2008；Okamoto et al.，2013），接受胞內傳遞出的電子，并將其運出細胞，傳遞給胞外電子受體后，以氧化態返回細胞再次接受電子，如此往返穿梭于細胞與電子受體之間的電子傳遞（圖1-3）。

在環境中，細胞外的電子傳遞中介體被認為對可利用不溶性物質作為電子供體或受體的微生物是非常重要的（Watanabe et al.，2009）。一個典型實例是異化鐵還原菌，盡管十幾年前認為異化鐵還原菌必須直接接觸三價鐵氧化物才能將它們作為電子受體，但實驗證據已顯示，無論是自然存在的、還是自身分泌合成的電子穿梭體，在細菌細胞和三價鐵氧化物之間的長距離擴散上均可以通過電子轉移而有效解決上述的局限性（Hernandez and Newman，2001；Nevin and Lovley，2002），甚至很低的電子穿梭體都會對已知環境中的末端氧化劑的電子轉移產生顯著的影響（Marsili et al.，2008）。此外，最近基于動力學的研究已經發現，諸如地桿菌Geobacter sulfurreducens之類的異化鐵還原菌轉運電子至電子穿梭體（如環境濃度的腐殖質）的速率遠高于轉運至固相氫氧化鐵的速率（至少是27倍）（Jiang and Kappler，2008），由此表明電子穿梭體對于環境中異化鐵還原菌的能量代謝具有重要意義。此外，基于電子穿梭體的電子轉移過程在有機污染物生物修復、污水處理等環境治理方面也起到積極作用，例如胡敏酸作為常見的電子穿梭體，可以促進厭氧污泥高效去除苯酚和四氯化碳污染物（Martinez et al.，2013），核黃素通過促進電子傳遞可以加快環雜硝胺的降解。

（3）細胞間電子傳遞過程

微生物本質上來說并不會作為單純的培養物存在，而是與鄰近的細菌、古細菌及真核生物等共同參與各種相互作用和產生營養相互依賴性存在于生態系統中。微生物之間的互養共棲就是一種典型的營養相互依賴性的生存方式，其中兩種或者多種微生物之間會組合新陳代謝的能力，以降解那些單個微生物所無法獨立降解的特殊物質。兩個微生物合作伙伴之間通過共享電子的互養共棲對于各種產甲烷環境的生態功能運轉是非常重要的，例如在濕地、水中沉積物、儲油池以及將有機垃圾轉換成甲烷的厭氧分解池。微生物細胞間的電子傳遞被認為在微生物聚集體中起到了非常重要的作用，這些微生物聚集體可以通過還原硫酸鹽的方式來厭氧氧化甲烷。

細胞間電子傳遞最著名的策略就是H₂細胞間電子傳遞體，其中供電子的微生物會將質子還原產生H₂，而產甲烷菌則通過氧化H₂將二氧化碳還原成甲烷。在某些情況下，甲酸鹽會取代H₂作為細胞間電子傳遞體。在厭氧土壤、沉積物以及某些厭氧分解池中存在有豐富的依靠消耗H₂/甲酸鹽生存的產甲烷菌，這表明H₂/甲酸鹽細胞間電子傳遞體對于調控這些環境的甲烷生成起到了非常重要的作用。目前，在H₂供體微生物與H₂消耗產甲烷菌的混合培養研究中已經對H₂細胞間電子傳遞體做了詳細描述，而且對H₂產生及H₂消耗的生理學與生物化學過程也有較深刻的理解。

另外一種代替H₂細胞間電子傳遞體的機制就是細胞間直接電子傳遞。甲烷絲狀菌（Methanosaeta haurindacaea）是一種地球上最重要的產甲烷的微生物，其在混合培養中會直接接受來自地桿菌（Geobacter metallireducens）的電子，將二氧化碳還原成甲烷。有多個證據表明，甲烷絲狀菌在處理啤酒廠垃圾的厭氧分解池中也會參與細胞間的直接電子傳遞；在分解池的顆粒中也富含地桿菌種，其擁有類似于金屬的導電性能，這與地桿菌菌毛的導電性非常相似（Rotarua et al.，2014）。由此可見，在甲烷絲狀菌和地桿菌混合培養中，地桿菌產生的菌毛在細胞間直接電子傳遞機制中起到十分關鍵的作用，其主要是通過生物膜上的氧化還原輔因子所形成的碳-碳連接結構進行多級電子躍遷，從而實現電子傳遞（Nagarajan et al.，2013）。

乙酸產甲烷菌中的甲烷八疊球菌（Methanosarcina）也具有細胞間直接電子傳遞機制，它在產甲烷土壤、沉積物、煤礦、垃圾填埋場及厭氧分解池中也都有廣泛的分布（Hu et al.，2013）。研究表明，甲烷八疊球菌可以接受來自細胞外非生物表面體的電子（Kato et al.，2012），例如，甲烷八疊球菌（M.barkeri）會吸附到顆粒活性炭上接納電子，這種顆粒活性炭可以作為M.barkeri與G.metallireducens之間電子傳遞的中介體（Liu et al.，2012）。缺乏菌毛或與菌毛有關的細胞色素OmcS的地桿菌G.sulfurreducens突變體是無法在沒有顆粒活性炭的厭氧環境中進行細胞間直接電子傳遞，而在富含顆粒活性炭的情況下卻可以很好地進行細胞間直接電子傳遞（Liu et al.，2012），表明顆粒活性炭在細胞間形成了電子流通道。

1.2.2.3　微生物胞外呼吸與鐵（Ⅲ）還原

Fe（Ⅲ）可以被非生物還原，也可以被異化鐵還原微生物還原。Fe（Ⅲ）的還原會耦合Fe、C與S等元素的循環，這幾乎在自然界的所有環境中都會發生。

很多微生物都可以通過各類電子供體還原Fe（Ⅲ），如醋酸鹽、乳酸鹽和H₂。其中最常見Fe（Ⅲ）還原菌包括Geobacter spp.、Shewanella spp.、Albidoferax ferrireducens、Geothrix fermentans以及各類超嗜熱古菌（Lovley and Phillips，1988；Lovley et al.，2011；Myers and Nealson，1990；Obuekwe et al.，1981；Ramana et al.，2009；Coates et al.，1999）。Geobacter spp.是第一個被證明能夠通過短鏈脂肪酸、單環芳香化合物（如甲苯或者苯）或者氫作為電子供體的Fe（Ⅲ）還原菌（Lovley et al.，1987；Lovley et al.，2011；Zhang et al.，2013），將Fe（Ⅲ）礦物還原成含有混合價態的磁性礦物Fe₃O₄。

與發酵細菌一起，Geobacter spp.可以將有機碳完全礦化成CO₂，這在還原性環境中非常普遍（Lovley et al.，2011）。Geobacter spp.對由Fe（Ⅲ）礦物還原產生的Fe（Ⅱ）會表現出趨藥性行為，并通過這種方式找到Fe（Ⅲ）礦物源，然后利用菌毛吸附在礦物表面上（Childers et al.，2002；Meth?? et al.，2003）。除了還原Fe（Ⅲ）之外，Geobacter sulfurreducens還會在醋酸鹽存在的情況下，將N還原成NH₃的過程與Fe（Ⅱ）氧化過程耦合在一起（Coby et al.，2011；Meth?? et al.，2003）。

另外一種研究比較多的Fe（Ⅲ）還原菌是希瓦氏菌，尤其是S.oneidensis MR-1，它是于20世紀90年代被發現的（Myers and Nealson，1990），可以用氫、甲酸鹽或者乳酸鹽作為電子受體來還原Fe（Ⅲ）。

Shewanella spp.與Geobacter spp.的基因組序列信息有助于確定與Fe（Ⅲ）還原途徑有關的基因（Heidelberg et al.，2002；Meth?? et al.，2003）。來自細胞內分解代謝的電子會被轉移到細胞局部表面的c型細胞色素上，這些細胞色素可以催化細胞外電子轉移來還原Fe（Ⅲ）與Mn（Ⅳ）氧化物（Shi et al.，2009）。在S.oneidensis MR-1中，與外膜有關的c細胞色素MtrC、MtrF及OmcA被認為對綁定和還原Fe礦物都起作用（Donald et al.，2008；Reardon et al.，2010；Shi et al.，2009）。外膜細胞色素還會通過外膜乳蛋白-細胞色素復合物與細胞內醌池的呼吸電子之間建立聯系，比如說MtrA、MtrB與CymA（White et al.，2013）。MtrA與MtrB的同系物在很多變形菌門的微生物中都可以得到系統發育性地繼承保存，包括Shewanella、Geobacter與Rhodopseudomonas屬（Hartshorne et al.，2009；Jiao and Newman，2007；Shi et al.，2012）。很多地桿菌屬都會分泌細胞外細胞色素，例如G.sulfurreducens分泌的OmcS能夠與導電性的菌毛納米導線結合，從而可以調節納米導線上電流的傳導，或者作為還原Fe（Ⅲ）礦物的接觸點（Qian et al.，2010；Leang et al.，2010；Malvankar et al.，2011）。除了細胞色素之外，G.sulfurreducens還需要外膜乳蛋白OmpJ用于Fe（Ⅲ）的還原（Afkar et al.，2005）。盡管S.oneidensis與G.sulfurreducens在電子傳輸途徑上含有相類似的元件，但它們的功能是完全不同的（Shi et al.，2007）。此外，不同的Geobacter菌種似乎具有不同的細胞色素附件（Butler et al.，2010），這說明Fe（Ⅲ）還原所必需的電子轉移可以通過各種不同的生物化學途徑來實現。

