第3章　高效產甲烷菌群的建立

數百萬年來油藏內部進行著原油厭氧降解產甲烷過程，而隨著油藏的開采大量殘余原油留存地下，通過微生物作用使殘余原油（石油烴）降解產甲烷已成為油藏深度開發利用的新方法。油藏微生物由諸多菌群組成，這些菌群協同作用實現石油烴的降解，石油烴降解過程中涉及的反應步驟多、反應速率影響因素多，代謝方式也是多種多樣，而殘余原油中可以供微生物利用的營養物質和厭氧產生的毒害物質的數量是影響降解效率的關鍵因素。目前，研究者多通過外加碳源、氮源、磷源、微量元素、維生素、絡合劑等來激活微生物，從而提高石油烴的降解效率。石油烴降解的終端產物是甲烷，而電子受體（硝酸鹽、四價錳、三價鐵、硫酸鹽等）的耗盡是甲烷產生的基礎。產甲烷古菌會和其他菌群形成互營共生關系，最終使石油烴降解并接受末端電子產生甲烷。為進一步提高石油烴的降解效率，筆者總結了降解石油烴的厭氧微生物菌群及其代謝特性，并對微生物厭氧降解石油烴產甲烷的代謝途徑進行了比較。

油藏中的微生物劃分為好多種，其中根據微生物自身的特殊性質可將它們劃分為若干個種群，大致包括烴氧化菌、發酵菌、硝酸鹽還原菌、鐵還原菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌^[1～4]。大部分在油藏中生長的微生物可以產生一些氣體代謝物，這些氣體代謝物包括CO₂、H₂、N₂、CH₄、H₂S，而這些微生物的代謝需要一些電子受體的參與，其中常見的電子受體為氧氣、硝酸鹽、硫酸鹽、三價鐵、有機酸等^[5～8]。對老油田進行的深度開發，提高原油采收率已成為當前老油田開發的中心任務。現有的提高采收率技術存在的主要問題是提高幅度有限，大量的殘余油滯留地下。烷烴厭氧生物降解產甲烷過程是多種菌參與、多步驟的反應，整個降解過程反應速率的影響因素非常多^[9～13]。有學者研究認為影響原油的厭氧生物降解的主要因素之一就是烴的化學性質，特別是溶解性^[14]。加快原油厭氧降解速度的可行方法之一就是增加微生物對石油烴的攝取能力，而微生物大多生活在水相中^[15，16]。地層殘余油厭氧生物降解的其他影響因素還有微生物的活性和豐富度^[17]，在整個厭氧降解過程中，相關的功能菌群扮演著重要角色，這些功能微生物的豐度和活性影響整個降解速率，因此可以通過添加營養物質來激活功能菌群增加它們的豐富度，從而加快原油厭氧生物降解的速度^{[1，3，15，16]}。此外， 解除中間產物的抑制，使反應朝著有利的方向進行也是提高烴厭氧降解速率的關鍵因素。對原地微生物和它們營養需求，原油、地層水和巖石基質的物理、化學組成有一定了解后，就可以確定促進和維持微生物群活性的總體生態環境， 刺激微生物可以通過調整地下環境來進行，改變環境條件包括改變地層溫度、pH值、Eh值和鹽度及二氧化碳、游離氧和氫含量等，環境的改變可以通過人為的因素，從而加快微生物產氣效率^{[1，3，13，16]}。

