1.9　結合常數的測定

在溶液相中，一般用結合常數K_a（association constant或binding constant）和相應的自由能變化ΔG來表示氫鍵的穩定性。在分子識別研究中，一般需要定量研究的氫鍵都是多氫鍵體系，可以人為地用主體H和客體G表示形成氫鍵的兩個組分。對于結合計量比為1:1的體系，可以用方程式（1-2）表示結合過程，其K_a和ΔG用方程式（1-3）和式（1-4）表達。

　　 （1-2） 　　

　　 （1-3） 　　

ΔG^○=-RTln（K_a）　?。?-4）

一些文獻詳細介紹了結合常數的測定方法^{［33，34］}。早期發展的一些線性回歸方法都是基于一定的假設或近似。如Benesi-Hildebrand方程假設，加入的過量的客體（變量）的濃度等于沒有配合的游離的客體的濃度^［35］。由于計算機程序的普及，現在已經沒有必要再使用這些過時的方法^［34］，盡管這些近似方法仍然在文獻中經常被應用。目前廣泛應用的是非線性回歸方法。這些方法適用于所有通過非共價鍵作用力驅動形成的超分子體系，前提是結合在動力學上是快速的，能夠很快的達到熱力學平衡。因此，這些方法也適用于氫鍵驅動的結合過程。以下總結利用不同實驗技術測定結合常數的公式。

1.9.1　異體1:1配合物

對于由兩個不同組分形成的配合物，等溫滴定實驗是應用最廣泛的測定結合常數的方法。這種方法固定一個組分H（設為主體）的濃度，在保持溫度和體積恒定的條件下，滴加另一個組分G（設為客體），測定選定的一個探針Y_obs隨客體濃度增加的變化。對于核磁、吸收光譜（增強或減弱）、熒光（增強或猝滅）和圓二色譜滴定等，探針ΔY_obs對應于相應的化學位移變化（Δδ）、吸光度變化（ΔA）、熒光變化（ΔF）和圓二色譜信號強度變化（ΔA），該值無論增加或減小，皆取變化絕對值。把所取得的數據組代入到方程式（1-5），通過非線性回歸，即可獲得結合常數K_a和飽和配合物（主體全部轉化為配合物）的探針最大變化ΔY_max。在方程式（1-5）中，［H］為主體組分的固定濃度，［G］為客體（變量）的已知濃度。

　　 （1-5） 　　

等溫滴定量熱法（Isotherm titration calorimetry，ITC）提供了另一個高度靈敏和準確的方法，測定溶液相結合的熱力學參數。不同于上述波譜、光譜技術，一個系列的自動化的ITC實驗可以同時給出K_a、ΔG、ΔH和ΔS四個參數。在一個典型的滴定中，一定量的客體G的溶液加入到固定量的主體H的溶液中，釋放的熱通過溫度變化而測定，隨著客體的不斷加入，熱量釋放越來越少，最后趨于0而達到結合飽和。釋放的熱量總和對應于ΔH，而放熱曲線形狀作為主/客體比例的函數可以提供K_a，從而進一步導出ΔG和ΔS。由于量熱檢測的靈敏性，ITC能夠更直接更準確地獲取熱力學數據，特別是ΔH，并且避免了使用范特霍夫方程（van't Hoff's plot）帶來的ΔH隨溫度變化引起的誤差等。方程式（1-6）是相應的非線性回歸方程，其中Q（=［H·G］VΔH）代表釋放的總熱量，V代表樣品池的體積，［H］和［G］代表主體和客體的濃度。隨著客體溶液的增加，整個樣品體積會有所增加。但現代儀器能產生Q對［H］/［G］的相關圖，校正這一體積變化帶來的濃度變化。ITC能夠測量的K_a的范圍跨越5L/mol到10⁹L/mol，比通過核磁共振和吸收光譜方法測定的范圍廣，但利用ITC測定的前提是結合不能是焓中性的，即要有熱量釋放。

