2.3　熒光離子探針的響應機制

目前，熒光化學探針的響應機制主要有以下幾種：光誘導電子轉移（PET）機制、分子內電荷轉移（ICT）機制、熒光共振能量轉移（FRET）機制、激基締/復合物（Excimer/Exciplex）機制和剛性化效應等，現將這幾種常見機制分述如下。

2.3.1　光誘導電子轉移（PET）機制

在各種熒光離子化學探針主要的響應機制中，光誘導電子轉移（PET）機制是最常見的一種識別機理，是指電子給體或電子受體受光激發后，處于激發態的電子給體與電子受體之間發生了電子轉移。典型的PET熒光探針由三部分組成：能夠鍵合底物的識別基團、負責光能的吸收同時能產生熒光發射信號的熒光基團，以及把識別基團和熒光基團連接起來的連接基團。當識別基團為電子給體，熒光基團為電子受體時，具體PET工作過程為：在識別基團和被測物結合之前，在光激發下，識別基團將其處于最高能級的電子轉移給熒光基團空的電子軌道，導致電子無法直接躍遷回原基態軌道，從而發射不出熒光；當識別基團與底物進行結合后，給電子能力降低，光致電子轉移過程被減弱或者不再發生，熒光團中被光激發的電子就能夠直接躍遷回到原基態軌道，發射出強的熒光。熒光分子探針的PET作用機制可通過前線軌道理論來進行說明（如圖2.8所示）。Lippard等^［5］合成了二（吡啶-2-甲基）氨基為識別基團的Zn²⁺熒光化學探針（如圖2.9所示）。因為發色基團熒光素與識別基團氨基吡啶之間發生光誘導電子轉移效應，此時該體系幾乎沒有熒光，加入Zn²⁺后，由于識別基團上N原子上的孤對電子與Zn²⁺發生配位形成了絡合比為1:2的絡合物，導致N原子上給電子能力降低，使得發生在氮原子和熒光團之間的PET過程受阻，體系的熒光強度大幅度增強。實驗結果對此過程也進行了驗證，在加入Zn²⁺之后，化合物熒光增強了77倍之多。

2.3.2　分子內電荷轉移（ICT）機制

基于ICT過程的熒光分子探針通常由富電子基團（電子給體）和缺電子基團（電子受體）通過π鍵直接連接而成，它們之間存在推-拉電子作用，并且推電子基或吸電子基本身又作為接受體的一部分，和被分析物結合后受體的供電子部分或者拉電子部分的供拉電子能力發生改變，從而影響熒光或者吸收光譜的變化。其工作原理為（如圖2.10所示）：當底物為缺電子基團（陽離子）時，如果是與吸電子基團結合，將增大分子內電荷轉移的程度，導致熒光光譜紅移；如果是與供電子基團結合，由于孤對電子用于與陽離子形成配位鍵，將削弱分子內電荷轉移程度，導致熒光光譜藍移，如圖2.10（a）所示；當底物是富電子基團（陰離子）時，情況正好相反，如圖2.10（b）所示。一般情況下，ICT對熒光強度的影響不如PET的影響顯著。

基于ICT機制，Xu等^［6］合成的化合物成功地實現了對Cu²⁺的選擇性識別，結構如圖2.11所示。當Cu²⁺存在時，Cu²⁺與化合物中的氮原子發生作用，大大減弱了N原子的給電子能力，從而使得熒光光譜藍移了50nm。

ICT存在一類特殊情況叫做扭曲分子內電荷轉移（TICT）。TICT是指在具有推-拉電子能力共軛體系的熒光分子中，熒光基團通過簡單的單鍵與推電子基之間相連，當被光激發時，強烈的分子內光致電荷轉移引起原來與熒光團處于共平面的電子給體繞單鍵旋轉，而呈現出與熒光團處于相互垂直狀態，原來的共軛體系從而遭到破壞，形成TICT激發態，原有的由于分子內電荷轉移產生的熒光被猝滅。TICT激發態通常不發射熒光或者發射的熒光很弱，偶爾情況下ICT和TICT表現出雙重熒光現象。如圖2.12所示，化合物表現為雙重熒光，當探針冠醚與陽離子結合后，發生了TICT，此時的長波發射強度減弱，甚至消失，以此也能顯現對陽離子的識別^［7］。

2.3.3　熒光共振能量轉移（FRET）機制

兩個距離很近的熒光分子之間發生的能量轉移機制是熒光共振能量轉移（FRET）機制。它是指當一對合適的能量給體分子（Donor）和受體分子（Acceptor）相距一定的距離（一般為2～5nm），同時給體的熒光發射光譜與受體的紫外可見吸收光譜之間發生有效重疊時，激發態的電子給體將一部分或者全部的能量轉移給受體，如果受體是熒光發射基團，在獲得能量后發射出新的熒光，受體也可能是熒光發射猝滅劑，此時，只能看到給體的熒光變化，這種情況多用于核酸的檢測。FRET過程發生與效率主要與三個因素有關：如供體的發射光譜與受體的吸收光譜之間相互重疊的程度、供體發射偶極子與受體吸收偶極子的取向以及能量供體（D）和受體（A）分子之間的距離。

Lee等^［8］基于FRET機制合成了化合物探針識別Cu²⁺，探針被420nm激發光激發后，在波長507nm處發射出丹酰基的強熒光，在加入Cu²⁺以后，羅丹明螺環結構被打開，吸收丹酰基發射的熒光從而被激發后在580nm處發射羅丹明的熒光如圖2.13所示。

2.3.4　激基締/復合物（Excimer/Exciplex）機制

如果兩個相同的熒光基團（例如多環芳烴，如萘、蒽、芘等）通過一個柔性鏈連接在一起，當其中一個熒光基團（單體）被光激發后，和另一個處于基態的熒光基團發生相互作用形成分子內激基締/復合物（Excimer/Exciplex）。原來的單體發射峰減弱或者消失而產生激基締合物的強而寬的且出現在較長波長段的熒光發射峰。能否形成激基締合物關鍵是需要處于基態的熒光基團和處于激發態的熒光基團之間達到相應的碰撞距離（約為3.5?）。其工作原理如圖2.14所示。

如圖2.15所示是一個Na⁺的熒光分子探針，它本身的熒光光譜是由單體的兩個特征峰組成，當有Na⁺存在時，由于與Na⁺相互作用使得兩個熒光團相互靠近，激基締合物的熒光發射強度明顯增強而單體的熒光發射強度明顯降低^［9］。

2.3.5　剛性化效應

熒光分子的熒光量子產率通常和分子自身結構的剛性大小有著密切的關系。提高分子結構的剛性可有效地增強熒光發射強度，這主要是因為分子結構的剛性提高后降低了由于分子運動所引起的能量損耗，同時增加分子的共平面性后發生Frank-Condom躍遷，也有利于熒光的產生。因此也可以利用在底物存在下熒光探針分子剛性結構的增強來對底物的識別。如圖2.16所示的化合物，在沒有絡合Zn²⁺之前，由于CN雙鍵的異構化，分子沒有完全處于同一平面，使得化合物的熒光量子產率很低，當與Zn²⁺鍵合后，整個分子結構的剛性增加，熒光量子產率約增強了20倍之多^［10］。

以上我們對熒光分子探針的設計原理和幾種響應機制進行了介紹，后面的章節主要對本書涉及的Cu²⁺和Cr³⁺兩個重金屬離子的熒光探針進行簡單綜述。