2.3.4　YH5和TH2菌群結(jié)構的分析

經(jīng)過對YH1到Y(jié)H6油井采出液和TH1到TH6含油污泥400d的富集培養(yǎng)，主要測定了氣體含量及種類，尤其對甲烷產(chǎn)氣量進行了計算，得知YH5和TH2菌群的產(chǎn)甲烷量最高。對YH5和TH2菌群的石油降解率、石油烴的利用情況進行了細致分析，得出：YH5和TH2是高效厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群，而文后彩圖2是石油培養(yǎng)前后的照片，從照片中可以看到，石油經(jīng)過長達400d的厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣后，在厭氧瓶中會有大量的沉淀產(chǎn)生，溶液變渾濁并且呈棕黑色，液面上的原油被降解分散。下面將對YH5和TH2中的細菌群落結(jié)構進行分析，以求闡明其細菌群落結(jié)構；另外，本章研究的菌群是當有穩(wěn)定甲烷氣體產(chǎn)生后培養(yǎng)瓶中的菌群。

前面測定了400d后它們厭氧瓶內(nèi)頂部空氣的甲烷含量，并且做了細致研究。下面進一步對這兩種菌群的DNA進行提取。

首先對雜質(zhì)進行沉淀過濾，然后用微量移液槍吸取上清液，重復多次操作，離心后對菌體DNA進行提取，加入玻璃珠，然后加入磷酸鹽緩沖液（120mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為8.0）、0.5mol/L Tris HCl （pH值為8.0）、0.1mol/L NaCl和10% SDS，在破壁儀上進行破壁，時間為30s。然后用 Tirs 飽和酚、酚異戊醇氯仿（25∶1∶24，pH≥7.8）、異戊醇氯仿（1∶24）進行抽提。所得DNA通過Promega 試劑盒進行純化后^[40]，然后進行PCR。如文后彩圖3所示，可知DNA亮度非常明顯，只是含有一些拖尾，可能是提DNA的時候有碎片。然后用提取的DNA進行PCR-DGGE分析菌群結(jié)構組成。

而PCR-DGGE技術（基于聚合酶鏈式反應的變性梯度凝膠電泳技術）已經(jīng)被廣泛地應用（圖2-14），特別在石油污染修復、高效石油烴降解菌的篩選、石油的開采等科研領域均大量使用，而且該技術也被用來分析油藏中微生物群落結(jié)構^{[36～45，86，87]}。該技術可以快速了解某地區(qū)的生物結(jié)構和組成，為石油污染修復、高效石油烴降解菌的篩選、石油的開采等提供理論基礎，可以針對特殊菌群采取相應的辦法。而該技術應用在石油烴厭氧產(chǎn)氣時同樣有巨大的潛力。為了對石油烴厭氧產(chǎn)氣的微生物組成有一個宏觀的了解，我們特地使用了PCR-DGGE技術，而在變形梯度凝膠電泳（DGGE）中，為了使每種菌的DNA片段更好的分散，從而加以區(qū)分，所以需要較短的DNA片段，通常在500bp以下，因此在厭氧降解石油烴產(chǎn)氣過程中選用了引物341F-GC和534R（見表2-7），GC夾的目的就是防止雙鏈完全解開，更好地使DNA擴增片段在相應的變性劑濃度上停止，達到分離的目的^[71～75]。

PCR擴增包括變性、退火和延伸3個反應階段，各階段的原理及條件如下。

（1）變性

簡單來說是指在94℃的條件下模板DNA或PCR擴增后的雙鏈解旋，變成兩條單鏈，這種解旋是可逆的，當溫度改變又會變成雙螺旋結(jié)構，為下一步的進行提供準備。

（2）退火

退火即復性，在55℃時，解鏈的DNA模版與相應的引物配對，在DNA聚合酶的作用下開始形成一條完整的DNA的過程，就是說體系中投加的引物與變性后形成的DNA單鏈上的序列互補結(jié)合。

（3）延伸

退火階段后，在引物72℃時，引物已經(jīng)與DNA單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，以DNA單鏈為模板母鏈，合成母鏈加子鏈的雙鏈的過程，即通常說的半保留復制，從而實現(xiàn)擴增^{[38～43，71～76, 88～94]}。

經(jīng)過多次重復試驗，確定了本章試驗中的最佳PCR反應條件：94℃預變性5min, 94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。從文后彩圖4中可以發(fā)現(xiàn)，其為YH5和TH2菌群DNA被提取后，通過對細菌基因組（包括古細菌）中的16S rDNA V3區(qū)的保守序列進行PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖像，電壓為95V，時間30min，通過EB染色15min后，用成像系統(tǒng)對其拍照^{[41～45，71～76]}。最左側(cè)是Marker標準的DNA片段圖像，其長度從下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp，擴增后產(chǎn)物的長度為200bp左右，說明其為目的片段；同時非特異擴增不明顯，片段較純，條件合適，而且，在陰性擴增中，只有引物二聚體，沒有發(fā)現(xiàn)其他擴增條帶，說明該PCR過程并未受到污染，擴增結(jié)果可信。而有學者研究表明：如果要消除非特異性擴增條帶的現(xiàn)象，可以通過以下幾種方法。

① 引物的種類更換或者調(diào)整引物量的多少。

② 調(diào)整混合體系的量。

③ 適當增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

④ 提高退火溫度。

而本研究中的PCR產(chǎn)物是通過純化試劑盒的多次提純，以切膠回收的方式將非特異性條帶去掉?；厥盏腜CR產(chǎn)物重新作為模板DNA用相同的引物進行PCR擴增^[72，74]。

