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一、如何確定藥物是否具有抗癌作用的實驗研究方法

在眾多聲稱有抗癌作用的植物藥中如何選定值得研究的對象?通常是根據歷史文獻記載和臨床報道提供的線索,進行分析,或根據民間經驗和流行病學調查分析篩選研究對象。例如近年歐美醫學家通過流行病學調查分析發現姜黃可能有預防和治療癌癥的作用,因而興起了姜黃研究熱。
一個藥物(無論西藥或中藥)是否有殺滅或抑制癌細胞的作用,常用下列方法確定:

(一)MTT法

MTT(5-diphenyl tetrazolium bromide)為黃色物質,可被細胞中與輔酶Ⅱ(NADP)相關的脫氫酶還原為紫藍色的不溶性甲 (formazan)。癌細胞死亡則此酶消失,MTT不被還原。用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解甲 ,可用酶標儀在550nm波長處檢測光密度(OD),測知MTT被還原的量。據此反映細胞死亡的量。例如培養癌細胞經姜黃素處理過后,與未經姜黃處理的培養癌細胞相比,MTT被還原量明顯減少,反映姜黃素使大量癌細胞死亡。MTT法還被用于中藥復方抗癌作用的研究。

(二)SRB法

這是美國癌癥研究所采用的方法。磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)是溶于水的粉紅色染料,可與生物大分子中的堿性氨基酸結合,在515nm的OD讀數與細胞數呈良好線性關系。以此比較加藥前后的細胞數,可知細胞生長有無受到抑制。通過測定對照組細胞、加藥組細胞的光密度(OD)值和加藥時的OD值,可計算岀藥物有無抗癌作用及50%生長抑制所需的藥物濃度(GI 50)和殺死50%癌細胞所需藥物濃度(LC 50)。近年,加利福尼亞大學外科系Shoemaker和Hamilton等用這種方法發現12種中藥具有抗癌作用。這種方法也被用于中藥復方的研究。

(三)胸腺嘧啶核苷滲入法

胸腺嘧啶核苷是DNA合成的原料之一。用放射性同位素標記胸腺嘧啶核苷,測知胸腺嘧啶核苷滲入DNA的量,可反映細胞增殖的情況。例如用 3H標記的胸腺嘧啶核苷加入癌細胞培養液,測定細胞DNA合成時胸腺嘧啶核苷滲入的量,亦發現經姜黃素處理可使胸腺嘧啶核苷滲入量明顯減少,反映姜黃素使DNA合成障礙,癌細胞大量死亡。

(四)細胞凋亡的觀察

藥物能否引起癌細胞凋亡可通過光學顯微鏡觀察、核小體間DNA裂解檢測或流式細胞儀檢查發現。
作為細胞死亡的形式之一,細胞凋亡的形態學特點是細胞核固縮,染色體DNA廣泛斷裂,沿核膜濃聚成多形性高密度顆粒區,核膜皺縮;核膜崩解后包裹染色體片段形成凋亡小體散布于細胞質。這些變化可用光學顯微鏡觀察發現。
核小體間DNA裂解檢測的原理是凋亡細胞的DNA斷裂形成大小不等的DNA片段(核小體單位),在瓊脂糖凝膠電泳上呈現間隔180~200堿基對的特征性“DNA梯”(圖3-1A泳道2),而細胞壞死則不會有這樣的DNA梯(圖3-1A泳道3)。
圖3-1 經姜黃素處理的黑色素瘤細胞(B16-R)DNA分析(OdotJ等,2004)
細胞(2×10 6)在姜黃素處理前培養12小時。從細胞提取的DNA(20μg/well)用1.8%瓊脂凝膠作電泳分析
A.DNA分子量用堿基對(bp)標示(泳道1)。泳道3為對照組細胞的DNA。泳道2和泳道4分別為經100μmol和200μmol姜黃素處理24小時的B16-R細胞的DNA。B.泳道1和4為DNA分子量標示。泳道2和3分別為經100μM和200μM姜黃素處理48小時的B16-R細胞DNA
由于凋亡細胞DNA廣泛岀現許多不對稱斷裂點,利用末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)在眾多游離3′-OH端引入與熒光素偶聯的dUTP作標記,可用流式細胞儀檢測細胞凋亡。未凋亡的細胞因為沒有暴露的3′端,所以不會被檢出。這個方法稱為TdT介導的dUTP缺口末端表示法(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)。西方醫學界在研究中藥抗癌作用時也用了這種方法觀察中藥能否引起癌細胞凋亡(圖3-2)。
圖3-2 用流式細胞儀和TUNEL法檢測中藥復方SPES或(和)阿霉素引起的胰腺癌細胞凋亡
(Schwarz RE等,2003)。橫坐標為TUNEL-陽性的百分比
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