第二章　表面活性物質(zhì)基因突變?cè)陂g質(zhì)性肺疾病發(fā)病的致病機(jī)制

間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)發(fā)病和進(jìn)展的機(jī)制仍無(wú)定論。一直以來(lái)，人們認(rèn)為慢性ILD和肺纖維化主要起因于肺泡上皮損傷繼發(fā)的慢性炎癥。若損傷得以控制，修復(fù)過(guò)程就會(huì)逆轉(zhuǎn)纖維化的趨勢(shì)；若損傷持續(xù)，修復(fù)過(guò)程就會(huì)導(dǎo)致瘢痕形成和局部結(jié)構(gòu)改變。但一些對(duì)于成人ILD病例的研究顯示，過(guò)敏性肺炎的疾病早期炎癥很明顯，后期并未出現(xiàn)纖維化，而廣泛纖維化的病理類(lèi)型中炎癥的成分卻很少。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種涉及異常創(chuàng)傷愈合的功能紊亂，進(jìn)行性的上皮損傷和激活是纖維形成和間質(zhì)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，這種作用并不依賴(lài)于炎癥。

近年來(lái)研究認(rèn)為，IPF的發(fā)病機(jī)制分為3個(gè)病理生理階段，易感階段、起始階段和進(jìn)展階段。易感階段包括基因突變或變異(即SNPs)，使易患個(gè)體發(fā)展肺纖維化；個(gè)體的生命期間環(huán)境暴露導(dǎo)致慢性上皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致端粒縮短，這些因素最終導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能障礙。并不是所有的人在這個(gè)階段均會(huì)出現(xiàn)臨床相關(guān)的疾病，它取決于暴露于這些因素的程度和持續(xù)時(shí)間。在起始階段，上皮細(xì)胞功能障礙分子介質(zhì)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，過(guò)度TGF-β活化，生長(zhǎng)因子、趨化因子或Wnt分泌導(dǎo)致EMT，纖維細(xì)胞招募和成纖維細(xì)胞分化。這些導(dǎo)致疾病的進(jìn)展階段，在這期間的病理間質(zhì)細(xì)胞釋放異常類(lèi)型的基質(zhì)蛋白，從而重塑和瘢痕肺。病理重塑的基質(zhì)或在成纖維細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)的改變可能會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞激活和加重進(jìn)行性肺纖維化。

【基因突變和其相關(guān)的機(jī)制】

1.基因突變

兒童ILD領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展是發(fā)現(xiàn)了先天性表面活性物質(zhì)代謝異常，包括表面活性蛋白B、表面活性蛋白C和ABCA3基因的突變。表面活性蛋白B、C和ABCA3是維持表面活性物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和運(yùn)輸?shù)谋匾镔|(zhì)。這些基因突變編碼的蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致表面活性物質(zhì)功能障礙，同時(shí)引起致命的嬰兒慢性呼吸系統(tǒng)疾病。早產(chǎn)所致肺表面活性物質(zhì)缺乏是新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome，RDS)的主要原因。患有肺部疾病的足月嬰兒和患有兒童間質(zhì)性肺疾病的較大兒童均有可能由肺表面活性物質(zhì)代謝紊亂所引起。2001年Nogee等［1］描述了一家患有間質(zhì)性肺疾病的病例。采用候選基因方法識(shí)別了表面活性蛋白C(SP-C)的編碼基因雜合子突變，外顯子4脫落和末端缺失了37個(gè)氨基酸(SPCΔexon4)。此報(bào)告顯示了SP-C突變，影響了肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面活性蛋白的生產(chǎn)和分泌，導(dǎo)致間質(zhì)性肺疾病。之后Thomas等［2］報(bào)道了家族性肺纖維化(familial pulmonary fibrosis，F(xiàn)PF)患者中的一個(gè)大家族中，SP-C末端部分Q188L的錯(cuò)義突變。后續(xù)報(bào)告發(fā)現(xiàn)了另外的6個(gè)SP-C基因的突變與肺纖維化相關(guān)［3］。這些突變的大多數(shù)位于BRICHOS區(qū)域，其功能之一為防止SP-C的聚合，同時(shí)協(xié)助其插入膜［4］。雖然這些研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明SPC基因突變與特異家族性肺纖維化有關(guān)。但這些突變發(fā)生在只有1%的散發(fā)性肺纖維化的病例［5-6］。利用單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)在一大家族的肺纖維化個(gè)體進(jìn)行超過(guò)6000標(biāo)記面板全基因組連鎖分析［7］。分析確定染色體10q22為受累部位。位于這一染色體區(qū)域的編碼表面活性蛋白A1、A2和D的基因，被確定為候選基因。測(cè)序鑒定這些基因的錯(cuò)義突變預(yù)測(cè)表面活性蛋白A2的G231V突變［7］。隨后在FPF大家族的表面活性物質(zhì)A基因發(fā)現(xiàn)第二種錯(cuò)義的突變(F198V)。這兩種突變預(yù)測(cè)的翻譯蛋白不穩(wěn)定，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中突變蛋白異常保留，并不能形成高次序的聚合物。