本章通過DGGE技術比較了YH5和TH2中的菌群結(jié)構的異同，通過文后彩圖5的YH5和TH2的細菌DGGE結(jié)構圖可以得出：經(jīng)過對采出液和含油污泥長時間連續(xù)的富集培養(yǎng)，YH5和TH2都有較豐富的細菌DNA條帶，而且通過右側(cè)的泳道分析表明：YH5大約有12條明顯的條帶，而TH2大約有7條明顯的條帶，這些條帶形狀粗細均勻，顏色明亮，分開的恰到好處，可以在下一步分析中使用。

前面研究產(chǎn)甲烷的時候，在第400天時YH5菌群和TH2菌群產(chǎn)生的甲烷最多，每天會有1.5μmol的甲烷產(chǎn)生，這時的YH5和TH2是在眾多培養(yǎng)來源中產(chǎn)甲烷最多的兩個菌群，所以要對這兩個樣品進行細致的分析。

而通過文后彩圖6的YH5和TH2的古細菌DGGE結(jié)構可以得出：經(jīng)過對采出液和含油污泥長時間連續(xù)的富集培養(yǎng)，古細菌條帶會較細菌條帶明顯偏少，YH5和TH2都有相應的古細菌DNA條帶，而且通過泳道分析表明：YH5大約有6條明顯的條帶，而TH2大約也有6條明顯的條帶，這些條帶形狀粗細均勻，顏色明亮，分開得恰到好處，可以在下一步分析中使用。有研究表明：產(chǎn)甲烷古菌廣泛存在于土壤、底泥、地熱環(huán)境、油井、海底沉積物中^[95]。同時厭氧產(chǎn)甲烷古菌處在有機物降解產(chǎn)甲烷的最后環(huán)節(jié)，通過利用小分子物質(zhì)產(chǎn)甲烷，而甲烷氣體有著廣泛的應用^{[96，97]}。產(chǎn)甲烷古菌分為3種營養(yǎng)類型，分別是氫營養(yǎng)型、甲基營養(yǎng)型、乙酸營養(yǎng)型，并且通過其他菌群的協(xié)同作用將長鏈有機物降解成短鏈的無機物或有機物，然后產(chǎn)甲烷古菌再降解產(chǎn)生甲烷^[98，99]。

具體的3種類型都包括以下菌群。

① 氫營養(yǎng)型，主要有伊萬諾夫甲烷桿菌^[100]、熱自養(yǎng)甲烷桿菌^[101]、布氏甲烷桿菌和嗜熱嗜堿甲烷桿菌^[102]、熱自養(yǎng)甲烷球菌^[103]、石油甲烷盤菌屬^[104]、耐鹽甲烷卵圓形菌^[105]。

② 甲基營養(yǎng)型，主要有鹽水甲烷嗜鹽菌^{[106，107]}、斯氏甲烷八疊球菌^[108，109]等。

③ 乙酸營養(yǎng)型，主要有馬氏八疊球菌^[110]等。

對DGGE優(yōu)勢菌群條帶進行研究，從而鑒定出可能的細菌種類或最相似種類，所以對DGGE片段進行切膠回收，在DGGE電泳結(jié)束后，用事先準備好的經(jīng)過高溫高壓滅菌的小刀，在紫外燈照射下（圖2-15）對聚丙烯酰胺凝膠照相并切膠回收。切膠時佩戴護目鏡，對優(yōu)勢條帶進行切割，然后用滅菌牙簽迅速將切割后的條帶轉(zhuǎn)入放在冰上已經(jīng)滅菌的離心管中。因為紫外線會破壞DNA結(jié)構，所以切膠的動作一定要快，并且離心管要放到冰上，然后在離心管中加入無菌水并且漫過膠塊，對離心管進行密封保存，并于4℃冰箱中過夜。膠塊中的DNA片段濃度較高，會自動進入到無菌水中，因為DNA會自動降解，所以在4℃冰箱中不能保存過久^[72，74]。

為能夠得到足夠的DNA樣本容量，而且在測序的時候不能有GC夾，所以需要對回收的DNA進行二次PCR，二次PCR的引物需要與第一次相同，只是不帶GC夾。反應體系選取20μL，DNA模版的量為0.5μL進行PCR試驗，通過實驗驗證二次PCR擴增條件跟一次PCR條件相同時效果最好，選用PCR最佳條件為：94℃預變性5min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。經(jīng)過回收的DNA送上海生工生物進行測序 ^{[38，72，74]}。經(jīng)過測序，然后在國際權威數(shù)據(jù)庫GenBank中進行序列分析比對^[72，74]，通過序列比對就能知道分析對象的可能的細菌群落結(jié)構，如圖2-16所示為NCBI數(shù)據(jù)庫中YH5和TH2部分相似序列比較。

進一步研究分析表明：如表2-15所列，可以看到最相似序列的名稱、相似度、Genbank編號，從而對YH5和TH2的細菌群落結(jié)構有了初步分析，其中，最相似細菌為嚴格厭氧的而且是耐高溫的石油烴降解菌，具有降解石油的能力，可以產(chǎn)生氫氣、二氧化碳、乙酸、丙酸等小分子有機物^{[41，111，112]}，而在最相似的古菌里都是嗜熱嚴格厭氧的產(chǎn)甲烷古菌，能利用氫氣、二氧化碳、小分子有機酸產(chǎn)生甲烷，其中有甲基營養(yǎng)型、氫營養(yǎng)型等，這些古菌與已知的從勝利油田分離的產(chǎn)甲烷古菌有高度同源性，特別要強調(diào)的是這些古菌中含有與甲烷八疊球菌相似的菌株^[93，113]。綜上所述，具體的降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群還需要在以后章節(jié)進行細致的分析研究。