2.5　實驗內(nèi)容

2.5.1　差值吸收光光度法測定廢水中的微量苯酚

實驗?zāi)康?/h6>

（1）學(xué)習(xí)使用UV-1801紫外-可見分光光度計。

（2）掌握差值吸收光光度法測定廢水中的微量苯酚的方法。

實驗原理

酚類化合物在酸、堿溶液中發(fā)生不同的解離，使其溶液的吸收光譜發(fā)生變化。苯酚在紫外區(qū)有兩個吸收峰：在酸性或中性溶液中，λ_max為210nm和272nm；在堿性溶液中，λ_max位移至235nm和288nm。在紫外-可見分光光度法分析中，利用在不同的酸、堿條件下，苯酚溶液吸收光譜變化的規(guī)律，直接對有機(jī)化合物進(jìn)行測定。

廢水中含有多種有機(jī)雜質(zhì)，這會干擾苯酚在紫外區(qū)的直接測定。如果將苯酚的中性溶液作為參比溶液，測定苯酚堿性溶液的吸收光譜，利用兩種光譜的差值光譜，有可能消除雜質(zhì)的干擾，實現(xiàn)廢水中苯酚含量的測定。這種利用兩種溶液中吸收光譜的差異進(jìn)行測定的方法，稱為差值吸收光譜法。

儀器與試劑

（1）儀器　島津UV-1801紫外-可見分光光度計；容量瓶（50mL容量瓶10個）。

（2）試劑　苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（準(zhǔn)確稱取苯酚0.300g，置于1L容量瓶中）。

實驗步驟

（1）配制苯酚的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：將10個50mL容量瓶分成兩組，各自編號。按照表2-2加入相應(yīng)的溶液，再用水稀釋至刻度，搖勻，作為苯酚的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

（2）繪制苯酚的吸收光譜：取上述同一編號的兩組溶液，用1cm吸收池，以水作參比溶液，分別繪制苯酚在中性溶液和堿性溶液中的吸收光譜。然后用中性的苯酚溶液作參比，繪制苯酚在堿性溶液中的吸光度差值光譜。

（3）測定苯酚兩種溶液的光譜差值：從上述繪制的差值光譜中，選擇288nm附近最大吸收波長作為測定波長。在UV-1801紫外-可見分光光度計上固定λ_max，然后成對地測定苯酚溶液兩種光譜的吸光度差值。

（4）未知試樣中苯酚含量的測定：將6個50mL容量瓶分成兩組，每組3個，分別加入未知樣。將其中3個用去離子水稀釋，其余3個加入2.5mL KOH溶液，再用去離子水稀釋至刻度，分別搖勻。將兩組溶液分成3對，用1cm吸收池測定光度差值。

數(shù)據(jù)處理

（1）將表2-2中測得的光譜差值，繪制成吸光度-濃度曲線，計算回歸方程。

（2）利用所得曲線或回歸方程，計算未知樣品中苯酚含量（用mol/L表示）的置信范圍（置信度為95%）。

（3）計算苯酚在中性溶液（272nm附近）或堿性溶液（288nm附近）中的表觀摩爾吸光系數(shù)。

思考題

（1）繪制苯酚在中性溶液、堿性溶液中的吸收光譜和差值光譜時，應(yīng)如何選擇參比溶液？

（2）在苯酚的差值光譜上有兩個吸收峰，本實驗采用288nm測定波長，是否可以用235nm波長作測定波長？為什么？

2.5.2　加和法多組分混合物的同時測定

實驗?zāi)康?/h6>

（1）掌握分光光度法吸光度的加和性原則，同時測定兩組分的方法。

（2）掌握分光光度法測定摩爾吸光系數(shù)的方法。

實驗原理

當(dāng)體系中有幾個組分時，根據(jù)吸光度的加和性，體系總吸光度為各組分吸光度之和。

　?。?-6）

式中，A_總為各組分吸光度A_i之和；c_i、ε_i分別為i組分的濃度和摩爾吸光系數(shù)。各組分的吸收光譜即使部分重疊，只要服從吸收定律，就可根據(jù)式（2-6）測定混合物中各組分的含量。

