1.3金相顯微攝影與圖像分析

顯微照相是把所要研究的組織拍攝下來，以便較長時間地保存和研究。計算機技術、數碼技術及信息技術的快速發展為金相技術提供了更快、更好的新方法。傳統獲得金相照片的方法是在光學顯微鏡上加普通照相機，經過拍照（負片）—底片沖洗—底片晾干—相紙曝光—相紙沖洗—烘干—剪裁等大量耗時的暗室工作才能完成。現在借助于數碼技術與計算機技術，可采用普通光學顯微鏡+光學硬件接口+數碼相機+計算機+應用軟件包完成金相照片的獲取、自動標定、存儲、查詢、打印輸出等工作。這樣既取消了大量繁雜的暗室工作，又節省了材料，并使照片的保存、查詢、傳輸管理實現了計算機管理，操作上更加便利和輕松。

圖像分析技術（或圖像處理技術）由獲取圖像技術（即數碼照相或攝像）和圖像分析（即組織定量分析）兩部分組成。同時，人工組織定量分析（定量金相）也基本由圖像分析軟件完成。下面介紹顯微數碼照相及圖像分析技術，主要包括圖像處理、基于軟件的組織定量分析技術。顯微照相涉及照相時顯微鏡內光路與觀察時的光路差異和數碼圖像獲取兩方面的知識。

1.3.1 顯微攝影的技術要點

1.試樣的要求

與普通顯微觀察相比，對攝影試樣提出了較高的要求：一是樣品磨面上的磨痕及其他缺陷要盡量少或沒有。高倍攝影較低倍攝影時要求更高；二是試樣的浸蝕應均勻、適度。低倍攝影可稍深些，高倍攝影應淺一些。照片的反差不能靠深浸蝕法增加，否則會損失顯微組織的細節；三是試樣浸蝕后應立即進行攝影，以免表面污損減小反差。

2.濾色片的使用

顯微攝影時正確選用濾色片可以加強顯微組織襯度，吸收散射的藍紫光使遠景清晰等，因此濾色片是攝影時的重要工具。這里僅給出欲增加顯微組織（黑白）的襯度，使組織中某相變為暗黑色調時應選用的濾色片，見表1-10。

表1-10 根據需要增加襯度的相的顏色確定應選用的濾色片

3.敏感色片的使用

敏感色片與偏光的有效結合是得到彩色圖像的重要環節。在必要的時候選擇合適的敏感色片可以產生一些奇異的效果。

1.3.2 數碼照相系統

1.3.2.1 系統構成

數碼照相系統的一般配置如圖1-13所示，硬件部分由光學顯微鏡、計算機、圖像監視器、圖像復制機、攝像頭、計算機內載圖像采集卡、打印機等組成。軟件部分由一些專用的圖像分析軟件構成。系統中最重要的技術參數是攝像頭的像素指標，像素是指組成圖像的元素數。像素高低對采集的圖像質量起決定作用，攝像頭的像素越高，圖像的分辨率就越高。攝像頭的像素一般從幾十萬到幾百萬。金相照片一般選擇500萬以上像素的數碼相機來拍照。

圖1-13 數碼相機系統

a）數碼采集金相顯微鏡系統框圖 b）數碼圖像系統

1.3.2.2 工作原理

數碼圖像系統一般在Windows下運行，界面直觀，操作簡便；借助通用的Photoshop軟件或專用的軟件進行圖像采集及處理。工作原理主要是利用攝像頭通過專門接口與顯微鏡相連，把放大的試樣場像依次從復制機、計算機傳送到監視器上，同時利用計算機內載圖像轉換卡將模擬信號轉換成數字信號，由計算機的圖像分析軟件對圖像進行分析。

與傳統金相方法比較，數碼照相技術體現了以下特點：

1）多人同時觀察圖像。利用視頻監視器可多人觀察，金相分析更直接；而傳統方法在同一時間只能一人觀測。

2）圖像處理定量化。利用圖像分析軟件可以使原來用目測估計的視場得到具體量化的數據，使分析結構更具有科學性和客觀性，屬于定量分析，而大部分傳統金相分析為定性分析。

3）圖像保存信息化和高效率。利用計算機保存圖像文件，能夠保證圖像不失真和傳遞迅速，隨著互聯網的廣泛應用，可實現信息共享，傳統方法卻不易實現。

4）金相處理的經濟化。利用該系統進行圖像拍攝，減少洗相、印相所用的各種材料，可大大節省實驗經費，減少工作時間，提高工作效率。

1.3.3 數碼顯微攝影與圖像分析

數碼顯微攝影主要由從顯微鏡獲取圖像、圖像處理和圖像分析組成。自動圖像分析步驟見表1-11。

表1-11 圖像分析技術基本步驟

1.3.3.1 圖像獲取

圖像獲取是通過照相機或數碼照相機得到想要的圖像。因為可選擇的照相機類型很多，所以視頻顯微系統要有很好的兼容性。黑白或彩色模擬信號CCD照相機是最常用的設備。串口視頻（Y/C or S—Video）和合成視頻信號及其他類型的視頻信號如NTSC、PAL和SECAM都可以支持。圖像可以實時調整亮度、反差和色彩飽和度。模擬輸出的照相信號由一個模擬數字轉換器轉換成數字信號。數碼相機可以用SCSI或USB直接連接到計算機。