SP-B基因突變可引起致命性新生兒RDS。文獻(xiàn)還報(bào)道，SP-B基因多態(tài)性與足月兒呼吸窘迫綜合征密切相關(guān)［8］。近期發(fā)現(xiàn)，SP-C基因及ABCA3基因突變與兒童間質(zhì)性肺疾病有關(guān)［9-11］。SP-C基因變異表現(xiàn)為不同的基因顯型，而有SP-C基因突變的兒童大多數(shù)表現(xiàn)為非特異性間質(zhì)性肺炎，少數(shù)合并肺泡蛋白沉積。有SP-C突變的成人常表現(xiàn)為非特異性間質(zhì)性肺炎、脫屑性間質(zhì)性肺炎或無(wú)癥狀。不伴有SP-B、SP-C基因突變的ABCA3基因突變與新生兒致命性呼吸衰竭有關(guān)，年齡稍大的兒童可表現(xiàn)為非致命性肺間質(zhì)性疾病，嬰兒可表現(xiàn)為肺泡蛋白沉積癥、脫屑性間質(zhì)性肺炎或嬰兒慢性肺炎［10］。

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(thyroid transcription factor 1，TTF1)，也被稱(chēng)為NKX2.1。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1是轉(zhuǎn)錄因子同源盒基因家族的一個(gè)成員，對(duì)重要的表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生和功能的多種基因表達(dá)很重要。這些基因包括SP-A、SP-B和SP-C、ABCA3。該基因位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂(14q13.3)。NKX2.1基因的缺失或完全喪失功能的突變也能導(dǎo)致嚴(yán)重的RDS和ILD的表型。NKX2.1基因在甲狀腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，NKX2.1基因突變的患者可能出現(xiàn)這些器官系統(tǒng)相關(guān)的癥狀。所以，這種疾病可用“腦-甲狀腺-肺”綜合征來(lái)描述［12］。

關(guān)于NKX2.1單倍劑量不足(haplo-insufficiency)的肺疾病自然病史并不清楚。有報(bào)道新生兒期和嬰兒早期引起致命性的肺部疾病，也有在較輕或無(wú)肺疾病的老年患者中發(fā)現(xiàn)。染色體16q24.1微缺失和FOXF1雜合突變功能缺失導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管發(fā)育不良伴靜脈錯(cuò)位。

近年研究發(fā)現(xiàn)，家族性的肺纖維化患者與TERT、TERC基因突變有關(guān)［13-14］。我們?cè)?個(gè)家庭的5號(hào)染色體上使用疾病基因的連鎖圖譜。在兩個(gè)肺疾病的家庭的排序的候選基因TERT區(qū)間內(nèi)，共隔離顯示錯(cuò)義突變和移碼突變。TERT編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與端粒酶RNA組成(RNA component of telomerase，TERC)是維持端粒完整性所需要的。測(cè)序44個(gè)額外的無(wú)關(guān)的家庭先證者和44例散發(fā)的間質(zhì)性肺疾病，顯示其他5個(gè)TERT突變。在一個(gè)家庭內(nèi)發(fā)現(xiàn) TERC基因雜合突變。所有的 TERT和TERC基因突變雜合子攜帶者比同年齡的家庭成員無(wú)突變的端粒較短。因此，在TERT和TERC基因突變導(dǎo)致端粒縮短隨著時(shí)間的推移，導(dǎo)致成人發(fā)病的特發(fā)性肺纖維化的敏感性急劇增加。