例如，在試樣中含有兩個組分x和y，其濃度分別為c_x和c_y，在波長λ₁和λ₂下，測得總吸光度和。根據(jù)式（2-6），可以得出以下方程組：

　　（2-7）

式中，、、、為波長在λ₁和λ₂時，組分x和y的摩爾吸光系數(shù)，可從已知濃度的純組分溶液獲得。解上述方程組，可求得c_x和c_y。用這種方法，原則上可以同時測定多組分混合物中各組分的含量，但組分增多，誤差增大。

儀器與試劑

（1）儀器　UV-1801紫外-可見分光光度計；容量瓶（50mL容量瓶8個）。

（2）試劑　Co（NO₃）₂標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.350mol/L）；Cr（NO₃）₃標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.100mol/L）；Co和Cr混合試樣。

實驗步驟

（1）分光光度法同時測定兩組分混合物的組成。

配制溶液：在4個50mL容量瓶中，分別加入2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL的Co（NO₃）₂標(biāo)準(zhǔn)溶液。

另取4個50mL容量瓶，分別加入2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別用去離子水稀釋至刻度，搖勻。

（2）繪制Co（NO₃）₂及Cr（NO₃）₃標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜。

用1cm吸收池，以蒸餾水作參比溶液，在可見光區(qū)繪制上述各容量瓶中溶液的吸收光譜。

（3）混合試樣吸收光譜：用1cm吸收池，用蒸餾水作參比溶液，繪制混合試樣的吸收光譜。

數(shù)據(jù)處理

分光光度法的數(shù)據(jù)處理：根據(jù)Co和Cr的吸收光譜，確定λ₁和λ₂；計算Co和Cr的4種標(biāo)準(zhǔn)溶液在λ₁和λ₂處的ε值，求出Co和Cr的和，按式（2-7）計算混合物中兩組分的濃度。

思考題

（1）分光光度法中，兩組分同時測定時，如何選擇測定波長λ₁和λ₂？

（2）兩組分同時測定時，如何獲得、、、？

2.5.3　雙波長紫外分光光度法測定復(fù)方新諾明的主要成分

實驗?zāi)康?/h6>

（1）掌握雙波長紫外分光光度法的測定原理。

（2）學(xué)習(xí)雙波長等吸收點紫外分光光度法測定二元混合組分的方法。

（3）學(xué)習(xí)藥物片劑的試樣制備方法。

實驗原理

經(jīng)典分光光度法的定量測定通常是在被測組分的最大吸收波長處進(jìn)行，根據(jù)朗伯-比爾定律，其吸光度值與被測組分的濃度c成正比，A=εbc。

當(dāng)吸收光譜重疊的兩個組分共存時，如何在測定被測組分時，可完全消除另一組分的干擾，達(dá)到共存組分不分離進(jìn)行定量測定的目的。通常采用的方法有雙波長法、三波長法、導(dǎo)數(shù)光譜法、差譜分析法等。其中雙波長法中的等吸收雙波長法應(yīng)用較為廣泛，該法的準(zhǔn)確度和精密度要高于其他方法，是對共存組分不分離定量測定的有效方法之一。

等吸收波長法的一個典型應(yīng)用實例是被收載于《中華人民共和國藥典》中的抗菌消炎藥復(fù)方磺胺甲唑片的含量測定。復(fù)方磺胺甲唑片中含有磺胺甲唑（SMZ）和甲氧芐啶（TMP）兩種主要成分，其吸收曲線見圖2-2。當(dāng)測定SMZ時，選擇其最大吸收波長257nm為測定波長，可以在干擾組分TMP的光譜曲線上304nm附近找到等吸收波長為組合波長消除其干擾；當(dāng)測定TMP時，選擇239nm為測定波長，可以在干擾組分SMZ的光譜曲線上295nm附近找到等吸收波長為組合波長消除其干擾，分別對SMZ和TMP進(jìn)行含量測定。

