實例精講　典型氨基酸類藥物的生產與質量控制

實例一　L-天冬氨酸的生產與質量控制

（一）L-天冬氨酸概述

L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）是天然存在的一種氨基酸，也稱丁氨二酸、L-天冬酸、L-天門冬氨酸或L-氨基琥珀酸。其化學性質穩定，為白色晶體或結晶粉末，有微酸味道；25℃微溶于水（0.5%），可溶于沸水，易溶于稀酸和NaOH溶液，不溶于乙醇、乙醚等有機溶劑，270℃發生分解，pI為2.77，比旋光度與溶解溶劑有關；在酸性和水溶液中為右旋，堿性溶液中為左旋。[α]＝＋5.05°（c＝0.5～2.0g/mL，H₂O）。

L-Asp的化學結構如圖2-1-1所示。

L-Asp是氨基酸輸液的重要組成部分。L-天冬氨酸鉀和L-天冬氨酸鎂是鉀、鎂的有效補充劑，可用于心臟病的治療，也可作為肝功能促進劑和氨解毒劑，對洋地黃等強心苷類中毒引起的心律失常也有較好的治療作用，并可解除惡心、嘔吐等中毒癥狀，還可用于維生素B₆及抗腫瘤藥物的合成。

（二）L-天冬氨酸的生產方法

L-Asp主要以化學合成法、微生物發酵法和固定化細胞法生產為主。

1．化學合成法

化學合成法是以馬來酸或富馬酸及其酯為原料，在加壓條件下用氨處理，然后進行水解得到外消旋的天冬氨酸，反應得到的外消旋天冬氨酸由于沒有較好的拆分方法，給L-Asp的分離與純化帶來了不便，故應用較少。氨基酸常用化學合成方法有斯瑞克合成法——醛的氨氰化法、赫爾-烏爾哈-澤林斯基α-溴化法、丙二酸酯法、蓋布瑞爾法等，其合成原理如圖2-1-2所示。

天冬氨酸還可通過以下的化學合成法進行合成，需要原料有順丁烯二酸酐（49g，0.422mol）、芐胺（107g，1mol）、冰醋酸、鈀-炭催化劑（含30%氯化鈀）、丙酮以及剛果紅試紙等，其合成技術路線如圖2-1-3所示。

L-Asp合成步驟（實驗室規模）如下：

① 在500mL三口瓶中，加入49g順丁烯二酸酐與150mL水沸騰回流30min。

② 冷卻條件下慢慢加入107g芐胺并繼續回流1h，冷卻后加入丙酮使沉淀完全，產物N-芐基-天冬氨酸芐胺鹽（Ⅰ）在乙醇中重結晶。

③ 50g Ⅰ溶于60mL 15% NaOH溶液，以乙醚反復萃取芐胺多次后，堿性溶液用鹽酸酸化至剛果紅試紙呈酸性反應，冷卻后分離出白色結晶N-芐基-天冬氨酸（Ⅱ）。

④ 將5g Ⅱ懸浮于110mL冰醋酸及鈀-炭催化劑（含30%氯化鈀）0.3g（鈀-炭催化劑加入時不能掉在瓶外，否則容易引起著火）中，在60℃下低壓催化氫化3h（必須在升溫之前用氫氣將瓶內空氣置換3次）。反應物冷卻后過濾。

⑤ 濾渣以冷甲酸洗滌，合并濾液及洗滌液，蒸去溶劑得到L-Asp。烘干后稱重，計算產率，測其熔點。天冬氨酸為無色單斜棱柱形結晶，熔點為278～280℃。

2．微生物發酵法

微生物發酵法是在微生物酶的催化作用下，以富馬酸與氨為原料，通過加成反應生成天冬氨酸，產物只有左旋體，收率高，此為L-Asp工業化生產的主要方法。目前，以產生天冬氨酸酶的微生物菌體直接轉化富馬酸和氨生產L-Asp的固定化細胞法應用較為廣泛，天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）可催化反丁烯二酸（富馬酸）與氨合成L-Asp。反應式如下：

