4.5　實驗內容

4.5.1　熒光分析法測定水楊酸含量

實驗目的

（1）掌握熒光分析法測定水楊酸含量的原理和方法；

（2）進一步熟悉熒光分光光度計的基本操作。

實驗原理

鄰羥基苯甲酸（亦稱水楊酸），含有一個能發射熒光的苯環，在pH=12的堿性溶液和pH=5.5的近中性溶液中，310nm附近紫外光的激發下會發射熒光；而且pH=5.5的近中性溶液中鄰羥基苯甲酸因羥基與羧基形成分子內氫鍵，增加了分子剛性而有較強熒光。利用此性質，在pH=5.5時測定鄰羥基苯甲酸的熒光強度，已有研究表明水楊酸的濃度在0～12μg/mL范圍內均與其熒光強度呈良好的線性關系。

儀器與試劑

（1）儀器　熒光分光光度計；石英皿；容量瓶；移液管；比色管。

（2）試劑　鄰羥基苯甲酸標準溶液［60μg/mL（水溶液）］；HAc-NaAc緩沖溶液（47g NaAc和6g冰醋酸溶于水并稀釋至1L得到pH=5.5的緩沖溶液）；0.1mol/L NaOH溶液。

實驗步驟

（1）鄰羥基苯甲酸標準溶液的配制　分別移取0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mL鄰羥基苯甲酸標準溶液于已編號的10mL比色管中，再分別加入1.0mL pH=5.5的HAc-NaAc緩沖溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻備用。

（2）確定最大發射波長和激發波長　選取羥基苯甲酸標準溶液中濃度適中的溶液來測定其激發光譜和發射光譜。先固定發射波長為400nm，在250～350nm區間進行激發波長掃描，獲得溶液的激發光譜和熒光最大激發波長λ_ex；再固定最大激發波長λ_ex，在350～500nm區間進行發射波長掃描，獲得溶液的發射光譜和熒光最大發射波長λ_em。

（3）鑒定未知溶液　確定待測樣品的pH值，如pH值不在5.5附近，通過加入適量的酸、堿或緩沖溶液調整溶液的pH值為5.5。根據上述激發光譜和發射光譜的掃描結果，在所確定激發波長和發射波長處，測量待測樣品的熒光強度。

（4）標準溶液熒光強度的測定　設置上述實驗所確定的最大發射波長λ_em和最大激發波長λ_ex，在此組波長下測定上述各標準系列溶液的熒光強度。以溶液熒光強度為縱坐標，以溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。根據所測得的未知溶液的熒光強度在標準曲線上確定鄰羥基苯甲酸的濃度。

數據處理

（1）最大發射波長和激發波長的確定記錄如下。

（2）鄰羥基苯甲酸標準溶液和樣品熒光強度的測定記錄如下。

（3）以各標準溶液的熒光強度為縱坐標，分別以鄰羥基苯甲酸的濃度為橫坐標作標準曲線。

思考題

（1）pH=5.5時，鄰羥基苯甲酸（=3.00，=12.83）和間羥基苯甲酸（=4.05，=9.85）水溶液中主要存在的酸、堿形式是什么？為什么二者的熒光性質不同？

（2）從本實驗中總結出幾條影響物質熒光強度的因素。

4.5.2　熒光法測定復合維生素中維生素B₂的含量

實驗目的

（1）掌握熒光法測定復合維生素制劑中維生素B₂的含量（標準曲線法）。

（2）熟悉熒光光度計的使用方法。

實驗原理

維生素B₂（C₁₇H₂₀N₄O₆，分子量376.37，又稱核黃素）是橘黃色無臭的針狀結晶，其結構式為：

由于分子中有三個芳香環，具有平面剛性結構，因此它能夠發射熒光。維生素B₂易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩定，光照易分解，對熱穩定。

維生素B₂溶液在400～460nm藍光的照射下，發出綠色熒光，熒光峰在535nm附近維生素B₂，在pH為6～7的溶液中熒光強度最大，而且其熒光強度與維生素B₂溶液濃度呈線性關系，因此可以用熒光光譜法測維生素B₂的含量。而維生素B₂在堿性溶液中經光照非常易于分解，故測定維生素B₂的熒光強度需在酸性條件下，且避光。

在酸性條件下的維生素B₂稀溶液中，熒光強度F與維生素B₂的濃度c有以下關系：

F=2.303ΦI₀εbc

在一定的實驗條件下，當熒光量子產率（Φ）、入射光強度（I₀）、物質的摩爾吸光系數（ε）和液層厚度（b）固定不變時，熒光強度（F）與熒光物質的濃度（c）呈如下線性關系：

F=Kc

這是熒光光譜法定量分析的依據。

儀器與試劑

（1）儀器　RF-5301PC型熒光光度計（島津）；石英皿：1cm；容量瓶：50mL。

（2）試劑　10.0μg/mL維生素B₂標準溶液（稱取10.00mg維生素B₂置100mL燒杯中，加1%乙酸溶液使其溶解，并定量轉移1000mL容量瓶中，并用1%乙酸溶液稀釋至刻度，搖勻，將溶液保存在冷暗處）；1%乙酸溶液。

實驗步驟

（1）系列標準溶液的制備　取維生素B₂標準溶液（10.0μg/mL）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL及5.00mL，分別置于50mL容量瓶中，各加1%乙酸溶液稀釋至刻度，搖勻，待測。