有研究發(fā)現(xiàn)，SFTPA2基因雜合突變(OMIM#178642)和家族性肺纖維化有關(guān)［13，15］。GM-CSF受體的基因突變引起的缺陷破壞肺泡巨噬細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致肺泡蛋白沉積癥。最近的全基因組連鎖掃描顯示，MUC5B基因啟動(dòng)子的變異與家族性和散發(fā)性IPF的發(fā)展有關(guān)［16］。

2.表面活性物質(zhì)的功能

肺表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞合成的復(fù)雜的磷脂蛋白復(fù)合物。它的結(jié)構(gòu)在不同種屬間非常類(lèi)似，包括70%～80%磷脂、10%蛋白質(zhì)和約10%中性脂質(zhì)。磷脂的主要成分是磷脂酰膽堿，其中二飽和酯酰卵磷脂約占40%，是最重要的表面活性磷脂。此外，還有其他的磷脂形式，如磷脂酰甘油、磷脂酰肌酐、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂磷酸二酯酶等一些小分子磷脂和中性脂質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的肺表面活性蛋白有4種，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的順序命名為SP-A、B、C和D四種亞型。其中SP-A、SP-B、SP-D來(lái)源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和支氣管非纖毛上皮細(xì)胞，SP-C來(lái)源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。按其生物化學(xué)特性又分為2大類(lèi)，大分子親水SP(SP-A、SP-D)和小分子疏水性SP(SP-B、SP-C)。SP-A占SP總量的50%，是鈣離子依賴(lài)性糖結(jié)合蛋白，在肺泡中的結(jié)構(gòu)是由6個(gè)三聚體組成的18個(gè)單位的花束狀結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)由N-端、膠原樣區(qū)、頸區(qū)和糖基識(shí)別區(qū)4個(gè)區(qū)域組成，在頸區(qū)和糖基識(shí)別區(qū)間有脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，可以同二棕?cái)R酞磷脂酞膽堿(brown phthalein phospholipids phthalein choline，DPPC)等表面活性磷脂結(jié)合，起到維持表面活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，并促進(jìn)脂質(zhì)重吸收，在一定條件下抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌表面活性物質(zhì)。在Ca+存在下，SP-A可與脂質(zhì)結(jié)合并促進(jìn)囊泡狀脂質(zhì)聚集，SP-A的膠原樣螺旋結(jié)構(gòu)與其免疫防御功能相關(guān)。SP-D大部分存在于肺泡液中，因其不能與磷脂酰膽堿結(jié)合，故其在表面張力中的意義不大，但在免疫調(diào)解中起主要作用。SP-D能識(shí)別病原體如細(xì)菌、病毒、真菌表面的糖基結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合，也能與肺泡巨噬細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞結(jié)合，共同調(diào)理吞噬作用。另外，在補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SP-D有抗氧化作用，在SP-D缺乏的大鼠體內(nèi)，活性氧的危害明顯增加。SP-D同時(shí)具有調(diào)節(jié)免疫和抑制炎癥的作用，SP-D能與免疫系統(tǒng)的其他成分一起調(diào)節(jié)由感染原或過(guò)敏原引起的二級(jí)免疫反應(yīng)，能夠快速消除凋亡細(xì)胞，避免炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)展，SP-D缺乏可增加內(nèi)毒素血癥時(shí)肺損傷［17］。

SP-B和SP-C是疏水性SP，SP-B主要作用是促進(jìn)磷脂的吸附，加速肺泡氣-液界面上肺表面活性物質(zhì)薄膜的形成。SP-C分子是疏水性多肽，主要成α螺旋，僅來(lái)自肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，通過(guò)共價(jià)鍵與2個(gè)棕櫚酰基結(jié)合，維持脂質(zhì)的表面活性。研究表明，肺表面活性物質(zhì)能降低肺泡表面張力，從而降低呼吸做功、防止呼氣時(shí)肺泡萎陷，這種功能主要依賴(lài)于磷脂、中性脂質(zhì)和表面蛋白B和C的相互作用［18］。