3．固定化細胞法生產L-Asp

以卡拉膠為包埋材料固定化高天冬氨酸酶活性的大腸桿菌細胞，并制成生物反應器實現L-Asp的連續生產，其反應工藝路線如圖2-1-4所示。

卡拉膠是一種優良無毒的天然凝膠包埋材料，由海藻中提取，作為細胞固定化包埋材料，具有機械性能較好、操作方便、穩定性較好、包埋條件溫和等優點，常作為微生物菌體和微生物酶的包埋材料，對酶活性和細胞代謝無影響。固定化細胞技術是利用物理或化學手段將游離的微生物細胞、動物細胞定位于限定的空間區域，并使其保持活性且能反復利用的一項技術。它的制備方法有吸附法、共價交聯法、絮凝法、包埋法，其中包埋法因操作簡單、對細胞毒性小以及效率高而被廣泛使用，是目前細胞固定化的重要手段。

（1）大腸桿菌細胞固定化

① 菌種活化　將冷凍（冷藏）保存的大腸桿菌菌體用LB培養基于37℃培養過夜。取1mL已活化的處于對數生長期的大腸桿菌種子液接種至50mL滅菌種子培養基中（10%延胡索酸銨、2%玉米漿、2%牛肉膏、0.5%KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O，pH 7.0），37℃振蕩培養24h，3000r/min離心20～30min，去上清液，菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，離心收集菌體，于4℃冷藏備用。

② 大腸桿菌細胞固定化　稱取4g大腸桿菌濕菌體振蕩懸浮于5mL無菌生理鹽水中，45℃恒溫5min，加1.0g卡拉膠于20mL無菌生理鹽水，加熱至70～80℃使其溶解，降溫至45℃，并將懸浮大腸桿菌菌體與冷卻至45℃的卡拉膠混合均勻，4℃冰箱中放置30min成型。將成型凝膠在100mL 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h，然后切成3mm³的立方體方塊的顆粒。經無菌生理鹽水洗滌2次后，將固定化細胞加入含有1mol/L延胡索酸銨的溶液中于37℃活化24h，即可使用。

（2）天冬氨酸酶酶活力測定與延胡索酸標準曲線繪制

① 濕菌體天冬氨酸酶酶活力測定　稱取0.5 g濕菌體懸浮于2mL無菌蒸餾水中，加入30mL 1.0mol/L延胡索酸銨溶液（含1mmol/L MgCl₂、1%Triton，pH 9.0），并于37℃攪拌反應30min，100℃滅酶，3000r/min離心5min。上清液經適當稀釋后于240nm波長處測定吸光度并計算延胡索酸殘余量，計算酶活力。一個酶活力單位定義為：在測定條件下，每小時每克細胞轉化生成1μmol天冬氨酸所需酶量。

② 固定化細胞天冬氨酸酶酶活力測定　取相當于0.5g天然細胞的固定化細胞，置于30mL 1.0mol/L延胡索酸銨溶液（含1mmol/L MgCl₂），37℃攪拌反應30min，迅速過濾除去固定化細胞，分離反應液，適當稀釋后于240nm波長處測定吸光度，計算延胡索酸殘余量，并計算酶活力。總活力用每克固定化細胞每小時內所產生的L-Asp物質的量（μmol）表示[μmol/（h·g）]。

③ 延胡索酸標準曲線的繪制　延胡索酸在240nm波長處有特征性的吸收峰，在一定范圍內，其吸光值與延胡索酸濃度呈正相關，且反應體系沒有干擾。按表2-1-2配置延胡索酸標準梯度溶液，并于240nm波長處測定吸光值，記錄在表中。以延胡索酸標準液濃度為橫坐標，以測定得到的吸光值A₂₄₀為縱坐標，通過一元線性回歸分析，得到標準曲線方程并制作線性回歸曲線。

（三）L-天冬氨酸的質量控制

1．天冬氨酸酶酶活力的測定

稱取6g固定化的大腸桿菌菌體裝入恒溫的固定化生物反應器（15cm×30cm）中，底物延胡索酸銨（含1mmol/L MgCl₂，pH9.0）以1.0mol/L恒速流過固定化細胞柱，空速（SV，指在連續流動的反應器中單位時間內通過單位天冬氨酸酶床層的延胡索酸量）＝0.87h^－1，流出液于240nm處測定延胡索酸含量并計算天冬氨酸酶酶活力和轉化率。固定化酶的半衰期通過酶活力的衰變速度和工作時間的指數關系確定。

