實(shí)驗(yàn)六　使用圓二色光譜儀（CD）分析蛋白質(zhì)溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)

一、實(shí)驗(yàn)原理

（一）圓二色性

手性物質(zhì)對(duì)左右圓偏振光的吸收程度不同，出射時(shí)電場(chǎng)矢量的振幅不同。通過樣品后，再次合成的偏振光就不是圓偏振光，而是橢圓偏振光。圓二色性是研究分子立體結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的有力手段。在一些物質(zhì)的分子中，沒有任意次旋轉(zhuǎn)反映軸，不能與鏡像相互重疊，具有光學(xué)活性。電矢量相互垂直，振幅相等，位相相差1/4波長(zhǎng)的左和右圓偏振光重疊而成的是平面圓偏振光。平面圓偏振光通過光學(xué)活性分子時(shí)，這些物質(zhì)對(duì)左、右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生的吸收差值，就是該物質(zhì)的圓二色性。圓二色性用摩爾吸收系數(shù)差ΔεM來度量，且有關(guān)系式：ΔεM=εL-εR。其中，εL和εR分別表示左和右偏振光的摩爾吸收系數(shù)。如果εL-εR＞0，則ΔεM為“+”，有正的圓二色性，相應(yīng)于正Cotton效應(yīng)；如果εL-εR＜0，則ΔεM為“-”，有負(fù)的圓二色性，相應(yīng)于負(fù)Cotton效應(yīng)。由于這種吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此圓偏振光通過介質(zhì)后變成了橢圓偏振光。

圓二色性也可用橢圓度θ或摩爾橢圓度[θ]度量。[θ]和圓二色性用摩爾吸收系數(shù)差ΔεM之間的關(guān)系式[θ]=3300×ΔεM。圓二色光譜表示的[θ]或ΔεM與波長(zhǎng)之間的關(guān)系，可用圓二色譜儀測(cè)定。若儀器測(cè)定的是橢圓度θ，則存在ΔεM=θ/（33c·l）的換算關(guān)系。其中，c表示物質(zhì)在溶液中的濃度，單位為mol/L；l為光程長(zhǎng)度（液池的長(zhǎng)），單位為cm。

（二）圓二色光譜儀工作原理

圓二色光譜儀主要由光源、單色儀、起偏器、調(diào)制器、光探測(cè)器等單元組成。圓二色光譜儀一般采用氙燈作光源，調(diào)制器則受電壓信號(hào)控制，將平面偏振光調(diào)制成左、右圓偏振光。調(diào)制器輸出的光作為入射光照射在樣品上，如果樣品在此波長(zhǎng)下有圓二色性，那么透射光的光強(qiáng)也隨著左、右旋圓偏振光的交替變化而變化。光電倍增管把光強(qiáng)轉(zhuǎn)換為電流，也將變化的光強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)換為交流信號(hào)。這個(gè)交流信號(hào)的強(qiáng)度就反映了樣品在這個(gè)波長(zhǎng)下的圓二色性的數(shù)值大小，用θ表示，圓二色數(shù)值的單位是橢圓度。改變波長(zhǎng)λ，測(cè)量不同波長(zhǎng)處樣品的θ，就得到樣品的圓二色光譜。同時(shí)，測(cè)試時(shí)要通入氮?dú)廒s走管路中的水蒸氣和光源產(chǎn)生的臭氧，防止臭氧腐蝕反射鏡（圖1-6-1）。

二、樣品準(zhǔn)備

（一）溶液類樣品

把樣品加入分散性較好，并在測(cè)試波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有紫外吸收的溶劑中，加入一定光程的比色皿中，固定后置于樣品艙中等待測(cè)試。其中，需要注意溶劑和樣品濃度兩方面。

1.溶劑的選擇　在測(cè)試樣品時(shí)，首先要排除溶劑的紫外吸收對(duì)測(cè)試的影響，溶劑的最大吸收波長(zhǎng)要小于物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)。測(cè)試時(shí)一般選用高純水和光譜純的醇類溶劑。

2.確定溶液濃度的影響　一般吸收峰遵循朗伯·比爾定律：A=ε×l×c，其中ε為與波長(zhǎng)有關(guān)的吸光系數(shù)，l為光程，c為樣品濃度。圓二色光譜測(cè)量的是兩種圓偏正光吸收的差值（Δε=εl-εd）（εl為左圓偏正吸收系數(shù)，εd為右圓偏正吸收系數(shù)）。雖然朗伯·比爾定律表明CD信號(hào)與濃度成正比，但并不是濃度越高，CD信號(hào)越好。因?yàn)棣う胖捣浅Ｐ。瑵舛仍黾雍罂蓽y(cè)光的強(qiáng)度則減少，此時(shí)吸光度的微小變化則被噪聲掩蓋，而且噪聲值隨光強(qiáng)而變，光強(qiáng)越小噪聲越大，出現(xiàn)逆濃度效應(yīng)。所以樣品在測(cè)量CD以前一般先測(cè)量下UV/VIS吸收光譜，當(dāng)樣品的UV/VIS吸收值在0.5～1.0時(shí)，會(huì)得到比較好的CD數(shù)據(jù)。當(dāng)樣品的UV/VIS吸收值大于2.0時(shí)，將很難得到較好的CD信號(hào)。在波長(zhǎng)確定的情況下，理想的濃度對(duì)應(yīng)吸光度應(yīng)在0.8左右。