　　 （1-6） 　　

1.9.2　同體1:1配合物

對于同體配合物，即兩個相同分子形成的配合物，可以使用方程式（1-7）求取K_a。其中ΔY_obs和ΔY_max的含義同方程式（1-5）。利用核磁和熒光實驗測定相應氫鍵同體二聚體的結合常數較為常見。對于前者，ΔY_obs即為Δδ_obs，指某一濃度下的探針化學位移與未形成配合物的游離單體的探針化學位移之間的差值，大多選擇NH信號。確定游離的探針的化學位移是關鍵，其準確性決定了ΔY_obs的準確性。對于穩定性較低的二聚體（K_a<10⁴L/mol），不發生二聚的單體濃度相對較高，測定其探針的化學位移并不困難。但若二聚體的穩定性較高，單體濃度很低時仍有部分形成二聚體，則不能準確測定其位移，從而給K_a的確定帶來偏差。盡管可以使用外推法得到無限稀釋時的探針化學位移，但這一方法并不總是有效的。在這種情況下，可以選擇增加溶劑的極性，如在低極性的氘代氯仿中加入一定量的強極性的氘代二甲亞砜，降低二聚體的穩定性。還可以選擇其它方法，如熒光稀釋，其靈敏度更高，但需要在單體上引入熒光探針^［36］。如果在單體上引入探針，通過測定形成的二聚體內兩個熒光基團形成的激基締合物的強度隨濃度的變化，求取K_a值^［36］。在此，ΔY_obs為ΔF，即激基締合物的發射強度。

　　 （1-7） 　　

1.9.3　異體1:2配合物

若設想一個主體H和兩個客體G結合，形成1:2的配合物，其形成HG和HG₂的結合常數K₁和K₂由方程（1-8）和方程（1-9）表達。方程式（1-10）是核磁滴定實驗對應的非線性回歸方程，其中［H］是常量，滴定中濃度保持不變，Δδ_obs、Δδ_HG和分別是探針化學位移變化、配合物HG的探針化學位移變化和配合物HG₂的探針化學位移變化。Δδ_HG和通過非線性回歸求取。理論上存在著這樣的1:2配合物，通過核磁滴定可以求得K₁和K₂。對于這樣的三組分配合物，另一種常用的簡化處理方式是求取1:1配合物的表觀結合常數。即簡單地把主體濃度加倍，因為主體分子中存在兩個結合位點。

　　 （1-8） 　　

　　 （1-9） 　　

　　 （1-10） 　　

1.9.4　競爭實驗方法

利用核磁滴定或稀釋得到的氫鍵穩定的配合物的結合常數一般上限為10⁴～10⁵L/mol。對于結合常數更高的氫鍵配合物［HG_A，式（1-11）］，可以利用競爭方法測定，即引入另一個已知的結合常數較低的配合物［HG_B，式（1-12）］。這樣兩個氫鍵體系的K_a（A）和K_a（B）即存在式（1-13）的關系。如果單體和配合物的結合在核磁時間尺度上較慢，單體和配合物的探針信號可以分別出現，對其積分可計算出各自的濃度，從而求出K_a（A）。

　　 （1-11） 　　

　　 （1-12） 　　

　　 （1-13） 　　

　　 （1-14） 　　

　　 （1-15） 　　

　　 （1-16） 　　

若一個單體H可以與另一分子單體G形成異體二聚體HG［式（1-14）］，又可以形成同體二聚體HH［式（1-15）］。當其中一個二聚體的結合常數已知時，也可以通過類似方法求取另一個二聚體的結合常數［式（1-16）］。前提仍然是各個物種在核磁譜圖中產生可分離的高分辨的探針信號^［37］。當單體和配合物之間快速交換時，探針信號實際上是一個平均值或變寬乃至消失，上述方法即不成立。但對于配體-生物大分子相互作用，使用ITC的競爭方法已經確立^［38］。