由于Fe（Ⅲ）氫氧化物的溶解性很差，并且細胞色素之間電子能夠“躍遷”的最大距離只有2.0 nm（Gray and Winkler，2009），因此，理解Fe（Ⅲ）礦物的微生物還原一般都會涉及電子從微生物細胞向外轉移到Fe（Ⅲ）礦物的策略，而不僅僅是細胞-礦物直接接觸的策略（Hernandez and Newman，2001）。目前，有幾種機制可以被用來解釋電子從細胞轉移到胞外固體表面的過程，這幾種機制可以在微米、毫米甚至厘米級的距離上進行電子傳輸（Hernandez and Newman，2001；Nielsen et al.，2010；Shi et al.，2012）。在低Fe（Ⅲ）環境下，希瓦氏菌S.oneidensis會分泌具有氧化還原活性的電子穿梭體（例如黃素），搭建細胞與Fe（Ⅲ）礦物之間的電子傳輸（Marsili et al.，2008；von Canstein et al.，2008），或者利用Fe（Ⅲ）螯合劑，進而促進Fe（Ⅲ）作為電子受體（Nevin and Lovley，2002）。在Shewanella與Geobacter的胞外電子轉移中還會牽涉具有氧化還原活性的菌毛納米導線的產生（Gorby et al.，2006；Reguera et al.，2005）。此外，Shewanella與Geobacter物種也會通過外源的電子穿梭體的策略將電子轉移到遠離細胞所在位置的Fe（Ⅲ）礦物上（Lies et al.，2005；Rosso et al.，2003），這種電子穿梭體也是一種具有氧化還原活性的分子成分，例如硫化合物和腐殖質等天然有機物（Lohmayer et al.，2014）。

溶解性與固相腐殖質都可以刺激Fe（Ⅲ）礦物的微生物還原（Lovley et al.，1996；Roden et al.，2010）。該過程的第一步會牽涉微生物將電子供給腐殖質（包括胡敏酸和富里酸），第二步是還原的腐殖質通過非生物電子供給的方式將電子傳遞給Fe（Ⅲ）礦物。腐殖質的這種能力不只限于異化金屬還原菌，湖泊與海洋沉積物以及無污染與被污染的濕地沉積物中的發酵細菌、產甲烷菌和硫酸鹽還原菌也都具有將電子傳遞給腐殖質的能力（Benz et al.，1998；Cervantes et al.，2002）。因此，在無法采用微生物酶來直接還原Fe（Ⅲ）的情況下，基于腐殖質作為電子穿梭體的Fe（Ⅲ）非生物還原是一種促進生物地球化學鐵循環的重要途徑（Piepenbrock et al.，2014）。

在很多情況下，硫化合物可以從微生物膜傳遞出的電子，然后來實現Fe（Ⅲ）礦物的還原（Yao and Millero，1996）。在中性pH下，微生物還原后產生的H₂S可以通過非生物的方式來還原Fe（Ⅲ）氧化物，其還原速率取決于礦物質表面積以及pH值，而且還原速率還會與H₂S及Fe（Ⅲ）氧化物濃度之間表現出一階動力學關系（Yao and Millero，1996）。在海洋環境中，高濃度的硫酸鹽和元素硫的微生物還原會產生大量的H₂S，在這種情況下，H₂S與Fe之間的反應是非常重要的，因為該反應過程會將揮發性的H₂S形成沉淀形式的硫單質。因此，在某種程度上來說，鐵礦物可以通過防止H₂S從沉積物中揮發到上覆水中的方式來控制H₂S的分布（Canfield，1989；Thamdrup et al.，1994）。

1.2.2.4　微生物胞外呼吸在環境污染修復中的應用

人類活動產生的有機和無機污染物造成了大量環境問題。多數情況下，污染物的行為是由復雜的生物地球化學過程控制，而微生物群落則可以調節這些生物地球化學過程。胞外呼吸菌，尤其是異化金屬還原菌，其胞外電子傳遞過程是最近新發現的新型微生物厭氧能量代謝方式，它作為一種獨特的氧化還原過程，在污染物原位修復、污水處理以及清潔生物能源提取方面已經逐漸呈現出不可替代的優越性和重要的應用前景，因此近幾年來受到科學界的廣泛關注。

（1）有機污染物的氧化與還原降解

人類活動產生的有機物污染物通常含有芳香族化合物，而苯環的熱穩定性就使得這些污染物難以轉化，長期存留于環境中（Carmona and Díaz，2005）。大量有機物電子供體的異化作用會把氧氣作為電子受體而迅速消耗掉，從而形成厭氧環境（Carmona et al.，2009），這為Fe（Ⅲ）氧化物作為電子受體參與有機物的氧化提供了主要場所。經過對環境的現場檢測已證明，Fe（Ⅲ）還原時會促進有機物降解（Lyngkilde and Christensen，1992；Nielsen et al.，1995；Christensen et al.，2001）。最先被發現的能夠將Fe（Ⅲ）還原同時又可氧化芳香族化合物的單一菌屬是異化金屬地桿菌屬G.metallireducens（Lovley et al.，1989），這一菌屬是從烴類污染土壤中分離出來的，它可以利用Fe（Ⅲ）當作電子受體，從苯甲酸酯、甲苯、苯酚和對甲苯酚的氧化過程中獲得能量（Lovley and Lonergan，1990）。它還能夠將芳香族化合物礦化，產生CO₂，并產生極少的中間產物。對于硫還原地桿菌的基因組的研究，讀者可參考Wischgoll 等（2005）和Carmona等（2009）的研究。迄今為止還沒有研究顯示地桿菌屬某單一菌株能夠將Fe（Ⅲ）還原并氧化芳香族化合物（Butler et al.，2007），但仍有發現Geobacter hydrogenophilus和 Geobacter grbiciae兩種地桿菌同時存在時，兩者均可以將苯甲酸鹽氧化，后者甚至還可以氧化甲苯（Coates et al.，2001）。對剔除了地桿菌屬基因后的細菌進行純培養時，沒有發現其他菌屬具有將Fe（Ⅲ）還原并與芳烴氧化耦合的能力。最新的研究又分離出了兩種帶有這種新陳代謝特性的細菌，分別是Geobacter toluenoxydans和Desulfitobacterium aromaticivoran，其中后者是屬于革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌（Kunapuli et al.，2010）。

雖然目前發現的地桿菌屬能夠將Fe（Ⅲ）還原并與芳香族化合物氧化耦合的并不多，但在沉積環境中確實有豐富的地桿菌，而且其中大部分都具有Fe（Ⅲ）還原能力，說明這一研究還是有其環境意義的（Coates et al.，1996）。利用16S rDNA序列分析等微生物生態學技術，發現這些地桿菌對芳烴污染的土壤修復意義重大（Rooney-Varga et al.，1999；Roling et al.，2001；Staats et al.，2011；Snoeyenbos-West et al.，2000），說明利用這些細菌進行生物強化來促進生物降解，制定一個較好的生物修復方案是可行的。然而，目前存在的主要問題是，微生物如何接觸到固態的鐵氧化物（Lovley et al.，1994；Lovley et al.，1996）。Fe（Ⅲ）還原與芳烴氧化耦合的過程會產生活性較強的Fe（Ⅱ），例如最新的研究表明，地桿菌屬G.metallireducens氧化BTEX（苯、甲苯、乙苯和二甲苯）時所產生的Fe（Ⅱ），可以進一步介導酶污染物和硝基化合物的還原（Tobler et al.，2007），這表明，微生物還原Fe（Ⅲ）與芳烴氧化耦合過程可以將那些微生物無法直接利用的共存污染物進行降解（Tobler et al.，2007）。