（二）固體粉末類樣品

1.溶劑分散法　把樣品加入分散性較好，并在測(cè)試波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有紫外吸收的溶劑中，充分超聲分散后，放入測(cè)試槽，加入攪拌子，在攪拌分散狀態(tài)下測(cè)試。

2.壓片法　樣品與惰性介質(zhì)（KBr或KCl）按一定的比例混合壓片，放入測(cè)試槽即可測(cè)試。

3.石蠟油混合法　樣品與適量的石蠟油混合研磨，均勻涂在石英片上。

4.成膜法　將樣品溶液滴加或旋涂在石英片上，待溶劑揮發(fā)成固體薄膜后檢測(cè)。在固體樣品的測(cè)試中，除單晶固體測(cè)試法外，其他幾種方法都需要找到合適的樣品與介質(zhì)混合的比例。當(dāng)比例太小時(shí)，CD信號(hào)有可能太弱；但比例過大時(shí)，吸收波長(zhǎng)會(huì)紅移并會(huì)出現(xiàn)逆濃度效應(yīng)，使CD信號(hào)失真。

（三）凝膠類樣品

有些高分子材料為凝膠狀，對(duì)于剛性較強(qiáng)的樣品只要涂在片狀比色槽里，即可測(cè)試。對(duì)于柔性高分子或超分子組裝體樣品可以加入比色皿中，把比色皿放入儀器，加熱到60℃，當(dāng)樣品融為溶液狀態(tài)時(shí)，再調(diào)節(jié)到室溫待樣品自組裝成較均一的凝膠狀后進(jìn)行測(cè)試。

三、實(shí)驗(yàn)儀器簡(jiǎn)介

本實(shí)驗(yàn)采用的是日本JASCO公司J-815圓二色光譜儀（簡(jiǎn)稱CD）。圖1-6-2為J-815儀器圖片及其光路圖，圖中，S1-S2：第一級(jí)單色器；S2-S3：第二級(jí)單色器；M：球面反光鏡；P：晶體石英棱鏡；L：透鏡；F：濾光器。常見配件包括PTC-423S/15變溫、Stop-flow停留、熒光光譜配件等。

該儀器具有高的掃描速度、廣泛的波長(zhǎng)領(lǐng)域，可以同時(shí)多通道測(cè)定。儀器有高亮度的點(diǎn)光源，色溫接近6000K。同時(shí)具有顯色指數(shù)＞95的高顯色性，能夠使儀器在整個(gè)壽命期內(nèi)維持光色特性；儀器具有熱重啟能力，且啟動(dòng)后即能達(dá)到接近最大光輸出；電弧光斑小、易聚光。

四、實(shí)驗(yàn)操作步驟

（一）開機(jī)

打開N2，等待N2打開5min后，打開主機(jī)電源，確認(rèn)聽見光柵移動(dòng)的聲音后依次打開水循環(huán)、電源開關(guān)和計(jì)算機(jī)主機(jī)。

（二）聯(lián)機(jī)

雙擊桌面“Spectra Manager”圖標(biāo)，進(jìn)入操作界面。雙擊J-815目錄下“Spectra Manag-er”，等待聯(lián)機(jī)完成（圖1-6-3）。

（三）參數(shù)設(shè)置

點(diǎn)擊“Specta Measure”，進(jìn)入General界面，點(diǎn)擊“Parameter Settings”，設(shè)置通道數(shù)、起始及結(jié)束波長(zhǎng)、掃描方式、掃描速度、靈敏度、光譜帶寬并選擇控制器（圖1-6-4）。

1.通道選擇　J-815可以設(shè)置三個(gè)通道，包括CD信號(hào)、HV信號(hào)、Abs信號(hào)。

2.波長(zhǎng)測(cè)量范圍選擇　J-815可測(cè)量的波長(zhǎng)范圍為163～900nm。一般先測(cè)量待測(cè)樣品的紫外吸收光譜，圓二色光譜的波長(zhǎng)檢測(cè)范圍一般可在有紫外吸收波段兩端再各加50～100nm。

3.數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔　在全譜掃描時(shí)，數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔通常選擇0.2nm；若掃描模式設(shè)置為[step]，數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔通常設(shè)置為1nm。

4.掃描速度　掃描速度一般隨響應(yīng)時(shí)間改變而改變。通常，測(cè)量時(shí)將掃描速度設(shè)置在20～100nm/min，響應(yīng)時(shí)間在0.25～2s。表1-6-1列舉了常見掃描速度與響應(yīng)時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

表1-6-1　常見掃描速度與響應(yīng)對(duì)應(yīng)表

5.光譜帶寬　標(biāo)準(zhǔn)操作時(shí)，光譜帶寬選為1nm。當(dāng)樣品的CD信號(hào)很小時(shí)，若想保持測(cè)試的CD信號(hào)，就需要足夠的樣品濃度及較寬的狹縫寬度。若采用高分辨率測(cè)量時(shí)則需要用較窄的狹縫寬度，但此時(shí)光電倍增管電壓較高，信噪比差。