（2）待測樣品溶液的制備　取維生素B₂ 10片，研細，精密稱取適量（約相當維生素B₂10mg）置于100mL燒杯中，加1%乙酸溶液使其溶解，定量轉移至1000mL的容量瓶中，用1%乙酸稀釋至刻度，搖勻。過濾，棄去初濾液，吸取續濾液2.0mL于100mL容量瓶中，用1%乙酸溶液稀釋至刻度，搖勻，待測。

（3）確定最大激發波長和發射波長　選取維生素B₂標準溶液中濃度適中的溶液來測定其激發光譜和發射光譜。先固定發射波長為540nm，在220～500nm區間進行激發波長掃描，獲得溶液的激發光譜和熒光最大激發波長λ_em；再固定最大激發波長440nm，在400～600nm區間進行發射波長掃描，獲得溶液的發射光譜和熒光最大發射波長λ_ex。

（4）標準溶液及樣品溶液熒光的測定　將激發波長固定在440nm，熒光發射波長為540nm，測量上述系列標準維生素B₂溶液的熒光發射強度。以溶液的熒光發射強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作標準曲線。

在同樣條件下測定未知溶液的熒光強度，并由標準曲線確定未知試樣中維生素B₂的濃度，計算藥片中維生素B₂的含量。

數據處理

（1）激發光譜和熒光發射光譜繪制過程中實驗數據記錄。

（2）標準溶液及待測溶液的濃度和熒光強度。

（3）以系列標準溶液的熒光發射強度F為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作維生素B₂溶液濃度c的標準曲線，從標準曲線上查得未知維生素B₂的質量（μg），然后根據樣品稱量m，按下式計算復合維生素B中含維生素B₂的標示量。

　　（4-2）

思考題

（1）解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？

（2）維生素B₂在pH為6～7時熒光最強，本實驗為何在酸性溶液中測定？

4.5.3　熒光法測定硫酸奎寧的含量

實驗目的

（1）掌握熒光法定量測定奎寧含量的原理與方法

（2）探究溶液的pH值和鹵化物對奎寧熒光強度的影響。

（3）進一步熟悉熒光分光光度計的基本操作

實驗原理

硫酸奎寧［分子式（C₂₀H₂₄N₂O₂O₂）₂·H₂SO₄·2H₂O，分子量782.96］為抗瘧藥，是硫酸奎尼丁的光學異抗體，其結構如下：

奎寧在稀硫酸溶液中是強的熒光物質，它有兩個激發波長250nm和350nm，熒光發射峰在450nm。奎寧的熒光強度隨著溶液酸度的改變，發生明顯改變。除了酸度對它有顯著的影響外，鹵素等原子也對其熒光強度有明顯的猝滅作用。因此，奎寧樣品濃度的測定必須固定其他的實驗條件，在低濃度時，采用標準曲線法即用已知濃度的標準物質，按試樣相同的處理方法，配制成一系列標準溶液。通過測定這些溶液的熒光強度，以熒光強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，再根據試樣溶液的熒光強度，在標準曲線上求出試樣中熒光物質的含量。

儀器與試劑

（1）儀器　RF-5301PC型熒光光度計（島津）；石英比色皿；容量瓶：1000mL 2只，250mL 1只，50mL 6只，移液管1支。

（2）試劑　100.0μg/mL奎寧儲備液（120.7mg硫酸奎寧二水合物中加入50mL 1mol/mL的硫酸溶液，并用去離子水定容至1000mL。將此溶液稀釋至10倍，得到10.00μg/mL奎寧標準溶液）；0.05mol/L的H₂SO₄溶液。

實驗步驟

（1）系列標準溶液的制備　吸取硫酸奎寧儲備液（100μg/mL）5.00mL置50mL容量瓶中，加H₂SO₄溶液（0.05mol/L）稀釋至刻度，搖勻，得到10.00μg/mL的硫酸奎寧標準溶液。

取6只50mL容量瓶，分別加入10.00μg/mL奎寧標準溶液0、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL，用0.05mol/L硫酸溶液稀釋至刻度，搖勻，待測。

（2）樣品溶液的制備　精密稱取硫酸奎寧樣品約40mg置于1000mL容量瓶中，用H₂SO₄溶液（0.05mol/L）溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取此溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，用H₂SO₄溶液（0.05mol/L）稀釋至刻度，搖勻，待測。

（3）測定

①按照儀器說明書接通電源，開機，儀器進行初始化后，設置靈敏度、狹縫、信噪比等參數及打印條件。

②將硫酸奎寧的對照品溶液置于石英池中。

③繪制熒光發射光譜，將激發波長設定為360nm，在400～600m范圍掃描熒光發射光譜，確定適合的熒光發射波長。

④繪制激發光譜，將熒光發射波長設定為上述熒光波長（450nm），在200～400nm范圍掃描激發光譜，確定適合的激發波長。

注意事項：硫酸奎寧標準溶液必須當天配制，避光保存。

數據處理

（1）最大發射波長和激發波長的確定記錄如下。

（2）未知樣品溶液熒光強度的測定記錄。

（3）樣品的測定將激發波長固定在350nm處，熒光波長固定在450nm處，測定H₂SO₄空白溶液（0.05mol/L）、對照品和樣品溶液的熒光強度，按下列關系式計算出樣品的濃度及含量

　　（4-3）

　　（4-4）

思考題

（1）測量時，為什么要測定硫酸的空白溶液？

（2）能用0.05mol/L的HCl來代替0.05mol/L的H₂SO₄溶液嗎？為什么？