如上所述，微生物還原Fe（Ⅲ）產生的Fe（Ⅱ）可以通過非生物電子交換反應還原轉換污染物。事實上，在工業生產以及污染物的化學修復中，Fe（Ⅱ）是很常用的還原劑（Charlet et al.，1998）。生物Fe（Ⅱ）通常是由含鐵的生物礦物產生，這些Fe（Ⅱ）或是存在于礦物結構中，或是吸附在礦物表面（Cutting et al.，2009）。已有實驗證明，Fe（Ⅱ）礦物參與了六氯乙烷的脫鹵和硝基氯苯的硝基還原（Elsner et al.，2004），還發現隨著鐵（Ⅱ）礦物成分不同，礦物表面的反應速率也不同，其中，鐵硫化合物較其他礦物反應速率會比較大。在地下環境系統中，磁鐵礦［也是由微生物還原Fe（Ⅲ）產生的］是一種很常見的物質，它能與污染物發生反應，這已經引起了許多關注（Gorski and Scherer，2009；Gorski et al.，2010）。Gorski等（2010）還發現，當磁鐵礦中Fe（Ⅱ）的含量增加，硝基苯反應速率和鐵礦合成的反應速率都會加快。McCormick和Adriaens（2004）將磁鐵礦應用到了CCl₄的轉化中，發現反應過程中約有47%的CCl₄經過脫鹵反應轉化成了CO₂和CH₄，但是關于CH₄的產生機理尚不明確。生物磁鐵礦與微量的菱鐵礦或某種含Fe（Ⅱ）物質相結合可以促進地下水中環三亞甲基三硝胺（RDX）的轉化，雖然生成量只占反應物的30%，但卻不斷有亞硝基的生成，并最終導致1，3，5-三甲基己羥基-1，3，5-三嗪的積累（Williams et al.，2005）。Borch等（2005）把纖維菌Cellulomonas sp.放在含TNT的基質中培養，并加入水鐵礦與電子穿梭體AQDS，實驗結果發現，基質中迅速產生了TNT還原產物，而且這些產物比親體分子更不易移動。

（2）重金屬的還原轉化

1）Cr（Ⅵ）的還原

Cr的氧化還原活性很強，環境中主要以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）兩種價態存在。在酸性和中性條件下，主要以Cr（Ⅲ）的形態存在，而在堿性和氧化性環境中主要以Cr（Ⅵ）的形態存在（Kimbrough et al.，1999）。環境中Cr（Ⅲ）主要以鉻氧化物的形式存在，通常與鐵結合形成鉻鐵礦或吸附在礦物表面，只有在酸性很強的條件下才能夠被溶解（Fendorf，1995）。Cr（Ⅵ）的存在形式有很多，主要有H₂CrO₄、HCr、Cr和Cr₂等，都是易溶物且不易吸附在礦物表面（Kimbrough et al.，1999）。

Cr（Ⅵ）是有毒的（Chen and Hao，1998），而Cr（Ⅲ）沒有毒性，還是糖脂代謝必需的營養物質（Wang，2000）。傳統的處理Cr（Ⅵ）污染物的方法就是化學還原為Cr（Ⅲ）氧化物，然后沉淀去除。由于Cr（Ⅵ）/Cr（Ⅲ）氧化還原電位較高，溶解氧對Cr（Ⅲ）的再氧化在動力學上是非常緩慢的（Rai et al.，1989）。盡管水體和土壤中存在錳氧化物可以再氧化Cr（Ⅲ），但這是一個溶解控制過程，且進行得緩慢（Rai et al.，1989）。

雖然微生物可以通過胞外呼吸途徑產生Fe（Ⅱ）或硫化物來間接促進Cr（Ⅵ）的還原，但研究發現微生物也可以通過直接電子傳遞方式來還原Cr（Ⅵ）。假單胞菌Pseudomonas dechromaticen和Pseudomonas chromatophila是最早被發現具有獨自進行酶催化還原Cr（Ⅵ）的能力（Romanenko and Koren’kov，1977；Lebedeva and Lialikova，1979），隨著不斷地研究，發現了更多的有此特性的細菌（Cervantes et al.，2007），大多為兼性厭氧菌。早期的研究普遍認為，細菌還原Cr（Ⅵ）的過程沒有能量的存儲（Ishibashi et al.，1990），但隨后就有研究指出，細菌在還原Cr（Ⅵ）的過程中也在不斷地生長（Tebo and Obraztsova，1998；Francis et al.，2000）。此外，一些從土壤和水體中分離出的真菌也具有還原Cr（Ⅵ）的能力，例如Aspergillus sp.N₂、Penicillium sp.N₃、Hypocrea tawa與Paecilomyces lilacinus（Barrera-Díaz et al.，2012）。

Cr（Ⅵ）的微生物還原機制因酶在胞內位置的不同而異（Cervantes et al.，2007）。細胞膜上的Cr（Ⅵ）還原與呼吸鏈及相關的細胞色素有關，然而細胞質中的Cr（Ⅵ）還原與黃素還原酶有關（Magnuson et al.，2010）。在厭氧環境中，假單胞菌Pseudomonas ambigua G-1和Pseudomonas putida以NAD（P）H為電子供體，通過溶解Cr（Ⅵ）還原酶將Cr（Ⅵ）還原。正是基于這些實驗研究，人們發現了越來越多溶解Cr（Ⅵ）還原酶也能夠還原Cr（Ⅵ），如ChrR和NfsA（Ackerley et al.，2004；Barak et al.，2006）。不同的酶其還原機制不同，NfsA在還原Cr（Ⅵ）時有兩個電子轉移（Ackerley et al.，2004），產生的中間產物Cr（Ⅴ）會加快反應進行，而且反應生成的活性氧物質（ROS）與Cr（Ⅵ）的毒性有關（Barak et al.，2006）。經過Pseudomonas aeruginosa還原Cr（Ⅵ）的蛋白質組學研究，發現ROS解毒蛋白的過表達產物確實能降低Cr（Ⅵ）的毒性（Kilic et al.，2009）。大腸桿菌的可溶性還原酶ChrR在氧化還原反應過程中有4個電子轉換，其中，3個電子用于將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），還有1個電子傳遞到了分子氧，由此限制了ROS的產生（Ackerley et al.，2004）。

一些專性厭氧菌還原Cr（Ⅵ）時會把Cr（Ⅵ）當作電子受體。硫酸鹽還原細菌是受到較多關注的微生物，因為它既能氧化乳酸又能還原Cr（Ⅵ），這與其還原硫酸鹽和鉻酸鹽機理相似（Lloyd et al.，2001）。硫酸鹽還原細菌Desulfovibrio spp.可以把氫氣作為電子供體，利用c-細胞色素與氫化酶將Cr（Ⅵ）還原（Lovley and Phillips，1994）。在電子轉移過程中，希瓦氏菌S.oneidensis可以利用MtrC和OmcA兩種細胞色素作為終端還原酶將胞外Cr（Ⅵ）還原（Belchik et al.，2011），而當去除相應的mtrC和omcA兩組基因后，細菌則不再還原Cr（Ⅵ），同時胞內Cr（Ⅲ）積累增加，胞外Cr（Ⅲ）減少（Belchik et al.，2011）。

將微生物對Cr（Ⅵ）的還原最終應用于微生物修復當中才是研究的目的。異位修復和污水處理系統的生物反應器均已實現了Cr（Ⅵ）的還原，這是由浮游細菌（Tripathi，2002）或是固定床生物膜上的細菌完成的（Konovalova et al.，2003）。Tripathi（2002）利用模式微生物P.aeruginosa A2Chr研究不同的生物反應器對Cr（Ⅵ）的還原，實驗得知，與浮游細菌相比，固定床生物膜上的細菌不易受到Cr（Ⅵ）毒性的影響，因此可以應用于高濃度的Cr（Ⅵ）污染環境中。在固定床生物膜上接種Bacillus spp.（Chirwa and Wang，1997）、硫酸鹽還原菌（Smith，2001）或是混合接種（Nancharaiah et al.，2010）等研究都證實了以上結論，且在好氧和厭氧環境下都適用，但是，在缺氧狀態下細菌對Cr（Ⅵ）的去除能力更強。

Cr（Ⅵ）污染的原位處理也是一項重要的技術，土壤或沉積物中都有土著Cr（Ⅵ）還原菌（Bader et al.，1999）。通過各種不同的手段刺激細菌的代謝，例如，向電鍍污染土壤中添加大豆胰蛋白酶、葡萄糖和礦物鹽，發現細菌不僅還原了Cr（Ⅵ），而且還刺激了二氧化碳轉化（Turick et al.，1998）。由于原位試驗的環境條件不易控制，因此微生物代謝活動經常不會處于最佳狀態，就大多數地下含水層來說，通常溫度較低且電子供體有限。極端的酸堿度也是影響Cr（Ⅵ）污染原位處理的重要因素，因為Cr（Ⅵ）主要存在于堿性環境中。最近，很多實驗研究從堿性環境中分離出了適應高pH值（通常pH 9～10）的Cr（Ⅵ）還原細菌，如Alkaliphilus metalliredigens（QYMF）（Roh et al.，2007），Burkholderia cepacia MCMB-821（Wani et al.，2007）和Halomonas sp.（Vanengelen et al.，2008）。對從不同的受Cr（Ⅵ）污染的樣品中分離出的Cr（Ⅵ）還原細菌進行混合培養（Jeyasingh and Philip，2005；Jeyasingh et al.，2010），發現混合培養的Cr（Ⅵ）還原細菌能夠將Cr（Ⅵ）完全還原。