其次，表面活性物質(zhì)在肺的固有防御反應(yīng)中起著重要作用，過(guò)去這種作用絕大部分歸功于親水蛋白SP-A和SP-D［19］。而近來(lái)研究表明，SP-C在對(duì)病原體局部免疫反應(yīng)(包括直接和間接)中有重要調(diào)節(jié)作用。成熟SP-C和脂多糖的直接作用表明，SP-C參與肺部防御［20］。SP-B缺乏可引起SP-C合成受阻。此外，發(fā)現(xiàn)SP-C基因敲除的小鼠和缺乏SP-C患間質(zhì)性肺疾病的患者中有持續(xù)的炎癥反應(yīng)和進(jìn)行性肺泡結(jié)構(gòu)改變也印證了這一論點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，I73T突變導(dǎo)致肺泡Ⅱ型細(xì)胞前SP-C處理受損，壓力承受力的改變和表面活性物質(zhì)的脂質(zhì)成分改變，并激活免疫系統(tǒng)的細(xì)胞［21］。SP-B缺乏可引起原因不明的足月新生兒RDS，新生兒RDS SP-B mRNA較對(duì)照組明顯減低，也證實(shí)了SP-B缺乏與新生兒RDS發(fā)病有關(guān)［22］。SFTPC突變與家族性和散發(fā)性有關(guān)［23］。

一般認(rèn)為，表面活性物質(zhì)的主要活性成分磷脂酰膽堿由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，肺泡Ⅱ型細(xì)胞中含有合成肺表面活性物質(zhì)的關(guān)鍵酶，這些磷脂成分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，而后通過(guò)某種機(jī)制轉(zhuǎn)移到高爾基體，轉(zhuǎn)化成大的聚集體即板層體。在板層體內(nèi)卵磷脂與表面活性蛋白結(jié)合成雙分子層后以胞外分泌形式分泌到肺泡腔中，形成一定規(guī)律的管狀結(jié)構(gòu)分布于氣-液交界面，維持肺泡形態(tài)的穩(wěn)定。肺泡內(nèi)表面活性物質(zhì)有2種形式，一種為具有生物活性的高密度脂蛋白的大聚合體，包括板層體、管髓體和多層脂囊；另一種是無(wú)生物活性的低密度脂蛋白的小聚合體，由代謝終產(chǎn)物單層脂囊構(gòu)成。正常情況下，大聚合體和小聚合體有穩(wěn)定的比例，處于動(dòng)態(tài)平衡。

表面活性物質(zhì)分泌到肺泡腔后可迅速被清除，以維持其穩(wěn)定。其清除的途徑有多種，可經(jīng)氣管清除，少數(shù)也可通過(guò)淋巴系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)清除或肺泡巨噬細(xì)胞吞噬后降解。此外，大部分的表面活性物質(zhì)通過(guò)入胞作用被肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞重?cái)z取，重新運(yùn)送至板層體貯存以備再利用。也有研究認(rèn)為，表面活性物質(zhì)被攝取后成為多囊泡體，部分囊泡體與初級(jí)溶酶體融合，降解為膽堿、脂肪酸等，然后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重新合成表面活性物質(zhì)。其他囊泡體則與板層體結(jié)合直接循環(huán)利用。

