實驗七　使用氨基酸分析儀測定蛋白質(zhì)含量

一、實驗原理

（一）氨基酸化學反應(yīng)原理

自然界中的氨基酸種類很多，但組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有20多種，從結(jié)構(gòu)式上來看，組成蛋白質(zhì)的氨基酸除甘氨酸以外，都有一個不對稱碳原子，即α-碳原子，α-碳原子有四個不同的取代基：COOH羧基、NH2氨基、H氫原子和R基團，不同氨基酸的R基團不同。氨基酸的R基團又稱為側(cè)鏈，由于不同氨基酸的側(cè)鏈不同，它們的相對分子質(zhì)量、解離程度、化學反應(yīng)、性能均不同。除甘氨酸外，每種氨基酸都有L-構(gòu)型、D-構(gòu)型。氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它們都能產(chǎn)生氨基與羧基的一般反應(yīng)，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸堿的中和反應(yīng)等。

（二）氨基酸分析檢測原理

茚三酮柱后衍生氨基酸分析檢測法是用水解的方法將蛋白質(zhì)的肽鏈打開成單一的氨基酸，利用氨基酸在低pH的條件下帶正電荷，在陽離子交換樹脂上依照堿性氨基酸結(jié)合力最強，芳香族氨基酸、中性氨基酸次之，酸性氨基酸結(jié)合力最弱的原則進行吸附。之后利用氨基酸分析儀設(shè)定的洗脫程序，采用不同離子強度、pH的緩沖液依次將氨基酸按吸附力的不同從樹脂上洗脫下來。被洗脫下來的氨基酸與水合茚三酮共同加熱后被氧化分解產(chǎn)生二氧化碳、氨和醛，茚三酮被還原。在弱酸性溶液中，還原茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合成藍紫色化合物茚二酮胺（圖1-7-1），該物質(zhì)在570nm處有最大吸收峰。同時脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在440nm處吸收峰最大。這些生成物在分光光度計中進行檢測。由于氨基酸標準液中各種氨基酸在氨基酸自動分析儀上被洗脫的順序一定、濃度一定、洗脫峰的面積一定，根據(jù)未知樣品中氨基酸洗脫面積與氨基酸標準液的洗脫面積的比即可推算出樣品中各種氨基酸的含量。

二、樣品準備

對樣品進行氨基酸分析之前，需要進行適合該樣品的前處理，前處理分為兩大系統(tǒng)，一個是由蛋白質(zhì)加水分解而得到氨基酸的分析法；另一個是以氨基酸及其有關(guān)聯(lián)的化合物為對象，對游離氨基酸的測定法。此外，原則上需用0.45μm的過濾器對樣品過濾。

（一）蛋白質(zhì)樣品的制備

用于全氨基酸測定的樣品，凡是以蛋白質(zhì)形式存在的都要進行水解處理，常用的水解方法有三種。

1.酸水解法　稱取蛋白質(zhì)樣品適量（100mg左右為宜）放入水解管中，加10mL、6mol/L的HCl，置于液氮或干冰中冷凍，然后抽真空至7Pa（＜5×10mm汞柱）后封口，將水解管放在110℃恒溫干燥箱內(nèi)水解22h。冷卻后，開管、定容、過濾，取適量的濾液置60℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器中抽真空蒸發(fā)至干，必要時可加少許水重復(fù)蒸干1～2次，加入樣品稀釋液將樣品稀釋到所需濃度，搖勻、過濾，待用。目前日本、歐洲和我國植物蛋白水解生產(chǎn)上采用的工藝均為酸水解法。該方法的優(yōu)點是HCl本身加熱可以蒸發(fā)除掉；缺點是溶液顯黑褐色，這是與含醛基化合物作用的結(jié)果。