2）汞的還原

汞的毒性取決于其價態，Hg（Ⅱ）毒性最強，Hg（0）毒性相對較小（Clarkson，1997）。受到最大關注的是甲基汞，這并不是因為細胞內的甲基汞進行脫甲基反應能生成有毒的Hg（Ⅱ），而是因為甲基汞更易移動（Morel et al.，1998）。

盡管自然界中汞的存在形態及其水平與許多化學過程有關（Jonsson et al.，2014；Zheng et al.，2013），但很多情況下降低或消除汞的毒性以及汞形態的轉化都是通過微生物進行的（Hu et al.，2013；Schaefer and Morel，2009）。汞的劇毒性以及自然汞事件的頻頻發生使得許多細菌形成了一套能夠解毒Hg（Ⅱ）的機制，包括細胞對Hg（Ⅱ）的吸收，胞內Hg（Ⅱ）被還原為毒性較小的Hg（0），最后基于高蒸氣壓和Hg（0）低溶解度被排出胞外（Barkay et al.，2005）。Hg（Ⅱ）是通過主動運輸進入細胞，這一過程需要一系列特定的蛋白參與，包括周質蛋白MerP和細胞質膜蛋白MerT、MerC、MerF和MerE（Barkay et al.，2003）。一旦Hg（Ⅱ）進入到細胞內，就可以通過氧化還原中介體（谷胱甘肽、半胱氨酸）或直接與蛋白酶MerA結合（Barkay et al.，2003）。蛋白酶MerA是一種醌氧化還原酶，可將Hg（Ⅱ）還原為Hg（0），然后經被動擴散把Hg（0）運到細胞外（Barkay et al.，2003）。在厭氧環境中，被胡敏酸還原菌還原后的胡敏酸可以明顯促進Hg（Ⅱ）的還原（Gu et al.，2011），說明Hg（Ⅱ）的還原會受到胞外呼吸過程的影響。

微生物對汞的解毒作用已經在污水處理試驗（Wagner-D?bler，2003）和水、土壤及沉積環境的原位修復中得到了應用（Saouter et al.，1995；Nakamura et al.，1999）。在處理氯堿電解廢水中，利用固定床生物反應器將污水中的Hg（Ⅱ）還原為Hg（0），然后反應器上密布的惰性載體（如浮石）和炭層過濾器會把流經過的Hg（0）吸附并固定（Wagner-D?bler，2003）。這種生物反應器上接種有耐汞微生物，主要是假單胞菌，這些細菌組成了一個厚的細胞生物膜和胞外多糖組織（Wagner-D?bler et al.，2000）。

汞污染土壤的原位生物修復也是一個重要的技術。Saouter等（1995）從Hg（Ⅱ）污染的湖泊中分離出耐汞微生物Aeromonas hydrophila KT20并進行接種培養，結果發現Hg（0）生成量有所增加。解毒蛋白mer的過度表達也有可能提高微生物對Hg（Ⅱ）的去除效率（Brim et al.，2000），但不幸的是轉基因微生物不能輕易的應用到環境中去（Lloyd et al.，2003）。Brim等（2000）還對防輻射細菌Deinococcus radiodurans展開了基因工程研究，并將其應用于修復放射性核素和汞污染的環境，這一菌株中帶有克隆的耐汞基因merA，即使在強輻射環境中也能夠將Hg（Ⅱ）還原為Hg（0）。此外，某些金屬還原細菌以及各種硫酸鹽還原細菌（King et al.，2000）也能代謝產生甲基汞，而且這還是缺氧沉積物中甲基汞的主要來源。

3）鈾的還原

U在環境中主要以U（Ⅳ）和U（Ⅵ）氧化物的形式存在。U（Ⅳ）氧化物可溶性差，而U（Ⅵ）碳酸鹽復合物的可溶性很強，如UO₂（CO₃和UO₂（CO₃（Clark et al.，1995）。將鈾還原可實現鈾的固定（Williams et al.，2013），這是一種重要的污染修復機制，能夠防止U（Ⅵ）遷移到地下水系統。

普遍認為在厭氧環境中鈾的去除是一種間接還原，而且會牽涉許多微生物胞外呼吸的過程（Newsome et al.，2014）。例如，Lovley等（1991）認為，微生物會產生Fe（Ⅱ）或硫化物等還原劑將鈾還原。他們還用醋酸鹽和H₂作為電子供體，研究異化金屬還原菌G.metallireducens和S.oneidensis對鈾的還原，發現兩種菌直接催化還原U（Ⅵ）的同時自身也在進行代謝生長。緊接著，又有學者通過培養硫酸鹽還原菌D.desulfuricans和D.vulgaris，也得出了與上述相類似的結論（Lovley and Phillips，1992；Lovley et al.，1993）。盡管在實驗中硫酸鹽還原菌無法儲存生長所需的能量，但U（Ⅵ）確實被迅速的還原為U（Ⅳ）。最近研究表明，在電子供體碳源供應充足的情況下，U（Ⅵ）的微生物還原與微生物量存在密切關系（Barlett et al.，2012a），地桿菌與硫酸鹽還原菌對還原U（Ⅵ）不存在競爭關系（Barlett et al.，2012b），表明兩種菌對還原U（Ⅵ）存在兩種相互獨立的機制。但無論如何，U（Ⅵ）的微生物還原速率比非生物還原要快，這暗示著微生物還原U（Ⅵ）可以被應用到環境污染修復中去（Holmes et al.，2015）。研究發現，微生物D.vulgaris在還原U（Ⅵ）的過程中，c3細胞色素起到了關鍵作用，這與Cr（Ⅵ）的微生物還原機理相似，而當用陽離子交換柱把電子傳遞蛋白從細胞的可溶性部分移除后，發現微生物就失去了還原能力（Lovley et al.，1993）。地桿菌G.sulfurreducens還原U（Ⅵ）的機理相對較復雜，因為在其細胞中有許多細胞色素，細胞周質（Lloyd et al.，2002）和細胞外膜（Shelobolina et al.，2007）中都有細胞色素，而且，最新研究還發現，胞外納米導線也參與了G.sulfurreducens對U（Ⅵ）的還原（Cologgi et al.，2011）。Jeon等（2004）用多種天然Fe（Ⅲ）氧化物、合成Fe（Ⅲ）氧化物探究其對G.sulfurreducens還原U（Ⅵ）影響，結果發現，有天然Fe（Ⅲ）氧化物參與時，U（Ⅵ）的還原速率大大降低了，這表明，在近中性環境中，水體中U（Ⅵ）可被還原去除，但在非還原性條件下，隨時間增長，會發生吸附解除（Ortiz-Bernad et al.，2004）。

Finneran等（2002）在新墨西哥州的一個鈾礦渣堆附近采集沉積物和水進行試驗，發現在厭氧條件下添加醋酸或葡萄糖可以加速U（Ⅵ）還原，15d內溶解性U（Ⅵ）濃度從10μmol/L降到1μmol/L以下。這一現象主要是由于微生物蛋白酶還原作用的結果，非生物還原劑Fe（Ⅱ）、硫化物和AQDS的添加并沒有對U（Ⅵ）的還原起到任何貢獻。在原位生物修復中，以乙醇作為電子供體時U（Ⅵ）的還原速率比添加其他電子供體時要快（Wu et al.，2006）。同樣針對科羅拉多州的一個鈾礦加工廠的鈾污染，Anderson等（2003）側重于含水層的U（Ⅵ）污染修復，對15個監測井的順梯度和控制井的反梯度進行了評估。結果發現，連續9d添加醋酸后，某些井中水溶性U（Ⅵ）的濃度從0.6～1.2μmol/L降低到0.18μmol/L，而且Fe（Ⅱ）含量呈現出增加趨勢。但50d之后，U（Ⅵ）的濃度又開始增加，Fe（Ⅱ）含量也開始降低。這一實驗說明，大部分生物質和地桿菌細胞對U（Ⅵ）污染修復與Fe（Ⅱ）的產生存在關聯。Anderson等（2003）推測，地桿菌主要負責U（Ⅵ）和Fe（Ⅲ）的催化還原，而后來U（Ⅵ）濃度的再次升高是因為在實驗點硫酸鹽還原菌進行硫酸鹽還原的活動占了主導作用。Vrionis等（2005）對U（Ⅵ）和Fe（Ⅲ）的催化還原效率最高的區域內生長的地桿菌進行16S rRNA基因序列分析，發現有一種菌的基因組序列編碼與地桿菌Geobacter bemidjiensis最相符，并在實驗前期占主導地位，而其他菌與地桿菌Geobacter lovleyi相符，但這些菌在實驗后期占主導地位。這些實驗現象說明了U（Ⅵ）原位生物修復的復雜性，并且也提示我們應該如何有效實施長時間的U（Ⅵ）原位生物修復。

