1.2.1 放射免疫分析法測試人血清中的甲胎蛋白

1．實驗原理

放射免疫分析法首先基于抗原抗體特異性結合的原理。抗原與抗體結合會形成抗原-抗體復合物，當抗原被放射性物質標記后，便和抗體形成了“標記抗原-抗體”復合物。如果一個反應體系中既有標記抗原，又有非標記抗原，則兩種抗原會競爭性地與抗體相結合，生成的“標記抗原-抗體”復合物與非標記抗原的含量在一定范圍內成反比。實驗原理如圖1-6所示。

本實驗中，125I標記的人AFP抗原（?AFP）會與人血清中的AFP競爭性結合抗AFP抗體（如圖1-7所示），當反應體系中?AFP與抗AFP抗體（Ab）的量恒定時，形成?AFP-Ab復合物（此時結合態?AFP的量用B表示）的多少取決于體系中AFP（未被125I標記）的量，如果AFP多，則?AFP-Ab復合物生成量就少，游離?AFP（此時游離態?AFP的量用F表示）就多，反之亦然。如果分別測定?AFP-Ab復合物和游離?AFP的放射性強度，就可計算出結合態?AFP（B）與游離態?AFP（F）的比值（B/F），或計算出其結合率（B/T）（T為B與F的總和），這與標本中的抗原量呈函數關系。基于以上原理，預先用標準品AFP繪制標準曲線，進而通過對待測樣品進行檢測，從而根據標準曲線計算出樣品中AFP的含量。

2．應用舉例

（1）實驗儀器、耗材及試劑

①人AFP標準品。

②125I標記的人AFP。

③抗人AFP抗體。

④待測人血清樣品。

⑤生理鹽水。

⑥分離劑（可選擇抗人AFP抗體的二抗、聚乙二醇、活性炭等）。

⑦試管。

⑧加樣器。

⑨離心機。

⑩放射免疫測量儀。

（2）實驗步驟

①配置不同濃度（如0、1、3.0、9.0、27.0、81.0μg/L）人AFP標準品溶液各200μL，分別加入測定管（管1～6）中。每個濃度設定2個重復測定管。每管均加入100μL125I標記的人AFP和100μL抗人AFP抗體，充分混勻。

②標記好T管（總計數管）。T管中加入100μL125I標記的人AFP。

③標記好NSB管（非特異性結合管）。NSB管中加入100μL125I標記的人AFP和100μL生理鹽水。

④待所有管內加好溶液，置于4 ℃冰箱中孵育24h。

⑤向管1～6中加入分離劑500μL，室溫靜置15min。

⑥于3500r/min下離心20min，棄上清，用放射免疫測量儀測定沉淀的放射性強度。

⑦計算每個濃度的兩個重復測定管放射性度數的平均值并做記錄。第一管均值為B0，其余各管均值（B1～B5）均與之相比（Bn/B0）。以lg（Bn/B0）為縱坐標，標準品濃度的自然對數值（lnC）為橫坐標作標準曲線。

⑧取適量待測血樣，用生理鹽水稀釋10倍，設定2～3個重復測定管。每管中均加入100μL125I標記的人AFP和100μL抗人AFP抗體，充分混勻后，置于4 ℃冰箱中孵育24h。

⑨加入分離劑500μL，室溫靜置15min。

⑩于3500r/min下離心20min，棄上清，用放射免疫測量儀測定沉淀的放射性強度（Bx）。

?計算Bx/B0，并根據標準曲線求出待測血清中AFP的濃度。