2. L-Asp質量分析

L-Asp質量分析方法和標準參照國家行業標準QB/T 1118—1991。含量（99.5%）采用高氯酸滴定測定，比旋光度（24.5°～26.5°）采取旋光儀測定，硫酸根（≤200mg/L）采取比濁法測定，鐵鹽（≤10mg/L）采取比色法測定，氯離子（≤200mg/L）采用比濁法測定，銨鹽采用比色法測定，延胡索酸采用分光光度法測定。L-Asp質量檢測分析結果記入表2-1-3中。

實例二　L-賴氨酸的生產與質量控制

（一）L-賴氨酸概述

L-賴氨酸（L-lysine，L-Lys），也稱L-己氨酸、L-2，6-二氨基己氨酸，分子式為C₆H₁₄N₂O₂，分子量為146.19，無色針狀結晶，比旋光度＋14.6°（c＝6.5）、＋25.9°（c＝2，6.0mol/L HCl）。L-賴氨酸化學結構式如圖2-1-5所示。

其在水溶液中，0℃溶解度為53.6g/100mL、25℃時為89g/mL、50℃時為111.5g/mL，微溶于乙醇，不溶于乙醚。游離賴氨酸在空氣中易吸入CO₂，制得賴氨酸晶體比較困難，工業上常以賴氨酸鹽酸鹽形式生產，賴氨酸鹽酸鹽熔點為263℃，口服半致死量（LD₅₀）為4.0g/kg，其結構中含有α-氨基和ε-氨基，只有ε-氨基為游離狀態時才能被機體利用，故具有游離ε-氨基的賴氨酸稱為有效賴氨酸。在提取時要注意避免有效賴氨酸破壞。

賴氨酸是合成腦神經、生物細胞核蛋白及血紅蛋白不可或缺的營養成分，可緩解因賴氨酸缺乏產生的功能性障礙和蛋白質代謝不良等癥狀，若缺乏會導致機體其他氨基酸利用效率的降低，廣泛應用于食品、藥品以及飼料等工業中；也可作為營養補充劑用于醫藥領域，對外傷、烙傷、手術病人的康復有非常好的效果；賴氨酸還可作為利尿劑的輔助藥物，治療因血中氯化物減少而引起鉛中毒的現象，與酸性藥物（如水楊酸）聯用生成鹽類來減輕不良反應。

（二）L-賴氨酸的生產方法

1952年，日本味之素公司對大豆蛋白進行水解獲得了賴氨酸并實現工業化生產，同年，日本中山等人以谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）為出發菌株，經多級誘變處理獲得了賴氨酸工業化規模的生產菌，最先實現發酵法工業規模生產。1956年，谷氨酸棒桿菌從土壤中被分離出來并用于谷氨酸的生產，隨后又被用于賴氨酸的生產。微生物發酵法也因此成為賴氨酸制備的重要工業生產方法，賴氨酸工業已成為僅次于谷氨酸的第二大氨基酸工業。以下介紹蛋白質水解法、直接發酵法、酶促法和化學合成法等L-賴氨酸的生產方法。

1．蛋白質水解法

蛋白質水解法常以血粉或乳酪素為原料，用25%H₂SO₄進行酸解，并用石灰進行中和，過濾去渣。濾液真空濃縮，過濾除去不溶解的中性氨基酸，在熱濾液中加入苦味酸，冷卻至5℃，保溫12～16h，析出L-賴氨酸苦味酸鹽結晶。經冷水洗滌后，結晶用水重新溶解，加鹽酸生成賴氨酸鹽酸鹽，濾去苦味酸，濾液濃縮結晶，得賴氨酸鹽酸鹽。

2．酶促法

酶促法是利用微生物產生的D-氨基己內酰胺外消旋酶使D-型氨基己內酰胺轉化為L-型氨基己內酰胺，再經L-氨基己內酰胺水解酶作用生成L-賴氨酸。可產生D-氨基己內酰胺外消旋酶的常見微生物有奧貝無色桿菌（Achromobacter obae）、裂環無色桿菌（Achromobacter cycloclastes）、糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）等，可產生L-氨基己內酰胺水解酶的微生物有勞倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）、土壤假絲酵母、絲孢酵母（Trichosporon pullulans）等。