1.2.3　電子穿梭體——微生物胞外呼吸的“催化劑”

電子穿梭體（electron shuttle）是具有氧化還原活性的化學物質，其主要功能是促進微生物胞外電子傳遞。一種優良的電子穿梭體應具備如下物理化學性質：a.電子穿梭體的氧化還原電位要在電子受體和電子供體的氧化還原電位之間；b.電子穿梭體具有較好的氧化還原特性，能夠實現氧化態和還原態之間的快速轉換；c.電子穿梭體結構穩定，且不參與細胞內的代謝過程；d.電子穿梭體不容易被細胞和電子受體吸附，具有一定的可溶性或導電性。電子穿梭體根據其來源不同可以分為人造電子穿梭體、天然電子穿梭體和內源性電子穿梭體。

1.2.3.1　人造電子穿梭體

人造電子穿梭體在生物電化學工程中的應用較多，常常在沒有電活性微生物的條件下用來嘗試降解復雜的底物。人造電子穿梭體降低了電子傳遞產生的過電勢，并且能透過細菌生物膜獲得電子。蒽醌-2，6-二磺酸鹽（AQDS）是目前最常見的人造電子穿梭體，其常被作為電子轉移機制研究中的模式電子穿梭體，它不僅能夠促使微生物持續產電，而且對于重金屬和有機污染物的微生物轉化過程具有重要的促進作用（Van der Zee and Cervantes，2009）。人造電子穿梭體在酵母微生物燃料電池中也是必不可少的，因為電子傳遞鏈位于細胞質線粒體中，而且通常情況下，像Saccharomices cerevisiae這樣的酵母不能產生內源性電子穿梭體。在一些電化學電池中，微生物細胞很難維持細胞活性，但引入人造電子穿梭體甲基紫精（methyl viologen），可以有效地將電子傳遞至微生物，使這類微生物可以在溶液中進行呼吸作用。

1.2.3.2　天然電子穿梭體

天然電子穿梭體主要包括腐殖質、半胱氨酸、生物炭、S0/HS-電對、中性紅、亞甲基藍等。

半胱氨酸在自然界中較常見，它是一種含有巰基的氨基酸，是血紅素蛋白、鐵氧化還原蛋白和紅素氧還蛋白等蛋白參與電子傳遞的必需氨基酸，也是一種微生物生長基質中普遍采用的還原劑。Kaden等（2002）發現，Geobacter sulfurreducens和Wolinella succinogenes共培養過程中半胱氨酸能夠在種間傳遞電子。此外，在純培養的Geobacter sulfurreducens中加入半胱氨酸可使胞外還原速率增加8～11倍。相比于普通的、可以形成未定Fe（Ⅲ）復合物的配位劑，半胱氨酸可以作為一種電子穿梭體增加微生物還原鐵的速率（Doong and Schink，2002；Liu et al.，2012）。此外，半胱氨酸作為電子穿梭體還可以間接提高微生物燃料電池的效能。

生物炭是由生物殘體在缺氧情況下經高溫慢熱解產生的一類富含芳香性和醌類結構的物質，其具有很強的氧化還原活性（Klüpfel et al.，2014），而且能夠參與環境中許多非生物過程的氧化還原反應。基于電化學方法的研究表明，每克生物炭能夠接受和供給數百摩爾電子，其具體數值因生物炭來源和炭化溫度的不同而異（Klüpfel et al.，2014）。實際上，生物炭不僅能夠參與和促進非生物的氧化還原過程，而且在微生物介導的氧化還原過程中也具有重要作用。Kappler等（2014）的研究表明，生物炭在5～10g/L的濃度下對于希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）還原水鐵礦的反應速率和反應程度均具有明顯的促進作用，但過低的生物炭濃度（<1g/L）則對水鐵礦的微生物還原起反作用，由此表明合適濃度的生物炭在微生物胞外電子傳遞過程中具有重要的電子穿梭體功能。進一步的控制實驗發現，生物炭之所以具有很強的電子穿梭體的功能并不是因為生物炭中可溶性部分的有機結構在起作用，而與生物炭本身的微粒性質有關（Kappler et al.，2014）。然而，這個研究只是在實驗室模擬中進行的，而在實際土壤等環境介質中，生物炭在礦物-微生物-生物炭聯合形成的網絡結構中是否還能夠發揮以及能夠多大程度發揮電子穿梭體的功能還有待于進一步探索。

硫是影響鐵的生物地球化學氧化還原過程的重要因素，特別是還原態的硫與鐵的反應活性更高（Lohmayer et al.，2014）。H₂S可導致Fe（Ⅲ）氧化物發生化學還原溶解（Afonso and Stumm，1992），并伴隨著Fe（Ⅲ）氧化物表面吸附物質的釋放。然而，H₂S并不一定是導致Fe（Ⅲ）氧化物還原必須存在的形態。很多硫還原細菌可以使用不同的氧化態硫作為電子受體，形成硫化物，從而促進Fe（Ⅲ）化學還原的發生和提高砷的移動性（Burton et al.，2013）。在硫代硫酸鹽濃度較低時，硫還原細菌Sulfurospirillum deleyianum可以將甲酸鹽氧化成CO₂，并伴隨著Fe（Ⅲ）還原成Fe（Ⅱ），由此推測氧化態硫與其相應的還原態硫構成的氧化還原電對可以很好充當電子穿梭體的角色。然而，目前還沒有鑒別電子傳遞至Fe（Ⅲ）這一過程中氧化形成的硫化合物，但是它們可能是硫或者硫代硫酸鹽。在堿性環境中，S0/HS-電對作為電子穿梭體可以明顯促進微生物還原Fe（Ⅲ）氧化物（Flynn et al.，2014），表明異化鐵還原菌與硫的微生物還原過程存在密切聯系（Friedrich and Finster，2014）。在三氯乙酸被還原為二氯乙酸的還原脫氯過程中，人們也評估了S0/S2-電對作為電子傳遞中介體所起的作用（de Wever et al.，2000）。另外，在缺氧呼吸過程中還發現了其他氧化還原電對可以作為電子穿梭體，如CO₂/甲酸、2H+/H₂、N/N、MnO₂/Mn2+（Schr?der，2007）。

1.2.3.3　內源性電子穿梭體

內源性電子穿梭體是微生物為了適應某種環境條件而分泌合成的有機化合物，目前已經發現的內源性電子穿梭體主要有黃素、吩嗪類物質、黑色素、苯醌類物質等。

（1）黃素

黃素分子主要以黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黃素單核苷酸（FMN）兩種形式存在，它們能夠催化細菌內部氧化還原反應。其中核黃素是FAD和FMN主要的氧化還原部分（Tan et al.，2012）。von Canstein等（2008）研究得出，很多Shewanella oneidensis能利用核黃素來介導不溶性三價鐵氧化物還原。Marsili等（2008）確證了Shewanella oneidensis MR-1和Shewanella oneidensis MR-4在序批式培養過程中能積累250～500 nmol/L的黃素，并且以這些黃素為可溶性電子傳遞中介體將胞外電子傳遞至處于氧化電勢的電極。在bfe基因（負責FAD運輸）缺陷型Shewanella oneidensis MR-1突變株的培養液中沒有檢測到黃素的存在，該突變株還原不溶性電子受體的能力也相應缺失，但向培養液中補充黃素后可以彌補這種還原能力的缺失；通過檢測Fe（Ⅱ）含量和電流大小證明了黃素對電子轉移能力的貢獻率可達75%，表明基于黃素介導的間接電子傳遞機制在整個電子轉移過程中起到重要作用。Shewanella oneidensis MR-1自身分泌的黃素作為外膜蛋白傳導電子的氧化還原輔因子，提高了OM c-Cyt轉移電子的能力（Okamoto et al.，2013）。全細胞的差示脈沖伏安法顯示黃素的氧化還原電位可逆地向正向移動了多于100 mV，這與微生物產電增加的現象是相符的。更重要的是，試驗結果表明，黃素/OM c-Cyt之間的相互作用是加速了通過半醌發生的一電子（one-electron）氧化還原反應，且反應速率相比于黃素的單獨作用快了103～105倍。這個機理雖然與之前描述的氧化還原媒介參與的電子傳遞機制不同，但是黃素/OM c-Cyt的相互作用同時調節了胞外電子傳遞的程度以及胞內代謝活動。