2.堿水解法　稱取蛋白質(zhì)樣品適量（100mg左右為宜）置于聚氟乙烯襯管中，加1.5mL LiOH（濃度4mol/L），于液氮干冰中冷凍，然后將襯管插入水解管中，抽真空至7 Pa或充氮氣5min以上封管，然后將水解管放入110℃恒溫干燥箱，水解20 h。取出水解管冷卻至室溫，開管加入1mL濃度為6mol/L的鹽酸中和，用樣品稀釋液定容稀釋至所需濃度，搖勻、過濾，待用。該方法的優(yōu)點是水解液清亮，但存在放出氨氣和硫化氫等缺點。

3.酶水解法　酶是有機催化劑，它不需要高溫高壓，而是在常溫常壓下即可催化有機物質(zhì)的合成與分解。特點是水解條件溫和，無需特殊設(shè)備，氨基酸不受破壞；產(chǎn)物中除氨基酸外尚有較多肽類；此方法主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白肽。但一般水解時間長，而且不易水解完全。

（二）游離氨基酸樣品的制備

游離氨基酸的樣品在分析前必須進行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進行分析前建議使用18 C過濾柱處理一下。一般稱取1～2g樣品，加入0.1mol/L鹽酸提取液30mL攪拌提取15min，沉放片刻。將上清液過濾到100mL的容量瓶中，殘渣加提取液攪拌，重復(fù)提取兩次，再將上清液過濾到上述容量瓶中，用水沖洗提取液瓶和濾紙上的殘渣并定容搖勻，清液待用。

（三）生理體液樣品的前處理

生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)，獲得游離氨基酸。除去蛋白質(zhì)的化學方法如下：

1.苦味酸法　用1%的苦味酸沉淀，然后過18C柱子除苦味酸，再把氨基酸從柱子上洗脫下來進行分析。

2.三氯醋酸法　三氯醋酸即生物堿沉淀劑，醫(yī)院臨床生化常用此類試劑沉淀血漿中的蛋白質(zhì)。

（1）血液。

①把血液用7000～10000r/min（7000～10000 G）離心分離15min。

②在澄清液中加入5%～10%三氯醋酸，稀釋2～3倍。

③用7000～10000r/min（7000～10000G）離心分離15min。

④將澄清液作為樣品。

（2）尿。

①在原尿中加入1%三氯醋酸再稀釋2～5倍（由于有異常的尿有大量的氨基酸出來，所以要提高稀釋倍率）。

②有混濁時，進行過濾或者離心分離。

③得到的液體取0.05～0.1mL作樣品。

3.乙醇沉淀法　當乙醇加入含蛋白質(zhì)的水溶液中，可使蛋白質(zhì)表面失去水膜，并增大顆粒間的引力，引起蛋白質(zhì)沉淀。

4.磺基水楊酸法（常用的方法）用4%～10%的磺基水楊酸，按1:3的比例與樣品混合離心去蛋白，轉(zhuǎn)速20000r/min以上離心10min或更長時間，取上清液用樣品稀釋液稀釋后上機測定，建議進樣前用18C預(yù)處理過濾柱。

三、實驗儀器簡介

日立L8900氨基酸分析儀是采用經(jīng)典的陽離子交換色譜對氨基酸進行分離，并對蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行定性定量分析的儀器（圖1-7-2）。樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)過水解，其產(chǎn)物采用茚三酮柱后衍生法進行分離，分離出的單個氨基酸組分與茚三酮試劑反應(yīng)，生成紫色化合物，用可見光檢測器測量其在570nm的吸收光度（脯氨酸和羥脯氨酸在440nm測量），與標準溶液吸光度進行比較，即可計算出樣品中氨基酸的含量。氨基酸分析儀的檢測流程見圖1-7-3。L8900氨基酸分析儀具有分析時間短、靈敏度高、分離度高等特點，并且擁有氮氣自動鼓入和茚三酮回流保護裝置，同時采用高能量鹵素燈、消相差凹面衍射光柵，滿足儀器長時間測定工作的需要。可用于分析檢測樣品中蛋白水解氨基酸、游離氨基酸的種類及含量，廣泛應(yīng)用于食品、紡織等領(lǐng)域檢測。