地下油藏是一個復雜的環境，現在人們的研究主要集中在常溫常壓下，而要想提高石油的利用效率，必須得進行模擬地層條件下的石油烷烴降解研究，這在以后的實際利用中將有重要意義。總之， 微生物在地層中就地產氣， 是微生物提高石油采收率的一個非常重要的因素。隨著世界人口的增長，人們對化石能源的需求日益增加以及全球石油資源的減少使人們重新認識到石油產甲烷的重要作用，特別是一些廢棄油藏中的殘余原油沒有被更好地利用，而這一現象可以作為一種微生物強化石油開采技術得到大范圍利用^[18～20]。微生物可以在油藏中代謝產生氣體、生物表面活性物質、有機酸^[20]等，絕大多數微生物在代謝過程中都會產生氣體， 通過增大油藏壓力、降低原油黏度改善流度比， 提高原油的流動能力。對于能源利用效率的提高，微生物的作用日益得到人們的重視，因為這種微生物強化石油開采技術不需要大規模的能源投入，所以其被看作是一種先進的綠色能源利用戰略，在微生物強化石油開采技術中，營養物質和外源微生物的注入可以達到提高石油利用率的預期效果，而且微生物能利用一些廉價的可再生資源生產大量副產品^[20]，這些副產品的產生可以增加石油的利用率，包括生物表面活性劑、乳化劑、羧酸類、醇類和氣體。因此，本實驗在模擬油藏壓力和溫度下進行，考察外援添加物的注入對殘余油氣化產甲烷的影響。

由于高溫高壓以及高地層水礦化度的厭氧環境使得微生物的生存環境異常苛刻，就在人們認為在這種環境下微生物很難生長時，此后，不同功能的厭氧微生物菌群被發現和分離^[3]。而多種的厭氧降解電子受體（硝酸鹽、硫酸鹽、三價鐵、二氧化碳、錳離子等）也被大量發現^[7～12]。近年來，人們越來越認識到油藏內部的產甲烷過程是多種菌群共同作用的結果，這其中涉及的菌群有發酵菌、硫酸鹽/硝酸鹽還原菌、厭氧產甲烷菌等^[13]，整個過程主要涉及的反應有四種類型：第一，在各種還原菌群的共同作用下石油烴失去電子發生氧化反應；第二，乙酸失去電子發生氧化反應；第三，乙酸分解反應產生甲烷；第四，二氧化碳接受電子還原產生甲烷。其中，二氧化碳接受電子還原為生成甲烷的主要方式^[14]，長鏈烷烴通過復合菌群的共同作用產生乙酸和二氧化碳以及氫氣，最終在產甲烷古菌和其他硫酸鹽和硝酸鹽還原菌的共同作用下產生甲烷和其他氣體^[15，16]。前人已經研究的硫酸鹽還原菌，已知硫酸鹽還原菌存在于大部分的油藏中。硫酸鹽還原菌是一個復雜的生理菌群，在其眾多性質中最重要的是活力、最適溫度、氧化能力等，而根據rRNA序列分析又可分為革蘭氏陰性嗜溫菌、革蘭氏陽性芽孢菌、嗜熱細菌、嗜熱古細菌硫酸鹽還原菌四大菌群，它們都以硫酸鹽作為電子受體進行無氧呼吸^[17]。還有學者研究革蘭氏陰性嗜溫菌的演化歷史，從中得出一些關于細菌演變歷史的線索，硫酸鹽還原菌的共同祖先是一些光養生物，隨后在漫長的演變過程中，一些失去了光合能力變成異氧細菌^[18]。通過研究得知 Desulfovibrionaceae 和Desulfobacteriaceae 已經出現很大分化，Desulfobacteriaceae是原始的細菌，因為它包括一個δ-Proteobacteria，而Desulfovibrionaceae卻沒有這部分^[19，20]。

由于產甲烷古菌在天然氣形成方面的巨大作用，使得其受到了世界范圍類的廣泛研究，而幾年來油藏殘余油降解產甲烷成為一個新熱點，人們通過研究產甲烷古菌來揭示和利用這一過程。產甲烷古菌和其他復合菌可以通過厭氧發酵過程將有機物降解生成甲烷氣體，這期間伴隨著其他降解產物的生成，如氫氣和二氧化碳，產甲烷古菌廣泛存在于土壤、底泥、地熱環境、油井、海底沉積物中^[21]。同時，厭氧產甲烷古菌處在有機物降解產甲烷的最后環節，通過利用小分子物質產甲烷，而甲烷氣體有著廣泛的作用，而且還是一種溫室氣體^[22，23]。產甲烷古菌有3種營養類型，分別是氫營養型、甲基營養型、乙酸營養型，在可能的途徑中通過其他菌群的協同作用將長鏈有機物降解成短鏈的無機物或有機物，然后產甲烷菌在降解產生甲烷^[24，25]。