（2）吩嗪類物質

吩嗪類物質是γ變形細菌Pseudomonas sp.分泌的一類次生代謝物，功能基團是雜環結構，主要包括綠膿菌素、1-甲酰胺吩嗪、1-羥基吩嗪。吩嗪類物質的合成主要通過群體感應系統調節，群體感應系統通過調節phzA-G操縱子基因來合成1-羥酸吩嗪，然后1-羥酸吩嗪再合成其他吩嗪類分子。吩嗪分子具有與AQDS類似的功能，也可作為電子穿梭體。含氮雜環的吩嗪分子的電子傳導能力取決于親和的質子-電子傳遞過程，這與三元有機雜環的性質密切相關。但是，關于吩嗪如何參與多種電子傳遞過程的信息目前非常有限，尤其是吩嗪分子的吸電子基團與供電子基團特征，以及功能基團對電子轉移的影響至今仍不清楚。雜環上取代基的不同是吩嗪分子物理和化學性質不同的主要原因，據報道取代基的特點和位置主要決定了吩嗪分子的氧化還原電勢、極性和穩定性。

（3）黑色素

黑色素是在生物界普遍存在的一類羥基化聚合物，主要可分真黑色素、棕黑色素、異黑色素和膿褐素。該類物質具有的凝聚相物理性質使其具有導電性能，從而在微生物的電子轉移中起到了電子穿梭體的作用。通過對比去除希瓦氏菌algae BrY細胞膜表面黑色素和沒有去除黑色素的細菌，發現后者在還原含水氧化鐵時的速率是前者的10倍，推測希瓦氏菌MR-1可有效利用環境中的酪氨酸合成膿褐素，從而通過促進固態金屬氧化物的還原。

（4）苯醌類物質

苯醌除了被認為是天然有機物中的苯醌成分之外，許多微生物也能夠產生這類化合物，如希瓦氏菌產生的甲基萘醌（Hernandez and Newman，2001；Newman and Kolter，2000），灰黃鏈霉菌的Cinnaquinone滲出物（Glaus et al.，1992），以及希瓦氏菌分泌的黑色素中的奎寧功能基團（Turick et al.，2002）。隨著對可溶性電子傳遞中介體的關注，基于培養實驗來鑒定內源介體的研究已經成為人們研究的熱點。

1.2.4　土壤腐殖質——電子穿梭體的“聚合體”

1.2.4.1　土壤腐殖質的物質來源

土壤腐殖質的來源極為復雜，通常認為，植物殘體是土壤腐殖質的主要來源，其次是微生物殘體及其分泌物，土壤動物的貢獻最小（K?gel-Knabner，2002）。在陸地生態系統中，進入土壤有機質的數量、化學組成及其化學結構特征對控制土壤腐殖質的形成與轉化具有十分重要的作用（Kleber et al.，2007），不同來源的腐殖質在土壤中的命運是有差異的（Wiesenberg et al.，2008）。作為土壤腐殖質重要來源的植物殘體在化學組成上與微生物殘體、動物殘體存在嚴重的不同，就植物殘體本身而言，不同種類、器官、年齡的植物之間也存在顯著區別（竇森，2010）。

以往一直認為微生物殘體以及分泌物對土壤腐殖質的貢獻不超過5%，然而，由于缺乏有效的分析手段可能會使得估算土壤中微生物來源的腐殖質的相對貢獻存在很大的不確定性（Dalal，1998）。Clemmensen等（2013）采用碳同位素示蹤技術和分子技術對北方森林土壤碳的來源問題進行了評估，發現土壤中50%～70%的碳儲量主要是來自根系及與其共生的菌根真菌，尤其是在土壤根系密度較大的層位更為明顯，這顯然顛覆了以往一直認為的土壤腐殖質主要是來自地上部分植物殘體凋落物的認識。傳統上認為微生物殘體以及微生物分泌物不是構成腐殖物質的主要前體物，然而，基于最近對腐殖物質產生的新認識（Sutton and Sposito，2005），發現腐殖質是植物殘體和微生物殘體分解的中間產物的混合物質（Kelleher and Simpson，2006）。Simpson等（2007）通過對土壤有機質進行NMR分析，發現土壤中45%的腐殖質是微生物殘體或微生物分泌物貢獻的。由于黑色素具有與腐殖質相類似的結構組成，因此其通常被推測為腐殖質形成的前體物（Saiz-Jimenez，1996）。然而目前關于土壤中黑色素含量以及分解行為的研究較少，這主要因為黑色素的提取方法和分析技術還存在一定的困難。

1.2.4.2　土壤腐殖質的組成特征

腐殖質在化學上是不均勻的多功能有機分子，在土壤中主要與礦物通過相互作用交織在一起，其含有大量的活性官能團，不僅具有絡合金屬離子的能力，而且具有很強的氧化還原特性（Aiken et al.，1985；Stevenson，1994）。

由于來源和成巖作用的差異，不同土壤樣品腐殖質的化學成分及結構會存在很大的不同，因此無法利用一個統一的化學分子式來準確地對腐殖質進行描述。土壤腐殖質是由復雜的芳香及脂肪結構組成的大分子，這個大分子含有羥基、羧基、氨基、酚基等結構，可以通過紅外和核磁共振光譜確定這些結構（Stevenson，1994）。由于其化學結構的多變性，天然腐殖質一直都是按照其溶解性與分子量的標準進行劃分。腐殖質可以分為胡敏酸（humic acid，HA，也稱腐殖酸）、富里酸（fulvic acid，FA）和胡敏素（humin，HM），其中胡敏素具有比較高的分子量（20～100kDa，1kDa=103g/mol，下同），只溶于堿性環境下，富里酸具有比較低的分子量（0.5～5kDa），在所有的pH值條件下都可以溶解，胡敏素占的比例最大，在所有pH值下都無法溶解（Aiken et al.，1985；Stevenson，1994）。

與通過大分子結構來描述腐殖質特性不同，Piccolo（2001）、Sutton和Sposito（2005）以及Kleber和Johnson（2010）提出了一種新的概念模型來描述土壤腐殖質的結構。根據該模型，土壤腐殖質并不是由單個的大分子組成的，而是由各種有機小分子團通過疏水作用及氫鍵結合在一起形成的聚合體。當地球化學條件發生變化時，這些鍵會被加強或者減弱，進而引起結構性的變化，甚至會導致單個有機小分子與聚合體分離（Kleber and Johnson，2010；Sutton and Sposito，2005）。對腐殖質有貢獻的可以是各種類型的有機分子，例如脂肪酸、羧酸、乙醇、木質素、糖等，按照原有的腐殖質大分子結構的定義，這些有機分子甚至有可能都不是腐殖質的組成部分（Stevenson，1994）。然而，新的概念模型將這些有機分子作為腐殖質的組成部分（Kleber and Johnson，2010；Sutton and Sposito，2005）。

1.2.4.3　土壤腐殖質的形成機制

腐殖質的形成至今仍是一個謎，因為要研究探索的問題太重要、太復雜以至于出現腐殖質學或腐殖質研究的說法（Paul，2002）。目前對土壤腐殖質的形成機制有多糖-酰胺縮合學說、煤化學說、木質素學說、木質素多酚學說、微生物多酚學說、微生物合成學說、細胞自溶學說（包括植物和微生物）和厭氧發酵學說等多種學說（Stevenson et al.，1994；李阜隸，2003；竇森，2010），其中微生物合成學說、微生物多酚學說、厭氧發酵學說強調微生物的作用，木質素學說強調植物的作用，木質素多酚學說和細胞自溶學說同時承認微生物和植物的作用，煤化學說和糖-酰胺縮合學說則強調純化學反應的作用。在上述觀點中，核心問題是微生物是否參與或在哪個環節參與腐殖質的形成。不過從土壤學的角度，這種分歧的焦點更加具體，即微生物是否直接合成腐殖質或其前體成分。對此持肯定觀點的是多酚學說，對此持否定觀點的是木質素學說。在解釋腐殖質形成途徑時，通常認為幾種途徑可能在各種土壤中都存在，只不過各自所占比重不同。對腐殖質生成機理認識的差異，也影響到對胡敏酸和富里酸形成順序的推斷，按木質素理論是先形成胡敏酸，然后由胡敏酸裂解成富里酸；按多酚理論是先形成富里酸，再由富里酸聚合成胡敏酸，盡管也存在著直接形成胡敏酸的可能性，這意味著在對待腐殖質各組分的演化方向的問題上也存在著根本對立的觀點。此外，還有研究顯示，不同環境條件下胡敏酸和富里酸的形成順序也存在差異（Stevenson et al.，1982；竇森，2010）。目前我們只了解了腐殖化過程的一般輪廓，對于過程中的很多具體內容還有待于進一步的研究。