圖2-2（a）在0.1mol/L NaOH介質(zhì)中，SMZ在257nm處有最大吸收；TMP在257nm處吸收最小，表明在0.1mol/L NaOH介質(zhì)中測定SMZ時，TMP在波長257nm處干擾最小。

儀器與試劑

（1）儀器　UV-1801紫外-可見分光光度計；50.0mL容量瓶（7個）；2.0mL移液管（3支）。

（2）試劑　SMZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500mg/L，乙醇溶液）；TMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100mg/L，乙醇溶液）；0.1mol/L NaOH溶液；0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液；95%乙醇；復(fù)方磺胺甲唑片。

實驗步驟

（1）試樣制備。取復(fù)方磺胺甲唑片10片，精確稱量后計算平均片重。將10片藥片全部置于研缽中研細(xì)后，精確稱取適量藥片的粉末（約相當(dāng)于SMZ50mg，TMP10mg）于一小燒杯中，用乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用乙醇定容，搖勻。超聲15min，過濾，棄去最初的20mL濾液，收集剩余濾液于干燥的50mL容量瓶中，作為供試溶液備用。

（2）磺胺甲唑的測定。準(zhǔn)確移取上述供試溶液0.1mL于50mL的容量瓶，用0.1mol/L NaOH稀釋至刻度，搖勻，作為SMZ待測溶液。

準(zhǔn)確移取SMZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液、TMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00mL分別于兩個50mL容量瓶，用0.1mol/L NaOH溶液定容，分別作為SMZ標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ和TMP標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ。

將TMP標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ置于石英比色皿中，用0.1mol/L NaOH溶液作參比，以257nm為測定波長（λ₁），在304nm波長附近，每隔0.2nm選擇等吸收點波長（λ₂），要求。然后，將SMZ標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ置于石英比色皿中，分別在λ₁和λ₂處測定吸光度，求SMZ標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ在兩波長的吸光度差值：

　?。?-8）

同法測得片劑待測溶液Ⅰ在兩波長的吸光度差值。用下式求得片劑中SMZ的含量：

　?。?-9）

式中　——SMZ標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ中SMZ的質(zhì)量濃度，mg/mL；

m₀——平均片重的粉末試樣量，g；

m——制備供試液時所稱的粉末試樣量，g；

D——稀釋倍數(shù)。

（3）甲氧芐啶含量的測定。準(zhǔn)確移取上述供試溶液0.3mL置于50mL的容量瓶中，用0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液稀釋至刻度，搖勻，作為TMP待測溶液Ⅱ。準(zhǔn)確移取SMZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液、TMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液各2.00mL分別于兩個50mL容量瓶，用0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液定容，搖勻，分別作為SMZ標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅱ和TMP標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅱ。

將SMZ標(biāo)準(zhǔn)對照溶液置于石英比色皿中，用0.0075mol/L HCl-0.1mol/L KCl混合溶液作參比，以239nm為測定波長（λ₃），在295nm波長附近，每隔0.1nm選擇等吸收點波長（λ₄），要求：

　?。?-10）

然后，將TMP標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅱ置于石英比色皿中，分別在λ₃和λ₄處測定吸光度，求TMP標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅱ在兩波長的吸光度差值：

　　（2-11）

同法測得片劑待測溶液在兩波長的吸光度差值。用用下式求得片劑中TMP的含量：

　　（2-12）

式中　——TMP標(biāo)準(zhǔn)對照溶液Ⅰ中TMP的質(zhì)量濃度，mg/mL；

m₀——平均片重的粉末試樣量，g；

m——制備供試液時所稱的粉末試樣量，g；

D——稀釋倍數(shù)。

思考題

（1）在選擇測定波長和參比波長時，除了應(yīng)使干擾組分外，對于測定組分來說應(yīng)注意什么？

（2）為什么在制備供試液時要在混勻后再稱少量粉末而不是1片復(fù)方磺胺甲唑片劑研成粉末后直接制備？