（四）設(shè)置比色皿寬度

點(diǎn)擊“Cell Length”，填寫石英比色皿的寬度。高度均勻的熔融石英比色皿，不會(huì)帶來附加的圓二色性。為了降低溶劑對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，一般選用短光程、寬度為0.01～1cm的石英比色皿。

（五）基線校準(zhǔn)

點(diǎn)擊軟件操作界面上“B”，將裝有待測(cè)樣品溶劑的比色皿放入儀器中，關(guān)好艙門，進(jìn)行基線測(cè)試。

（六）樣品測(cè)試

基線校準(zhǔn)完成后，將樣品裝入比色皿中，表面擦干后，打開機(jī)器艙門放入比色皿，蓋上艙門。點(diǎn)擊軟件操作界面上“S”，進(jìn)行樣品測(cè)試。測(cè)試過程中，若HV信號(hào)值大于600 mV時(shí)，立即點(diǎn)擊“Stop”，暫停此次測(cè)試。取出樣品，重新調(diào)節(jié)樣品濃度及容量，重復(fù)上述步驟。測(cè)試完畢后，立即取出樣品，關(guān)好艙門，勿關(guān)氮?dú)猓▓D1-6-5）。

（七）數(shù)據(jù)傳輸

點(diǎn)擊“Measure”，進(jìn)入Data界面，在Send to Analysis目錄下選擇“Send Data to Spectra Analysis”，完成測(cè)試后將數(shù)據(jù)自動(dòng)發(fā)送到Spectra Analysis目錄，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理（圖1-6-6）。

（八）數(shù)據(jù)處理

單擊“Open”，打開剛剛測(cè)試完畢的圖譜，進(jìn)行譜圖分析。依次單擊“Processing”“Smoothing”進(jìn)行曲線平滑。依次單擊“Processing”“Peak Processing”“Peak Find”，進(jìn)行主峰尋找（圖1-6-7）。

（九）數(shù)據(jù)保存

右擊J-815目錄下的該文件，Save As保存原始文件及.txt文本。格式化后的U盤進(jìn)行數(shù)據(jù)拷貝。

（十）關(guān)機(jī)

依次關(guān)閉軟件、水循環(huán)、電源開關(guān)及J-815主機(jī)電源。通氮?dú)?min后再關(guān)閉氮?dú)狻?/p>

五、實(shí)例分析

（一）研究物質(zhì)的手性情況

圓二色光譜是與化合物的光學(xué)活性相關(guān)的光譜，可以提供許多分子的結(jié)構(gòu)信息。一方面，利用圓二色光譜儀可以對(duì)手性分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)CD信號(hào)值的不同可以判斷手性物質(zhì)為左旋或右旋，區(qū)別異構(gòu)體，也可以作為定性鑒定物質(zhì)的依據(jù)；另一方面，樣品的吸光度則與濃度成正比，可作為定量分析的參考依據(jù)。圖1-6-8是不同構(gòu)型的苯丙氨酸的CD光譜圖。從圖中可以看出，苯丙氨酸D型[圖1-6-8（a）]和L型[圖1-6-8（b）]的CD光譜圖有顯著區(qū)別，其中D型的CD值大于零，而L型的CD值小于零。利用CD圖譜，可以快速簡(jiǎn)便地辨別苯丙氨酸的構(gòu)型。

（二）鑒別物質(zhì)種類

不同波長(zhǎng)的CD譜能夠反映物質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)信息。190～240nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，主要反映肽鏈的結(jié)構(gòu)；240～330nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，能夠反映蛋白質(zhì)芳香族及二硫鍵結(jié)構(gòu)信息；330～750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，主要表現(xiàn)出血紅素、輔基及金屬離子的情況，這一波段CD譜常用于研究金屬離子的氧化態(tài)、配位體以及鏈—鏈相互作用；而大于750nm波長(zhǎng)的信號(hào)，主要是分子振動(dòng)的信息。如圖1-6-9所示，色氨酸在290nm及305nm處有精細(xì)的特征CD峰，酪氨酸在275nm及282nm有CD峰，苯丙氨酸在255nm、260nm及270nm有弱尖銳的峰。利用CD特征吸收光譜，可以簡(jiǎn)單便捷地對(duì)芳香氨基酸殘基中這幾種特征氨基酸進(jìn)行區(qū)別。

（三）研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

近幾年來，圓二色光譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。通過對(duì)遠(yuǎn)紫外圓二色光譜的測(cè)量，可以推導(dǎo)出稀溶液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而分析和辨別蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)類型；通過對(duì)近紫外圓二色光譜的測(cè)量和分析，可以推斷蛋白質(zhì)分子中芳香氨基酸殘基和二硫鍵的微環(huán)境變化，研究介質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)間的關(guān)系；通過測(cè)定實(shí)驗(yàn)參數(shù)和環(huán)境條件變化時(shí)的圓二色光譜，可以研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化過程中的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)特性。圖1-6-10為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)CD特征吸收光譜。