① 氫營養型　主要有伊萬諾夫甲烷桿菌^[26]、熱自養甲烷桿菌^[27]、布氏甲烷桿菌和嗜熱嗜堿甲烷桿菌^[28]、熱自養甲烷球菌^[29]、石油甲烷盤菌屬^[30]、耐鹽甲烷卵圓形菌^[31]。

② 甲基營養型　鹽水甲烷嗜鹽菌^[32，33]、斯氏甲烷八疊球菌^[34，35]。

③ 乙酸營養型　馬氏八疊球菌^[36，37]。

當硫酸鹽和硝酸鹽這些電子受體缺乏時，有實驗表明烷烴仍然可以通過富集培養的菌群厭氧降解，生成二氧化碳和甲烷。

俄克拉荷馬大學Suflita教授在油藏現場的研究工作，其研究結果表明：將油藏的油和微生物菌群在一起培養時，由于微生物作用，在第297天時甲烷產生量達到最大值^[1]。學者利用實驗證明了石油烴的厭氧降解^[29]。而Lovley等分離得到了高效降解甲苯的菌GS-15株，它們是被分離得到的第一株以三價鐵為電子受體的菌株^[30]。有學者首次分離到以硫酸鹽為電子受體的還原菌Hxd3，它們能夠利用長鏈飽和烴^[31]。

有研究表明：甲烷正是油藏中石油烴降解的終端產物之一，產甲烷古菌需要與其他細菌形成一種特殊的互營關系，持續降解石油烴并接受末端電子產生甲烷，而處于厭氧生物鏈最末端的產甲烷古菌在微生物采油方面、生物修復以及生物圈碳元素循環中起著重要的作用。而且最近有很多學者已經證實了這一現象，他們通過加入更有潛力的石油降解產甲烷菌群來降解石油烷烴，而且取得了很好的效果^[38，39]。

本章經過長期的實驗，設計了油藏模擬裝置，在溫度為55℃和初始壓力為10MPa的油藏條件下模擬殘余油氣化產甲烷。有文獻報道通過模擬生物降解石油，并且進行油氣地球化學測定而且用不同的儀器設備進行數據分析，得出溫度對微生物的生長起著重要作用， 當油藏溫度超過80℃時，微生物就很難生存，而油藏溫度小于等于40℃時微生物的生長量最大^[22] 。然而在其他學者的研究中溫度對產甲烷菌生長的影響不盡相同，Siddique^[23]的書中認為產甲烷菌被發現在世界的任何角落，而且從5℃到110℃均有發現，它們可以降解有機物質并在碳循環中起著重要的作用。而且還有學者研究了北海石油的生物降解活動，結果顯示溫度與產甲烷菌的活性之間有重要聯系，而且在70℃的條件下產甲烷菌的活性最高，充分說明可以利用原油中的土著微生物進行殘余油的降解產甲烷，前人的實驗多集中在模擬溫度上，而油藏中還有一個重要的影響因素——壓力，因此本章模擬了初始壓力為10MPa下土著微生物的降解石油產氣實驗。