1.2.4.4　土壤腐殖質與類腐殖質的界定

以往很多關于腐殖質的研究有一個特點，像對待土壤一樣，把新鮮有機物料、有機肥或菌體本身，以及加入這些物質的土壤作為供試材料，把它們的堿提取液當成胡敏酸和富里酸，剩下的殘余物當成胡敏素。但事實上，這些提取物或殘余物未必就是真正的腐殖質（Bottomley，1915；熊田恭一，1981），而有些只不過是胡敏酸和富里酸的原始形態（科諾諾娃，1959），因此，我們不能僅僅根據暗色和溶解性來判斷提取物是否就是腐殖質，因此明確概念、統一方法和選擇判斷標準是研究土壤以外介質發生的暗色化現象與腐殖質生成機理的前提。人們對獲得的類腐殖質與土壤腐殖質的異同點進行了對比（熊田恭一，1981），但卻很少進一步論述異同點的判定標準。綜合各種指標是區分類腐殖質與腐殖質的主要手段，過去僅從外觀顏色或吸收光譜暗色物質定量來比較，后來用色調系數、相對色度、分解率、褪色率、E₄/E₆等，目前有條件使用更多的結構特征指標，如元素組成、數均分子量、官能團含量、活化度、紅外光譜、熒光光譜、紫外光譜、熱穩定性、核磁共振波譜、電子顯微鏡觀察等。

1.2.4.5　土壤腐殖質的分解與轉化過程

細菌雖然在自然界中分布很廣泛，且可以參與腐殖物質的降解，但其降解能力十分有限（Dehorter et al.，1992；Esham et al.，2000；Filip and Tesarova，2004）。相比而言，真菌具有較強的降解腐殖物質的能力（Qi et al.，2004），特別是擔子菌中的白腐真菌和凋落物降解菌。子囊菌降解腐殖物質的能力雖然不及白腐真菌和凋落物降解菌，但它對促進土壤中腐殖物質的降解與轉化方面仍有相當大的貢獻（Rezacova et al.，2006）。白腐真菌和凋落物降解菌是降解木質素的主要菌類（Hatakka，1994），然而，人們發現它們也能有效降解比木質素的結構更為復雜的腐殖物質（Hofrichter and Fritsche，1996；Gramss et al.，1999），這主要是由于它們所產生的非特異性的過氧化物酶（LiP）、錳過氧化氫酶（MnP）與漆酶（EC）能夠與腐殖物質上的芳香族基團發生反應。另外，其他種類的木質素降解酶，如GLX、纖維二糖脫氫酶（cellobiose dehydrogenase，CDH）、AAO、多功能過氧化物酶（versatile peroxidase，VP）以及細胞色素P450對腐殖物質的降解與轉化也起著十分重要的作用（Grinhut et al.，2007）。

白腐真菌和凋落物降解菌可以采取直接攻擊和介導性攻擊來降解與轉化腐殖質（Grinhut et al.，2007），然而關于其具體的機理過程以及降解產物的物理與化學特征還有待于進一步研究（Grinhut et al.，2007；Grinhut et al.，2011）。腐殖質的降解機理是一個復雜的過程，它與真菌種類、生態環境以及底物特征密切相關（Grinhut et al.，2007）。Dehorter等（1992）將來源于森林土壤的胡敏酸作為基底物質進行微生物培養試驗，發現盡管胡敏酸減少了30%，但13C-核磁共振（13C-NMR）的結果卻顯示胡敏酸的結構特征沒有發生明顯的變化。然而，在以褐煤的胡敏酸為基底物質來培養白腐真菌的試驗中，卻發現隨著胡敏酸的降解羧基官能團以及脂肪族碳鏈上的羥基與甲氧基官能團增多，而芳香基官能團則減少（Dehorter et al.，1992；Willmann and Fakoussa，1997）。

1.2.4.6　土壤腐殖質的穩定機制

（1）對分子結構決定論的新認識

將土壤腐殖質視為難降解有機物的觀點已經流行了很長一段時間（Stevenson，1994）。以往研究認為腐殖質是生物過程中自發產生的有機物質（Guggenberger，2005），因此它的分子大小與結構具有高度多樣性，進而導致土壤中沒有相應的特異性降解酶能夠對其進行降解（Hedges，1988；Stevenson，1994）。然而，有些研究卻認為腐殖物質的結構發生微小的變化都會導致微生物酶發生相應的變化，從而導致腐殖物質的分解成為可能（Sutton and Sposito，2005）。另外，Kelleher和Simpson（2006）通過NMR技術發現腐殖物質并不是一種化學特異性的有機物，而是一種由微生物和植物的生物聚合物結合而成的復雜混合物，而且生物聚合物之間結合力可能也僅是微弱的分子間作用力，例如疏水鍵和氫鍵（Sutton and Sposito，2005），這也表明了腐殖物質并非一種難以降解的有機物。

以往一直認為腐殖物質是土壤中穩定碳庫的主要組成部分，然而，許多學者通過原位直接觀測技術卻發現腐殖物質在土壤總有機質中僅占很小的一部分（von Lützow et al.，2006；Kleber and Johnson，2010），而用化學方法從土壤中提取出的胡敏酸類化合物可能是由燃燒產生的（Trompowsky et al.，2005），這對腐殖物質的形成是穩定土壤碳庫的重要機制也提出了質疑。最新研究表明，土壤腐殖質穩定與否主要是受微環境系統影響，而并不是由分子結構來決定（Schmidt et al.，2011），這一觀點對我們重新認識腐殖質在地球環境中的作用與意義提供了新的思路。

（2）物理保護機制

土壤腐殖質的物理保護機制主要是通過將腐殖質包裹在土壤團聚體與微小孔隙中來避免微生物的接近與攻擊（Sollins et al.，1996；Six et al.，2000）。盡管土壤中Fe、Al氧化物或氫氧化物通過非生物因素形成的網狀結構是一種重要的腐殖質包裹體（Mayer et al.，2004），但包裹腐殖質主要還是通過生物因素形成的土壤團聚體來實現（Oades，1993；Six et al.，2002）。土壤微團聚體相對于大團聚體具有更好的保護土壤腐殖質的功能（Six et al.，2004）。然而，許多研究發現，相對于粗粒組分，富含微團聚體的粉砂和黏粒組分具有更高的營養利用效率和更強的抵抗捕食者入侵的能力，因此具有更高的微生物多樣性（Selesi et al.，2007），這表明僅僅通過微團聚體具有排斥微生物攻擊的特性是不足以解釋土壤微團聚體是穩定腐殖質的重要場所的觀點（McCarthy et al.，2008）。計算機微斷層攝像技術是一種非破壞性觀察土壤微型結構的十分有利的手段，Peth等（2008）通過該技術觀察到土壤微團聚體中具有高度相互連接的微孔網狀結構。這種微孔網狀結構可以允許氧氣以及土壤溶液在其中自由傳輸，但其中的腐殖質由于被孔隙內壁所吸附或與礦物相互作用不能任意移動，因此，盡管土壤微團聚體中具有豐富的微生物種類，但由于微生物所分泌的酶被固定而無法發揮其應有的生理活性，從而使得微團聚體中的腐殖質能夠免受酶的接近而得到很好的保存。然而，目前這方面的研究還僅僅處于初步階段，關于土壤微團聚體的生物多樣性、酶活性以及微孔網狀結構之間的具體關系還有待于進一步探索。

土壤腐殖質嵌入層狀硅酸鹽黏土礦物的夾層中也是一種很好抑制微生物攻擊的方式（Kennedy et al.，2002）。盡管土壤中大分子腐殖質在結構上似乎要大于黏土礦物的夾層，但是某些腐殖質的可溶性與彎曲性可使其能夠很好地嵌入黏土礦物的夾層中（Schnitzer et al.，1988）。研究表明，嵌入蒙脫石夾層中的有機小分子化合物可發生構象變化，并且在Al3+或Fe3+的催化作用下可以進一步聚合成大分子的腐殖質（Kennedy et al.，2002），這對進一步加強腐殖質的穩定性起到了十分重要的作用。黏土礦物夾層中腐殖質的穩定性可能與同構置換有密切的關系，Tunega等（2007）研究發現蛭石與云母在層狀硅酸鹽結構的外表層具有豐富的同構置換，從而使其能夠形成十分穩定的層間有機分子。迄今為止，對黏土礦物夾層中腐殖質的分析仍缺乏十分有效的手段，對它們的結構與定量研究尚未有清晰的認識（Eusterhues et al.，2003），因此關于黏土礦物夾層腐殖質的穩定機制研究仍需要進一步探索。

