1.2.1 放射免疫分析法測試人血清中的甲胎蛋白

1．實驗原理

放射免疫分析法首先基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理。抗原與抗體結(jié)合會形成抗原-抗體復(fù)合物，當(dāng)抗原被放射性物質(zhì)標(biāo)記后，便和抗體形成了“標(biāo)記抗原-抗體”復(fù)合物。如果一個反應(yīng)體系中既有標(biāo)記抗原，又有非標(biāo)記抗原，則兩種抗原會競爭性地與抗體相結(jié)合，生成的“標(biāo)記抗原-抗體”復(fù)合物與非標(biāo)記抗原的含量在一定范圍內(nèi)成反比。實驗原理如圖1-6所示。

本實驗中，125I標(biāo)記的人AFP抗原（?AFP）會與人血清中的AFP競爭性結(jié)合抗AFP抗體（如圖1-7所示），當(dāng)反應(yīng)體系中?AFP與抗AFP抗體（Ab）的量恒定時，形成?AFP-Ab復(fù)合物（此時結(jié)合態(tài)?AFP的量用B表示）的多少取決于體系中AFP（未被125I標(biāo)記）的量，如果AFP多，則?AFP-Ab復(fù)合物生成量就少，游離?AFP（此時游離態(tài)?AFP的量用F表示）就多，反之亦然。如果分別測定?AFP-Ab復(fù)合物和游離?AFP的放射性強度，就可計算出結(jié)合態(tài)?AFP（B）與游離態(tài)?AFP（F）的比值（B/F），或計算出其結(jié)合率（B/T）（T為B與F的總和），這與標(biāo)本中的抗原量呈函數(shù)關(guān)系。基于以上原理，預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)品AFP繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而通過對待測樣品進行檢測，從而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中AFP的含量。

2．應(yīng)用舉例

（1）實驗儀器、耗材及試劑

①人AFP標(biāo)準(zhǔn)品。

②125I標(biāo)記的人AFP。

③抗人AFP抗體。

④待測人血清樣品。

⑤生理鹽水。

⑥分離劑（可選擇抗人AFP抗體的二抗、聚乙二醇、活性炭等）。

⑦試管。

⑧加樣器。

⑨離心機。

⑩放射免疫測量儀。

（2）實驗步驟

①配置不同濃度（如0、1、3.0、9.0、27.0、81.0μg/L）人AFP標(biāo)準(zhǔn)品溶液各200μL，分別加入測定管（管1～6）中。每個濃度設(shè)定2個重復(fù)測定管。每管均加入100μL125I標(biāo)記的人AFP和100μL抗人AFP抗體，充分混勻。

②標(biāo)記好T管（總計數(shù)管）。T管中加入100μL125I標(biāo)記的人AFP。

③標(biāo)記好NSB管（非特異性結(jié)合管）。NSB管中加入100μL125I標(biāo)記的人AFP和100μL生理鹽水。

④待所有管內(nèi)加好溶液，置于4 ℃冰箱中孵育24h。

⑤向管1～6中加入分離劑500μL，室溫靜置15min。

⑥于3500r/min下離心20min，棄上清，用放射免疫測量儀測定沉淀的放射性強度。

⑦計算每個濃度的兩個重復(fù)測定管放射性度數(shù)的平均值并做記錄。第一管均值為B0，其余各管均值（B1～B5）均與之相比（Bn/B0）。以lg（Bn/B0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的自然對數(shù)值（lnC）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

⑧取適量待測血樣，用生理鹽水稀釋10倍，設(shè)定2～3個重復(fù)測定管。每管中均加入100μL125I標(biāo)記的人AFP和100μL抗人AFP抗體，充分混勻后，置于4 ℃冰箱中孵育24h。

⑨加入分離劑500μL，室溫靜置15min。

⑩于3500r/min下離心20min，棄上清，用放射免疫測量儀測定沉淀的放射性強度（Bx）。

?計算Bx/B0，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測血清中AFP的濃度。