3.基因突變引起間質(zhì)性肺疾病的機(jī)制

攜有雜合SP-B生產(chǎn)障礙相關(guān)基因的小鼠模型中，SP-B產(chǎn)生減少可導(dǎo)致小鼠在暴露于過(guò)氧環(huán)境時(shí)出現(xiàn)慢性肺損傷［24］。外源性SP-B可修復(fù)由此導(dǎo)致的肺功能障礙。SP-B缺乏癥導(dǎo)致異常的表面活性物質(zhì)成分和功能，以及板層小體的結(jié)構(gòu)破壞［25-26］。在體外卵磷脂的成分和合成正常，但在患兒體內(nèi)用同位素示蹤其表面活性物質(zhì)的前體研究中，磷脂有一定程度減少［25］。SP-B缺乏的同時(shí)有SP-C的不完全加工，6KDa的SP-C前體(保留氨基末端側(cè)翼12個(gè)氨基酸)的存在表明，缺乏SP-C前體的最終切割步驟，這很可能是因?yàn)榘鍖芋w的功能缺失引起的［27］。而不完全加工的SP-C前體在體外抑制表面活性物質(zhì)的功能，可以進(jìn)一步增強(qiáng)SP-B缺乏癥的表面活性物質(zhì)功能缺失。通過(guò)研究SP-B基因缺乏的小鼠發(fā)現(xiàn)，SP-B在降低肺表面張力、proSP-C的水解加工過(guò)程、將表面活性磷脂運(yùn)送到板層體及維持新生兒階段正常呼吸功能中起著至關(guān)重要的作用。

目前，對(duì)于SP-C基因突變的致病機(jī)制認(rèn)為有2種模式［28］：一種如前所述，基因突變發(fā)生在SP-C基因的BRICHOS結(jié)構(gòu)域部位。BRICHOS結(jié)構(gòu)域與癌癥、神經(jīng)退行性病變、肺間質(zhì)性疾病有關(guān)。BRICHOS區(qū)域在SP-C蛋白前體復(fù)雜的翻譯過(guò)程中起著重要作用：①輔助蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑；②協(xié)助細(xì)胞內(nèi)蛋白酶解系統(tǒng)的獨(dú)特性轉(zhuǎn)化；③避免蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)淀粉樣沉積。BRICHOS區(qū)域基因突變的SP-C前體蛋白可導(dǎo)致蛋白錯(cuò)誤折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和合成異常，導(dǎo)致一系列毒性作用，如誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡蛋白酶3和4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些因素可使細(xì)胞損傷和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致ILD。如基因突變發(fā)生在鄰近SP-C基因的BRICHOS結(jié)構(gòu)域部位，含SP-C突變體的多囊小泡或被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜進(jìn)而融合、釋放出的SP-C突變體會(huì)抑制細(xì)胞膜的再吸收循環(huán)功能或經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)包涵體后被逐漸降解，這種突變不會(huì)影響BRICHOS結(jié)構(gòu)域。這時(shí)，SP-C的合成僅輕度減少，肺組織損傷相對(duì)較輕［27］。

ABCA3基因突變可以分為2類(lèi)，類(lèi)型Ⅰ為細(xì)胞內(nèi)定位異常，如L101P、L982P、L1553P、Q1591P突變；類(lèi)型Ⅱ?yàn)榧?xì)胞定位正常，但ATP水解活性異常，如R295C、N568D、G1221S和L1580P突變。R280C和L101P突變導(dǎo)致體外培養(yǎng)的肺上皮細(xì)胞ABCA3蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)或折疊異常，滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激性、損傷易感性和凋亡標(biāo)記物表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞死亡［29］。此外，ABCA3基因突變導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞的完整性和功能受到破壞，且表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)。

在FPF或散發(fā)的IPF患者基因突變和多態(tài)性分析，研究肺纖維化的遺傳易感性致病機(jī)制取得了重大進(jìn)展。目前為止所有突變確定共同的問(wèn)題是，突變所影響的基因(如SPA、SPC、MUC5B)是否在肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)或是否導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞可識(shí)別分子改變(TERT、TERC)。例如端粒在幾乎所有散發(fā)的IPF患者的肺泡上皮細(xì)胞均短。這些知識(shí)使IPF發(fā)病機(jī)制理解圍繞在上皮細(xì)胞的作用和功能，在肺纖維化的發(fā)展起著作用。