四、實驗操作步驟（一）聯(lián)機

依次打開計算機、儀器主機電源，雙擊桌面的主機圖標，進入程序。在菜單欄中依次點擊“Contral”“Instrument Status”“Cornect”聯(lián)機，等待2min完成初始化。當Uninitialized變成Idle，各個組件可以進行控制。初始化完畢后，分離柱的溫度逐漸上升，分離柱的溫度會升到50℃。氨基酸分析儀初始化界面如圖1-7-4所示。

（二）編輯Sequence序列表

依次點擊“File”“Sequence”“Sequence Wirard”“Next”，根據(jù)需要填寫樣品序列存儲路徑、存儲方式、樣品個數(shù)及檢測重復(fù)次數(shù)等參數(shù)（圖1-7-5）。

點擊“Next”，出現(xiàn)圖1-7-6畫面，根據(jù)需要填寫測試樣品的起始位置、間隔、標準品的起始及樣品注入體積。

點擊“Next”，出現(xiàn)圖1-7-7畫面，根據(jù)需要填寫標準品存儲路徑、方式及個數(shù)。

點擊“Finish”，出現(xiàn)Sequence的列表。通過復(fù)制、編輯，最終將Sequence編輯完成，如圖1-7-8所示。注意此時，第一行是再生程序（RG），進樣體積為0，Run Type是Unknown；第二行是標準樣品，進樣體積為20；第三行起是未知樣，進樣體積為20，并保存Sequence文件。

（三）采集數(shù)據(jù)

點擊“Control”→“Single Run”→“Sequence Run”，運行程序。數(shù)據(jù)采集完后，機器自動進入清洗程序，清洗1h后自動關(guān)泵，關(guān)閉光源及柱溫箱。

（四）報告生成

依次點擊“Method/Custom Report”→“Open”→“Open Report Template”，打開報告書模板，選擇PH（small）、Srp作為例子，點擊Open按鈕。然后點擊定制報告書界面“Print”圖標，生成打印報告（圖1-7-9）。

（五）關(guān)機

點擊“disconnect”，斷開連接，然后依次關(guān)閉程序及主機電源。

五、實例分析

（一）檢測纖維或織物中氨基酸的含量

利用氨基酸分析儀，能夠簡單快速地對蛋白質(zhì)樣品的氨基酸種類及含量進行定性定量分析。常見氨基酸種類及簡稱見表1-7-1。本實例分析主要選擇家蠶絲為測試對象，分析樣品中的氨基酸含量與種類（圖1-7-10），并系統(tǒng)討論前處理條件對測試條件的影響與優(yōu)化。

表1-7-1　常見氨基酸種類及簡稱

1.樣品中的氨基酸濃度　每種儀器都有其比較合適的進樣量及進樣濃度，濃度過大或過小對分析結(jié)果都是不利的。過高濃度的絲素水解樣品注入儀器后會造成儀器管路的堵塞，容易污染柱子；過低濃度的樣品注入儀器后會造成個別氨基酸分離不好，影響定量分析的準確性。最好是在進樣前對樣品濃度進行預(yù)估算，將樣品濃度配到儀器要求的合適范圍。圖1-7-11是進樣濃度為氨基酸分離效果的影響。

2.緩沖液pH及鈉離子濃度　緩沖液的pH和鈉離子濃度對樣品中各個氨基酸的洗脫及分離起著重要作用，若pH和鈉離子濃度不當，會出現(xiàn)氨基酸出峰提前、錯后以及重疊現(xiàn)象。當緩沖液pH偏酸時，酸性氨基酸出峰時間會推后，造成丙氨酸與胱氨酸的峰重合，亮氨酸與酪氨酸分離度降低；當緩沖液pH偏堿時，酸性氨基酸出峰時間會前移，造成蘇氨酸、絲氨酸與谷氨酸，纈氨酸與蛋氨酸，酪與苯丙氨酸不能完全分離。當鈉離子濃度過低時，氨基酸出峰的峰形會加寬，出峰時間推遲；鈉離子濃度過高時，會造成氨基酸出峰太快，影響分離效果。實驗時應(yīng)以分離譜圖最佳為原則來控制緩沖液的pH和鈉離子濃度（圖1-7-12）。

