2.1　材料、儀器與方法

2.1.1　材料與儀器

鮮姜黃、干姜黃，產地為廣西南寧，經中南林業科技大學喻勛林教授鑒定為姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的根莖。鮮姜黃洗凈，切成1～2mm左右小塊備用，干姜黃粉碎并過40目篩備用。姜黃渣，由鮮姜黃經勻漿提取姜黃素后過濾、室內陰干所得。

TRACE GC-MS氣相色譜質譜聯用儀，美國Thermo-Finnigan公司；KQ-5200E超聲波發生器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀，鄭州長城工貿有限公司；AUY220電子分析天平，日本島津國際貿易有限公司；數顯恒溫水浴鍋，金山市大地自動化儀器廠；SHZ-D循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

石油醚（60～90℃）、乙醇等試劑均為分析純；實驗室自制蒸餾水。

2.1.2　方法

2.1.2.1　鮮姜黃、干姜黃和姜黃渣中姜黃油的化學成分研究

（1）鮮姜黃中水分含量的測試　依據《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2010版一部附錄Ⅸ H項水分測定中的烘干法測得鮮姜黃中水分含量為75.88%。

（2）鮮姜黃及干姜黃原料中姜黃油含量的測定　依據《中國藥典》2010版一部附錄Ⅹ D項水蒸氣蒸餾法測定鮮姜黃和干姜黃中揮發油的含量。具體如下：

①鮮姜黃中姜黃油含量分析。稱60g鮮姜黃塊于1000mL圓底燒瓶內，加入500mL水，連接水蒸氣蒸餾裝置并加熱，保持微沸至油量不增加為止，得姜黃油蒸餾物，經無水Na₂SO₄干燥后得姜黃油，備用。

②干姜黃中姜黃油含量分析。稱12g姜黃粉于500mL圓底燒瓶內，加入300mL水，連接水蒸氣蒸餾裝置并加熱，保持微沸至油量不增加為止，得姜黃油蒸餾物，經無水Na₂SO₄干燥得姜黃油，備用。

（3）干姜黃中姜黃油的提取

①水蒸氣蒸餾法。稱取一定量的干姜黃粉末置于揮發油提取器中，按既定固液比加入蒸餾水，保持水沸騰，提取一定時間后靜置30min，收集姜黃油，干燥后稱重，計算提取率。姜黃油提取率計算見式（2-1）。

　　（2-1）

②微波輔助水蒸氣蒸餾法。稱取一定量的干姜黃粉末，按既定固液比加入蒸餾水，設置微波發生器的溫度使水保持微沸，提取一定時間后靜置30min，收集姜黃油，干燥后稱重，計算提取率。

③超臨界流體萃取法。稱取一定量的干姜黃粉末，裝入料筒后置于萃取釜中，按梯度升壓、靜態預置等預處理工藝進行試驗，考察萃取溫度、萃取壓力、CO₂流量、萃取時間等因素對姜黃油提取效果的影響，并通過正交試驗優化超臨界萃取姜黃油的工藝條件。萃取過程中通過降低壓力和溫度使萃取物在分離釜中析出，收集后稱重，低溫保存備用，計算姜黃油的得率。

（4）姜黃渣中姜黃油的提取　鮮姜黃經勻漿提取姜黃素后，過濾后得到的姜黃渣中仍含有較多姜黃油，本試驗以石油醚為提取溶劑，利用超聲輔助提取法和索氏提取法對姜黃渣中的姜黃油進行提取，并比較二者的提取效果。

①姜黃渣中姜黃油的索氏提取法。稱20g姜黃渣，濾紙包裹后置于索氏抽提器內，加入300mL石油醚，在85℃下抽提6h。抽提液旋轉蒸發回收石油醚，得姜黃油，平行試驗5次。

②姜黃渣中姜黃油的超聲輔助提取法。稱20g姜黃渣置于500mL的錐形瓶中，加入200mL石油醚，提取30min，反復提取2次，過濾，合并提取液并旋轉蒸發回收石油醚，得姜黃油，平行試驗5次。

（5）姜黃油得率的計算

按式（2-2）計算姜黃油得率D：

　　（2-2）

式中，D為姜黃油的得率，%；M₁為姜黃油的質量，g；M為姜黃原料的質量，g。

2.1.2.2　姜黃油的分離純化與結構鑒定研究

（1）分子蒸餾工藝流程　利用超臨界流體萃取姜黃得到的萃取物成分復雜，其中包含精油、脂肪酸、油脂、少量姜黃色素、水分及固體物質。因此，必須對萃取物進行精制，分段收集，以達到綜合利用的目的。取姜黃萃取物，過濾，加無水硫酸鈉干燥后低溫保存備用。

MD-S80型刮膜式分子蒸餾設備屬于單級分子蒸餾設備，為獲得純度更高的產品，可以采用多級操作。如圖2-1所示，本試驗設計了單級分子蒸餾工藝用于脫色素和油脂，得到的姜黃精油類產品純度高；二級分子蒸餾工藝用于分段富集各精油成分，以得到一系列功能不同的姜黃油產品。揮發油的主要成分一般包括單萜、倍半萜及它們的含氧衍生物，其中含氧衍生物大多具有較強的生物活性及芳香性氣味。

其中蒸出物含量和蒸余物含量的計算見式（2-3）和式（2-4）。

　　（2-3）

　　（2-4）

（2）氣相色譜-質譜聯用分析　Thermo Finnigan TRACE GC-TRACE MS氣相色譜-質譜聯用儀，NIST標準譜庫。

色譜條件：色譜柱為RTX-5MS石英毛細管柱（0.25mm×30m，0.25μm），程序升溫，初始溫度80℃，升溫速率5℃·min^-1，終止溫度230℃。進樣口溫度250℃，進樣量0.2μL，以不分流方式進樣。載氣為高純He（99.999%），流速1.0mL·min^-1。

質譜條件：電離方式為EI，電子能量70eV，離子源溫度200℃，掃描范圍40～500amu。

2.1.2.3　姜黃油的抑菌活性分析

（1）菌懸液的制備　將試驗菌從4℃的冰箱中取出并接種于新鮮斜面培養基上，其中細菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基上，37℃恒溫培養24h，霉菌接種于PDA培養基上，28℃恒溫培養48h。恒溫培養活化后，從斜面上挑取兩環菌落置于100mL無菌水中，輕輕攪拌制成混懸液，用無菌水稀釋10倍后用血細胞計數板計數，確定菌液稀釋度，使最終的菌懸液中菌含量為每毫升10⁵～10⁶個，備用。

（2）抑菌圈的測定　按無菌操作方式將5mL培養基倒入無菌培養皿中，待培養基凝固后吸取0.4mL菌懸液置于培養基表面，用無菌涂布棒涂布均勻，再用無菌鑷子以無菌操作方式取出已浸泡2h的各溶液濾紙片，按培養皿的標號將濾紙片放入培養基表面相應位置。將培養皿置于培養箱中恒溫倒置培養：細菌于37℃下恒溫培養24h；霉菌于28℃下恒溫培養48h。培養結束，取出并測定濾紙片抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。

（3）最小抑菌濃度的測定　混菌法培養細菌的最小抑菌濃度的測定以有無抑菌圈為判斷標準。吸取菌懸液1mL置于直徑為8mm的無菌培養皿中，再分別加入9mL已融化的培養基，靜置凝固后制成含菌平板，將待測試劑用石油醚溶解稀釋成不同濃度，按上述條件進行培養，并觀察有無抑菌圈。