（3）化學保護機制

土壤腐殖質與土壤礦物通過相互作用形成腐殖質-礦物復合體是防止土壤腐殖質分解的重要途徑（Kalbitz et al.，2005），其相互作用的方式主要有靜電作用（陰離子交換）、配位反應、疏水作用、范德華力、氫鍵、陽離子橋鍵、水橋以及熵變驅動的物理吸附等（Mikutta et al.，2007）。不同類型的礦物對土壤腐殖質的吸附機制不同，例如，Fe、Al氧化物礦物以配位反應為主，蒙脫石以陽離子橋鍵為主，而高嶺石則以范德華力為主，因此，根據這些結合力的大小，Fe、Al氧化物礦物所結合的土壤腐殖質具有最強的抵抗微生物降解的能力，蒙脫石次之，而高嶺石最弱（Mikutta et al.，2007）。通常情況下，土壤中腐殖質-礦物復合體的含量與Fe氧化物的含量呈正相關關系（Mikutta et al.，2006）。

許多研究認為，土壤腐殖質是以單層膜的形式連續分布在土壤礦物的表面，由此指出土壤礦物表面積大小可以用于指示土壤中固持腐殖質含量，即大的土壤礦物表面積有利于固持更多的土壤腐殖質（Wagai et al.，2009）。然而，也有許多報道稱土壤腐殖質是以斑塊的形式吸附在土壤礦物表面，指出土壤礦物表面積與土壤腐殖質的固持之間沒有必然的聯系（K?gel-Knabner et al.，2008）。由此可見，關于土壤礦物表面積與腐殖質的固持之間的確切關系仍需要進一步探索。

土壤腐殖質與金屬離子相互作用形成絡合物也是穩定腐殖質的重要機制，金屬離子對微生物的毒性作用以及金屬離子對胞外酶的鈍化作用可能是造成有機金屬絡合物具有更高穩定性的重要原因（von Lützow et al.，2006）。另外，絡合作用導致的腐殖質品質、分子大小、電荷以及空間結構的變化也可能對穩定腐殖質有一定的貢獻（McKeague et al.，1986）。此外，腐殖質與金屬離子形成絡合物沉淀在一定程度上也可以很好地避免微生物的攻擊，特別是對于大分子腐殖質更為普遍（Schwesig et al.，2003）。參與絡合作用的金屬離子主要有Ca2+、Al3+和Fe3+（Baldock and Skjemstad，2000）。許多研究都一致認為土壤腐殖質通過與Al3+、Fe3+相互作用能夠有效地提高其抗降解能力（Nierop et al.，2002）。然而，目前大部分研究結論都是基于間接的證據，對于金屬離子對腐殖質穩定性的影響還難以定量描述。

1.2.4.7　土壤腐殖質的電子穿梭官能團

土壤腐殖質同時具有接受電子和提供電子的功能，說明腐殖質可以參與氧化還原反應，不僅是酸堿可溶的胡敏酸和富里酸具有電子轉移能力，而且固相的酸堿不溶物胡敏素也具有一定的電子轉移能力（Zhang and Katayama，2012）。土壤腐殖質之所以具有很強的電子轉移能力主要是由于其結構中含有豐富的電子穿梭官能團。之前很多開創性的工作都是基于腐殖質對硝基芳香化合物還原的影響研究，研究結果顯示，腐殖質中奎寧能夠刺激氧化還原過程的電子轉移（Dunnivant et al.，1992；Tratnyek and Macalady，1989），說明奎寧具有電子穿梭功能。后來有很多證據都支持了這樣一個假設，那就是醌類是腐殖質中主要的電子穿梭官能團。電子自旋共振波譜分析直接證明了腐殖質中的醌基團是微生物還原過程中真正接受電子的官能團（Scott et al.，1998）。此外，基因的研究結果顯示，Shewanella oneidensis MR-1對奎寧和腐殖質的還原都是基于一個共同的生物化學過程（Newman and Kolter，2000），說明腐殖質確實存在與奎寧相類似的官能團。進一步的研究表明，在腐殖質和AQDS的微生物還原過程中，甲基萘醌是Shewanella oneidensis MR-1電子傳遞鏈的必不可少的物質，而缺乏合成甲基萘醌能力的突變體則無法還原AQDS與腐殖質（Newman and Kolter，2000）。通常情況下，腐殖質中的醌含量與腐殖質的電子轉移能力存在很好的一致性（Sposito，2011），這也說明了醌基團對腐殖質電子轉移具有很大的貢獻。還有報道顯示，從不同富含有機物環境介質中提取的各種胡敏酸，其電子轉移能力與其對應于醌基團的紅外光譜強度之間有著很強的聯系（Hern??ndez-Montoya et al.，2012），這間接證實了腐殖質中存在醌類的電子穿梭官能團。此外，Aeschbacher等（2010）采用電化學的方法對購買的各種腐殖質標準品進行了電子接受能力的測定，發現腐殖質標準品的電子接受能力與C/H摩爾比及芳香性之間都存在著線性關系，暗示著醌基團可能是影響這些氧化還原反應的主要因子，這與Ratasuk和Nanny（2007）所報道的結果相一致。綜上所述，醌基團是腐殖質中非常重要的一類電子穿梭官能團。

實際上，土壤腐殖質中的非醌官能團對其電子轉移能力也會起到顯著的貢獻。采用H₂/Pd反應體系和pH=8的實驗條件對腐殖質進行還原后，發現腐殖質在紅外光譜1360cm-1處會表現出與對苯二酚基團有關的光譜信號；相反地，采用H₂/Pd反應體系和pH=6.5的實驗條件對腐殖質進行還原后，卻發現腐殖質并沒有表現出對苯二酚的紅外光譜信號，但其芳香酮基團卻沒有什么變化（Hern??ndez-Montoya et al.，2012）。上述現象表明，在H₂/Pd反應系統中，pH=6.5時可以很好地規避腐殖質中醌基團的電子穿梭功能的有效性，這主要是由于在這種體系下醌會被質子化形成酚基（pK_a=9.9），從而阻礙了醌基團的電子轉移。Ratasuk和Nanny（2007）的研究表明在pH=6.5的情況下，采用H₂/Pd反應系統對胡敏酸進行還原后，結果發現這種胡敏酸并沒有失去電子轉移能力，仍然能夠促進檸檬酸鐵的還原，說明腐殖質中還存在其他非醌類的電子穿梭官能團。基于類似這種規避醌基團電子穿梭功能有效性的方法，人們對來自各種富含有機物的環境介質中的腐殖質樣品進行了分析，結果顯示，腐殖質中非醌類官能團占總電子轉移能力的44%～58%（Hern??ndez-Montoya et al.，2012；Ratasuk and Nanny，2007）。進一步的研究表明，在pH=6.5時，H₂/Pd反應系統對規避醌基團電子穿梭功能的機理是可逆的，許多微生物（例如地桿菌G.sulfurreducens）能夠同時還原各種腐殖質中的醌類及非醌類官能團（Hern??ndez-Montoya et al.，2012）。在這些腐殖質樣品中檢測到的具有明顯電子轉移能力的非醌官能團可能與含氮及含硫氧官能團有關，例如二甲基砜、3-甲硫基丙酸、n-甲基苯胺、1-甲基-2，5-吡咯烷二酮等（Fimmen et al.，2007）。此外，還有研究顯示，腐殖質中絡合金屬的氧化還原電對也會對腐殖質的電子穿梭功能起到一定的貢獻作用（Sposito and Struyk，2001），但這種作用可能相對較小。

目前很多相關學者為了更深入理解腐殖質在非生物的與微生物介導的電子轉移過程中所涉及的化學結構及氧化還原性質進行不懈努力。很多光譜與色譜分析技術都可以用于表征腐殖質的化學結構，其中最常用的非破壞性分析方法包括紅外光譜、紫外可見光譜、熒光光譜、核磁共振波譜、質譜及其相關技術、X射線技術、色譜層析技術（如凝膠電泳）等。然而，迄今為止，最有用的分析腐殖質氧化還原性質的方法主要是電子順磁共振波譜、X射線吸收近邊結構光譜、傅里葉轉換紅外光譜和熒光光譜，這些方法對揭示腐殖質的氧化還原狀態和氧化還原活性已經做出了許多貢獻。氧化還原狀態指的是氧化還原活性官能團被氧化或被還原的相對程度；而氧化還原活性則是指腐殖質接受或者提供電子的能力。盡管目前關于腐殖質氧化還原狀態和氧化還原活性的化學層面的研究取得了很大的進步，但是依然存在許多問題有待于進一步研究，以便更全面地理解和預測自然生態系統中腐殖質的生物地球化學行為以及工程系統中由腐殖質介導的氧化還原過程。