獲取的圖像可以按位圖或矢量模式保存。用于科學研究的圖像主要以位圖格式存儲，它由橫向和縱向像素點構成。當放大圖像觀察細節時，每一個單個像素點就變得明顯了。像素是圖像最小組成部分，也是計算機、打印機或顯示器顯示控制的基礎。在顯示器上的一副圖像是由成千上萬個像素構成，它們一個一個緊密地排在一起。

每一個像素在存儲時被存成一個或多個數據字節。如果圖像是單色的（黑白），那么一個字節就足夠存儲一個像素的信息了。如果圖像是彩色的或用不同的灰度級別來區分，那么更多的字節被用來儲存彩色和灰度信息。當使用灰度標準時，有256級灰度，從0開始到255，0代表黑，255代表白。圖像儲存時，同時儲存X和Y的位置和0-255之間的一個數字。對彩色圖像，有兩種最常用的色彩模式RGB和HLS，用來數字化其代表的顏色。每一個像素都要求存儲3個數據，特別是X和Y的位置，以方便重建圖像。同一像素密度的條件下，彩色圖像要比灰度圖像大得多。RGB模式基于三基色原理——紅、綠和藍，它們以不同比例混合就能得到不同的顏色。就像添加劑一樣，三個顏色一樣多時呈白色，三個顏色全無時呈黑色。三基色每個都用0-255的數值來劃分。每種顏色都是不同數值的三基色的綜合結果。例如，純紅是紅色255，綠色0，藍色0的結果；黃色是紅255，綠255，藍0的結果。該體系模型就像一個立方體，有三個單獨的方向，紅、綠和藍三色懸跨在空間。立方體對角線包含的亮度，換句話就是特別亮或暗即無色。HLS模式使用的是顏色、明亮和飽和。Hue是彩色色調。例如，一種腐蝕劑可能把不同的相染成同一色度的棕色或藍色。飽和是對色彩的一個補充，它描繪色彩的明亮或純度。明亮是用來描述光線的密度，看上去就如同灰度等級一樣，0代表黑，255代表白。

表1-12列出了一些通用的圖像字節深度與色彩的關系。表1-13列舉了9種不同顏色對應的像素數值。

表1-12 一些通用的圖像字節深度與色彩的關系

表1-13 9種不同顏色在色彩模式下的像素數值

解析度是圖像分析系統最重要的考核指標。數碼顯微鏡的解析度是指顯微鏡自身的分辨率和照相機的分辨率。清晰的數碼圖像必須依靠大量的像素來實現。通常像素從640×480到3840×3072，兩個數的乘積就是需要顯示該圖像的像素值。因為大的像素產生清晰的圖像，所以人們總是喜歡用最大的分辨率來捕獲圖像，其實沒有必要這樣做，因為這將需要大量的存儲空間，另外也不方便放在網頁上或電子郵件傳送，所以應根據目的選擇恰當的分辨率圖像。

為了進行測量，圖像或圖像源應首先經過尺寸校驗。校驗是利用已知指定的長度來計算像素數量。當使用光學顯微鏡時，這個操作是用載物臺校驗標尺來校驗的。每個物鏡都有唯一的校驗修正系數。如果不知道照相機的像素比例，那么可以通過同時校驗X方向和Y方向來加以確定。如果已經知道像素比例，那么僅校驗X方向就可以了。這種校驗方法對每一個物鏡或每一個放大倍率都要執行，該方法也可校驗由其他圖像源輸入的圖像。唯一的要求是要有一個已知大小尺寸的東西在圖像里，通常標尺是最好的選擇。

1.3.3.2 圖像凈化

圖像的凈化就是圖像的強化，主要通過灰度濾色片來實現。濾色片具有幾種功能：邊緣檢測、圖像強化、灰度修正。圖像的凈化主要是修正整個圖像的像素值，通過兩種方法來完成：調整反差和亮度的偏差或者與相鄰的像素進行比較。典型的相鄰尺寸正方形像素有3×3，5×5，7×7等，最明確的需求是提高局部（如相界）的對比反差。多數情況下，使用相鄰轉換濾色片造成更窄的灰度分布，從而使隨后的分析更容易。