若以上方法確定某種中藥有抗癌作用后，進一步就是探求其抗癌作用的機制。抗癌作用的靶點很多。有的阻礙核酸合成，如甲氨蝶呤抑制二氫葉酸還原酶，使四氫葉酸生成不足，因而脫氧胸嘧啶核苷酸生成障礙；氟尿嘧啶與尿嘧啶相似，故可競爭性抑制胸苷酸合成酶，使DNA合成受阻；巰嘌呤干擾嘌呤代謝，阻礙嘌呤核苷酸合成；羥基脲阻止胞苷酸還原為脫氧胞苷酸，抑制DNA合成；阿糖胞苷抑制DNA聚合酶。有的抗癌藥破壞DNA結構和功能，如烷化劑與DNA和蛋白分子中的氨基、巰基、羧基、羥基和磷酸基起烷化反應，以烷基取代上述基團中的氫原子，破壞DNA和蛋白質的正常結構與功能；博來霉素在腺嘌呤與胸腺嘧啶配對處與DNA結合，引起DNA鏈斷裂；喜樹堿類干擾DNA拓撲異構酶，抑制DNA復制。有的藥物嵌入DNA而干擾RNA轉錄，如放線菌素D等能插入到G-C堿基對，與雙鏈DNA牢固結合，抑制所有形式的DNA依賴性RNA轉錄。有的抗癌藥作用于蛋白質，影響紡錘絲形成和功能（如長春新堿），或干擾核蛋白體功能（如三尖杉酯堿），或影響氨基酸的供應（如L-門冬酰胺酶降解門冬氨酸為天冬氨酸和氨，使腫瘤缺乏門冬酰胺而蛋白合成障礙）。此外，還有激素類和影響激素平衡而抑制腫瘤的藥物。

中藥的抗癌作用可能是多靶點的。例如姜黃素有抗炎、抑制血管生成、抗氧化等作用，抑制細胞周期中的幾種信號轉導路徑，包括與蛋白激酶C有關的轉導和轉錄因子NF-κB。目前發現姜黃可以上調22種基因和下調17種基因的表達，其中包括原癌基因。這些基因與細胞增殖周期、細胞凋亡等有關。

以下介紹幾種抗癌靶點及其研究方法：

基因表達的產物是蛋白質，而蛋白質可用蛋白質印跡法來分析。一種藥物是否影響細胞基因表達可以利用蛋白質印跡法顯示其蛋白產物量來分析。以下用姜黃素下調癌基因cyclin D1的表達為例來介紹這種方法。

周期蛋白（cyclin）分別在細胞周期的不同時期程序性地表達。目前發現的周期蛋白有8個成員（A~H），在G ₁期表達的cyclin D1~D3、cyclin E是原癌基因，在多種癌細胞中都有過度表達。Cyclin D1表達產生的蛋白質稱為cyclin D1蛋白。有一些磷酸激酶的活化是依賴這種蛋白的，稱為cyclin D1蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）。激酶利用ATP的能量和磷酸使一些蛋白質包括酶蛋白磷酸化，如蛋白激酶C能磷酸化相當多的蛋白質，包括：①代謝途徑中的關鍵酶類，如糖原合成酶、磷酸化酶激酶、HMG CoA還原酶等；②與信息轉導有關的蛋白質，如GTP酶活化蛋白、Raf蛋白激酶；③調控基因表達的轉錄因子或與翻譯有關的因子，如c-fos，nuclear factor-kappaB（NF-κB），與DNA合成有關的拓撲異構酶Ⅰ等。由蛋白激酶C調控的基因中有一段序列TGAGTCA，稱為TPA反應組件（TPA response element，TRE）。TPA是12-O-tetradecanoyl phorbol-13 acetate的縮寫，有促癌作用，能直接啟動蛋白激酶C而磷酸化核內磷酸酶，磷酸酶啟動后，水解掉核內蛋白Jun的幾個磷酸基，Jun即可與TRE結合而促進基因表達，這可能是TPA的促癌機制。