還有學者研究認為可以通過添加營養素來刺激產甲烷菌的生長^[24]。目前殘余油生物氣化仍處于實驗室試驗階段，有很多學者提出通過從油藏或河底淤泥中培養富集石油烴降解產甲烷菌種，然后接種到石油烴中，模擬降解產甲烷，這其中包括加入一些化學添加劑及營養物質或電子受體以增加甲烷的產量。還有學者通過從其他環境中富集的微生物進行降解產氣實驗，包括從油砂或油頁巖中，改變環境條件，如添加對微生物有益的碳源、氮源等^{[1，3，16，24～26]}。通過研究前人做的實驗，尤其是添加外源物質來加快微生物降解原油，本章通過注入氮氣和有機氣體的混合物的處理（WYO2），與只通入氮氣的處理（MYO2）進行對比，同時以滅菌處理（O1）作為對照，得出WYO2處理的最終甲烷含量明顯高于MYO2，可能由于有機氣體的加入促進了微生物降解石油烴，從而產生更多的甲烷氣體。隨著有機氣體的注入，乙烯、異戊烷、正戊烷、順式-2-丁烯等有機氣體溶解在了石油中，這可能改變了石油烴的性質，從而有利于微生物對石油烴的降解產氣；同時有機氣體的含量也發生了變化，降解前后大部分有機氣體減少，甲烷含量增加，差異顯著。有利于有機氣體的凈化，同時更好地利用有機氣體減小污染的排放，石油烴降解前后有明顯的變化，原油中異戊二烯化合物姥鮫烷（Pr）和植烷（Ph）結構比較穩定，常以正十七烷/姥鮫烷（nC₁₇/Pr）、正十八烷/植烷（nC₁₈/Ph）的比值來確定石油烴的降解情況^[27]，降解前后比值明顯減小，表明WYO2處理的石油烴被充分地降解了。

當油藏環境中的硝酸鹽、四價錳、三價鐵、硫酸鹽等電子受體耗盡，是甲烷產生的基礎，而甲烷正是油藏中石油烴降解的終端產物之一，產甲烷古菌需要與其他細菌形成一種特殊的互營關系，持續降解石油烴并接受末端電子產生甲烷，而處于厭氧生物鏈最末端的產甲烷古菌在微生物采油方面、生物修復以及生物圈碳元素循環中起著重要的作用^[12，28]。最近有很多學者已經證實了這一現象，他們通過加入更有潛力的石油降解產甲烷菌來降解石油烷烴，而且取得了很好的效果^{[1，2，3，16]}。而來自地質學的證據表明，數千年來在地球內部油藏自發地進行這一產甲烷進程，因為地球內部很好地提供了這一厭氧產甲烷的條件^{[3，11，12，28]}。隨著世界人口的增長，人們對化石能源的需求日益增加以及全球石油資源的減少使人們重新認識到石油產甲烷的重要作用，特別是一些廢棄油藏中的殘余原油沒有被更好地利用，而這一現象可以作為一種微生物強化石油開采技術得到大范圍利用^{[3，10，16，29]}。2004年年底俄克拉荷馬日報報道了俄克拉荷馬大學Suflita教授的研究工作，即通過微生物的作用，將油藏中殘余油轉化為天然氣，可使老油田起死回生^[1，29]。在美國有公司專門從事生物氣的研究，這就是科羅拉多州的LUCA公司。開展將煤或油轉化為天然氣的研究，其中對Monument Butte油田研究結果表明，該油藏的油和水樣在一起培養時，由于微生物作用，在最開始的60d內有相當大量的甲烷產生，而后在297d時甲烷產生量達到最大值，這與一般的微生物培養生長曲線相似。本書在前人研究的基礎上，建立模擬反應裝置，并且通入有機氣體，研究有機氣體對油藏中殘余油甲烷氣化的影響。

所以為了研究油藏中厭氧微生物的作用，爭取篩選到更有潛力的產甲烷菌群，通過上一章的初步篩選分析后，本章對YH5和TH2菌群進行混合復配，而且設計了溫度和壓力模擬裝置，考察溫度和壓力對復配后微生物厭氧降解石油烴產甲烷的影響，并且運用色譜-質譜技術分析復配后微生物降解石油烴產甲烷的效果，為以后老油井的氣化開采或封存奠定基礎。