L-賴氨酸的酶促法制備工藝路線如圖2-1-6所示。

將可產生D-氨基己內酰胺外消旋酶的無色桿菌和可產生L-氨基己內酰胺水解酶的隱球酵母混菌培養，可實現DL-氨基己內酰胺向L-Lys的轉化，或用D-氨基己內酰胺消旋酶將D-氨基己內酰胺消旋化生成L-氨基己內酰胺，再用水解酶水解生成L-Lys，消旋酶來自裂環無色桿菌，水解酶來自隱球酵母。無色桿菌消旋酶的活力可保持約30h，酵母水解酶可以保持約100h，除使用干燥菌體外，也可以直接用培養液、菌體提取液進行反應，但要注意添加量。

賴氨酸酶促合成操作過程為：10% 100mL（78mmol/L）的DL-氨基己內酰胺（pH調節至8.0左右），加入0.1g隱球酵母的丙酮干燥菌體及0.1g無色桿菌冷凍干燥菌體，置于300mL的錐形瓶中，于40℃搖床培養24h。上清液中測不出氨基己內酰胺，L-賴氨酸的量為77.84mmol/L，轉化率達到99.8%。加入少量活性炭進行脫色處理，攪拌并煮沸3min，冷卻至室溫，過濾后用HCl調pH為4.1，真空濃縮，60℃干燥得到L-賴氨酸鹽酸鹽，純度為99.5%。

3．化學合成法

以己內酰胺為原料，得到外消旋賴氨酸，經拆分可得到L-賴氨酸。L-賴氨酸化學合成法工藝路線如圖2-1-7所示。

4．直接發酵法

這是目前賴氨酸工業生產的主要方法。該方法是利用微生物的代謝調節突變株、營養要求性突變株（突變株的L-賴氨酸生物合成代謝部分或完全被解除），以淀粉水解糖、糖蜜、乙酸、乙醇等原料直接發酵生成L-賴氨酸。以下主要介紹微生物發酵法制備賴氨酸的生產工藝及過程質量控制。

賴氨酸發酵工藝流程如圖2-1-8所示。

（1）種子擴大培養　賴氨酸生產菌的擴大培養常分為二級擴大培養，即一級搖瓶種子和二級種子罐培養，二級擴大培養后接入發酵罐進行發酵。種子擴大培養包括配料、滅菌、接種、培養、檢測等操作步驟。

（2）賴氨酸發酵　賴氨酸發酵過程控制中控制培養基中生物素、L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸含量以及溫度、pH、溶解氧（通風量、攪拌速度）等參數具有重要意義，特別是溶解氧控制。賴氨酸整個發酵過程分為菌體生長階段和產物積累階段，發酵時間以16～20h為分界線。發酵前期和發酵后期的培養溫度一般為30～32℃和32～34℃，pH控制在6.5～7.5，最適pH為7.0，可通過補充尿素或氨水控制pH。二級種子培養接種量為2.5%，培養48h。由于賴氨酸生產菌大多是高絲氨酸營養缺陷型，蘇氨酸和蛋氨酸含量豐富導致只長菌而不產賴氨酸，要控制蘇氨酸和蛋氨酸在亞適量水平。賴氨酸生產菌為生物素缺陷型，培養基中需限量添加生物素。適量添加某些特定物質可促進賴氨酸的生物合成（表2-1-4）。

（3） L-賴氨酸的提取　發酵液中賴氨酸的提取工藝分為離子交換、真空濃縮、中和析晶、脫色重結晶和干燥等階段（圖2-1-9）。

① 準備　賴氨酸發酵結束后，將發酵液加熱升溫到80℃并保溫約10min，滅菌并冷卻。用HCl或H₂SO₄調節pH至2.0（若發酵液賴氨酸含量較高可適當稀釋）。

② 進樣　上柱液（含菌體）由樹脂底部進料，至一定液面高度，并進行真空抖料（即柱閥關閉，由頂部抽真空并急開一口，使柱內樹脂向上翻滾），待樹脂全部分散均勻后進行反交換，料液不斷從底部向上流動并連續流過離子交換樹脂層，此過程樹脂保持松動（稱倒上柱或反吸附）。另一種上柱方式是將已滅活的發酵液用自動排渣高速離心機離心，除去菌體和固形物，上清液調pH并適當稀釋后從樹脂柱上部進料，自上而下連續流過離子交換樹脂層（稱正上柱或正吸附）。未經除菌處理的發酵液采取正上柱時，要在柱頂加壓，防止菌體堵塞。