3.氨　當緩沖液、樣品或流路系統(tǒng)中混入氨時，會使基線在堿性氨基酸出峰處被抬高，影響堿性氨基酸分離效果和定量的準確性。溶液中的氨主要來自離子水生產(chǎn)過程中混入的氨，以及試劑因等級不高而混入的氨。在分析過程中，當pH低時，混入的氨會被樹脂所吸附，隨著緩沖液pH的逐步升高，溶液中的氨再逐漸被洗脫下來，使賴氨酸、組氨酸、精氨酸分離定量的精確度受到影響。目前有些氨基酸分析儀為了解決流路中氨的問題，在自動進樣器前加一根除氨柱，用來吸附溶液中的氨，防止其在分析過程中被洗脫（圖1-7-13）。

4.茚三酮　茚三酮溶液的好壞直接關(guān)系著氨基酸出峰面積的大小，進而影響氨基酸分析結(jié)果的準確性。茚三酮反應(yīng)溶液如果長時間暴露在空氣中會被氧化失效，同時緩沖液中的溶解氧也會對茚三酮顯色效果造成影響，所以在配制茚三酮溶液時應(yīng)注意，要通入足夠時間的氮氣以排除溶解氧，而且試劑表面應(yīng)充滿氮氣保護，防止其暴露在空氣中被氧化而失效。

5.光源　由于反應(yīng)的氨基酸濃度不同，會與茚三酮溶液反應(yīng)生成深淺不一的藍紫色化合物茚二酮胺（DYDA）。氨基酸的濃度與DYDA的吸收度成線性關(guān)系，也就是說，吸收率反映氨基酸濃度的大小。當儀器的光源不佳時就會直接影響氨基酸定量分析的準確性，靈敏度也會降低。實驗過程中要及時檢查儀器光源的能量值，保證定量分析的準確性。

（二）辨別混紡織物的種類

通常動物纖維混紡類織物鑒別的方法是利用顯微鏡和掃描電鏡等儀器采用觀察法對纖維的主要形態(tài)特征進行辨別。但纖維的形態(tài)特征有時會因氣候、環(huán)境及處理工藝等發(fā)生變化，這就加大了纖維鑒別的難度。例如，在光學顯微鏡下就很難將羊絨纖維與經(jīng)絲光處理后的部分毛纖維進行區(qū)分。并且采用觀察法鑒別纖維主觀干擾較大，對檢測人員的經(jīng)驗要求也相對較高，難以準確定性分析。隨著氨基酸分析技術(shù)的發(fā)展，利用氨基酸分析技術(shù)定性定量分析不同纖維的特征氨基酸來實現(xiàn)對混紡織物鑒別的方法越來越受到研究人員的青睞。利用氨基酸分析儀就能夠快速簡便地對桑蠶絲和柞蠶絲進行區(qū)別。桑蠶絲素蛋白中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸的含量占氨基酸總含量的90%以上，其中甘氨酸含量最高，是桑蠶絲最主要的特征氨基酸（圖1-7-14）。柞蠶絲素蛋白中丙氨酸的含量最高，并且精氨酸、賴氨酸等氨基酸的含量也明顯高于桑蠶絲素蛋白中精氨酸、賴氨酸含量，以此作為柞蠶絲的特征氨基酸，利用氨基酸分析技術(shù)能夠有效地與桑蠶絲進行區(qū)別（圖1-7-15）。