研究發現，姜黃素能下調cyclin D1的表達。方法是將兩組等量的癌細胞進行培養，其中一組培養液中加姜黃素，然后制備細胞提取物，經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，進行電轉移，用抗cyclin D1蛋白的抗體（1∶1000稀釋）做探針處理2小時，分離得到與該抗體結合的cyclin D1蛋白，用光化學物標記的抗免疫球蛋白作為第二抗體與上述抗原抗體復合物結合而顯示cyclin D1蛋白的量。為了確保各份標本中加入的第二抗體量相等，用抗β-肌動蛋白（β-actin）的抗體作對比。比較未經姜黃素處理的培養細胞和經姜黃素處理的培養細胞的cyclin D1蛋白的量，結果顯示姜黃素以劑量依賴方式和時間依賴方式下調原癌基因cyclin D1的表達（圖3-3）。

視網膜母細胞瘤基因（retinoblastoma gene，Rb）是最早發現的腫瘤抑制基因。其表達產物視網膜母細胞瘤蛋白（Rb蛋白）與轉錄啟動因子E-2F形成復合物，使E-2F處于非活化狀態。Cyclin D-依賴性蛋白激酶（CDK4）使Rb蛋白磷酸化而與E-2F解離，E-2F因而活化，促使細胞從G ₁期向S期轉化，導致DNA合成增加，細胞增殖。

中藥若下調原癌基因的表達，減少cyclin蛋白的產生，影響cyclin蛋白依賴性激酶的活性，可使Rb蛋白的磷酸化減少，抑制DNA合成和癌細胞增殖。研究方法是：經中藥處理的培養癌細胞被溶解，細胞碎片被離心，取一定量的細胞蛋白與抗CDK4的抗體做免疫沉淀反應，離心，用緩沖液洗滌，得到CDK4，與底物Rb蛋白在加有 ³²P標記的ATP的環境中孵化，然后用10%SDSPAG分離蛋白，用放射性自顯影檢測被磷酸化的Rb蛋白的量（圖3-4）。

研究方法是：從經中藥處理的培養癌細胞中提取mRNA，逆轉錄成cDNA，經一定循環次數的PCR擴增，用溴化乙啶作熒光標記顯示PCR產物量，以反映mRNA轉錄量，從而檢測cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3和cyclin E的轉錄（圖3-5）。

Cyclin D1 cDNA的PCR擴增所用引物是5′-CGGGATCCCCAGCCATGGAAC ACCAGC-3′和5′-CGGAATTCGCGCCCTCAGATGTCCACG。

微管也是抗癌藥的作用靶點之一。如長春新堿（vincristine）、鬼臼毒素（podophyllotoxin）能與微管蛋白相結合，抑制微管聚合而阻礙紡錘絲的形成，抑制細胞分裂，是作用于M期的周期特異性藥物。紫杉醇（paclitaxel）促進微管蛋白聚合而抑制其解聚，從而影響紡錘體的功能，使癌細胞分裂中止于G ₂/M期。微管蛋白在0~4℃是無色透明溶液。當溫度升高并恒溫于37℃時，微管蛋白聚合，溶液濁度逐漸增加，在350nm波長的OD值增大并在37℃恒溫時趨于穩定。而當溫度由37℃降至0℃的過程中，微管蛋白解聚，溶液濁度下降，光密度減少并在0℃恒溫時趨于穩定。根據微管這一特性，比較對照管和加藥處理管，可測試藥物有無促進微管聚合或解聚作用。

GADD是抗癌作用的又一靶點。GADD34、GADD45和GADD153在缺乏營養如葡萄糖、亮氨酸、鋅或細胞暴露于紫外線、抗癌藥等情況下，往往會增加表達，導致細胞生長停滯和細胞凋亡。有研究發現，姜黃上調GADD153的表達。其研究方法是：培養癌細胞與藥物孵化后，總RNA被提取，用針對靶基因GADD153的特異引物作RT-PCR分析。用β-actin基因作內部對照（圖3-6）。

以上介紹了歐美醫學科學家對植物藥抗癌作用的部分現代實驗研究方法學。這些研究方法是很有價值的。但是僅用西醫藥理學的方法來研究中藥是不全面的，中藥的臨床應用還應遵循經數千年觀察和反復俢正而形成的、行之有效的一些中醫理論如整體觀念、扶正祛邪（即增強器官功能特別是免疫系統來對抗疾?。?、個體辨證、藥物配伍等，才能取得較好的臨床效果。