③ 注意事項　主要考慮流速、pH、賴氨酸濃度、結晶與脫色幾個環節。

a．流速　吸附過程要注意上柱液的流速，一般每分鐘流出體積約為樹脂體積的1%，并隨時監測流出液pH。待流出液pH下降至4.5時，不再洗脫，同時用茚三酮檢測賴氨酸是否流出完全。離子交換完畢后，飽和樹脂用水正相和反相沖洗，待樹脂充分擴散、流出液澄清透明且pH呈中性時即清洗完畢。先用1mol/L氨水洗脫，當流出液pH達到8.0時，改用2mol/L氨水進行洗脫，洗脫過程要控制洗脫速度，一般情況下，洗脫速度為每小時1倍樹脂體積。洗脫過程若流出液流速過快，易出現洗脫高峰不集中，拖尾長，樹脂中賴氨酸還未洗脫完全，pH就上升了，尾液中賴氨酸含量較高的情況。

b. pH與賴氨酸濃度　 洗脫過程中需連續監測流出液的pH及賴氨酸濃度的改變，常分為三個階段洗脫液并分步收集，第一段為pH<9.0的流出部分，流出液中賴氨酸含量較低，可用作下批洗脫用氨水；第二段為pH 9.5～13.0流出液，其賴氨酸含量高，平均為6%～7%，流出高峰期可達到16%～20%，此段流出液是賴氨酸洗脫的主要階段，為高含量區段，常直接送真空濃縮工段進行結晶濃縮；第三段為上段收集洗脫液的尾流部分，賴氨酸含量較低且銨離子量較高，可重新上柱洗脫或用作下批洗脫氨水之用。賴氨酸在進行離子交換時，常采取多柱串聯離子交換（multiple-column series ion exchange，MCSIE），MCSIE可提高約5%的收率。在分段洗脫時，第三段洗脫液中賴氨酸含量較低，但銨離子濃度較高，因此，需采取減壓濃縮除氨，從而提高單位體積的賴氨酸濃度，可采取中央循環管蒸發器、膜式蒸發器及雙效或三效蒸發器。在濃縮操作前需將物料用酸調節pH至8.0，真空濃縮溫度60～65℃，真空度8.6×10⁴Pa以上。物料經濃縮達到22°Bé（其中賴氨酸含量約90%）。氨回收裝置與蒸發器相連，在濃縮過程中，回收淡氨水。

c．結晶　濃縮罐放入中和罐，在攪拌條件下加入工業鹽酸將料液pH調節至4.8。然后，放料液至結晶罐進行析晶，在罐夾套內通過冷卻水緩慢冷卻物料，使冷卻面與液體間溫度差小于10℃，溫差不要過大，否則冷卻面溶液因產生局部過飽和而結晶析出，并沉積在結晶罐內壁。物料降至10℃并保溫結晶10～12h。在結晶過程中，要注意適當攪拌以促進結晶進程，使晶體與母液充分攪拌并有利于晶體的均勻長大。結晶罐底部裝配的錨式攪拌器以10～20r/min低速攪拌，以加速晶體結晶析出。析出的晶體通過離心操作可獲得帶一個結晶水的賴氨酸鹽酸鹽粗產品。

d．脫色　將帶有一個結晶水的賴氨酸鹽酸鹽粗品用2.5～3.0倍去離子水溶解（賴氨酸含量為30%～35%），然后用活性炭進行脫色，活性炭用量一般為賴氨酸鹽酸鹽粗品的3%～5%（以賴氨酸質量為基準計算），活性炭用量可根據產品色澤進行合理選用，注意脫色溫度和脫色時間等因素的影響。一般情況下，脫色溫度為70～80℃，脫色時間為1～2h。完成脫色后立即用板框壓濾機過濾并用水洗滌，合并濾液和洗滌液，真空濃縮至22°Bé，冷卻，結晶。純化后的賴氨酸鹽酸鹽晶體用真空干燥或熱風干燥或紅外干燥，于60℃干燥至水分含量≤0.1%。

（三）L-賴氨酸的質量控制

對產品進行質量分析，藥用級、食用級和飼用級L-賴氨酸質量標準如表2-1-5所示。