外部損傷是基因突變的易感個(gè)體發(fā)展為肺纖維化的必要因素。理論上這些突變可能直接導(dǎo)致肺纖維化，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均不支持這種可能性。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素如污染、粉塵或煙霧，可能在遺傳易感個(gè)體導(dǎo)致肺纖維化。IPF患者比健康者煙霧和粉塵接觸往往更為常見(jiàn)，非吸煙 IPF患者較吸煙患者存活長(zhǎng)［30］。其他暴露因素還有胃食管反流(gastroesophageal reflux，GER)，尤其是微量吸入。有研究認(rèn)為，GER與特發(fā)性肺纖維化有關(guān)［31］。但也有研究并不支持GER與IPF相關(guān)［32］。應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑或外科胃底折疊術(shù)治療GER與疾病發(fā)展減緩和更好的生存率有關(guān)［33］，說(shuō)明了GER和微量吸入與疾病的發(fā)展和(或)遺傳易感個(gè)體的疾病加重有關(guān)。

特發(fā)性肺纖維化的基因突變是持久的，不可逆的變化。通過(guò)持續(xù)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)或分泌TGF-β可能有助于疾病的進(jìn)展。然而，表面活性物質(zhì)的突變是唯一明確的分子途徑的基因突變，可以解釋它們?cè)诜卫w維化的作用。MUC5B、TERT、TERC突變患者導(dǎo)致肺纖維化的分子機(jī)制仍不清楚。IPF的進(jìn)行性進(jìn)展非遺傳性的因素必須考慮，IPF的成纖維細(xì)胞表型的持久的改變導(dǎo)致IPF進(jìn)展。

4.表觀遺傳學(xué)

最近公認(rèn)由表觀遺傳學(xué)影響的基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)環(huán)境或其他應(yīng)激可以引起持久的細(xì)胞，組織或生物體的表型變化的重要機(jī)制［34］。表觀遺傳改變包括DNA甲基化改變，組蛋白修飾或microRNA的表達(dá)［34-35］。暴露于環(huán)境壓力如煙草煙霧［36-37］、空氣污染［38］和年齡老化［39］可導(dǎo)致表觀遺傳DNA改變。對(duì)IPF肺的表觀遺傳學(xué)改變的研究，miRNA微陣列分析顯示，18個(gè)小分子RNA包括let-7d水平下降［40］。Let-7d microRNA的定位局限于肺泡上皮，且上皮細(xì)胞let-7d水平下降與間充質(zhì)蛋白如N-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-SMA的表達(dá)增加有關(guān)。全基因組甲基化分析在IPF的肺確定了大量的差異甲基化基因［41-42］。許多基因的DNA甲基化變化與mRNA表達(dá)相對(duì)應(yīng)，其中一些在IPF中起重要作用，如細(xì)胞凋亡和生物合成細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控［43］。這些研究結(jié)果表明，甲基化和(或)其他表觀遺傳變化在IPF發(fā)病起很重要的作用和持久的影響基因表達(dá)可部分解釋病情的進(jìn)展。

5.環(huán)境因素

除了遺傳因素外，環(huán)境因素也影響疾病的發(fā)展。目前研究認(rèn)為，煙草煙霧、暴露于空氣污染物和病毒的作用均影響肺纖維化的發(fā)病。一些研究還表明，肺纖維化患者肺組織中存在各種病毒蛋白，且表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞。

6.年齡老化

年齡老化與間質(zhì)性肺疾病發(fā)病有關(guān)。在兒童肺纖維化疾病的患病率比成人要低得多。一方面，兒童和成人接觸的環(huán)境不同；另一方面，隨年齡增長(zhǎng)，機(jī)體對(duì)損傷的修復(fù)能力減低，與胚胎干細(xì)胞不同，成人干細(xì)胞并非不朽，隨著年齡的增長(zhǎng)其端粒長(zhǎng)度降低。這樣的內(nèi)源性干細(xì)胞池的自然有限的置換能力，可能通過(guò)干細(xì)胞池耗盡，或通過(guò)遺傳，或獲得的突變改變了相應(yīng)的干細(xì)胞功能的后果。在應(yīng)對(duì)各種壓力包括DNA損傷、氧化劑和端粒侵蝕，由于衰老致細(xì)胞的有限壽命。在成人ILD患者的肺，所有這些損傷的形式得到證實(shí)。

【肺泡上皮細(xì)胞的關(guān)鍵作用】

基于臨床和實(shí)驗(yàn)研究，肺泡上皮在ILD的發(fā)病中起關(guān)鍵性作用。損傷后AECs通過(guò)再上皮化過(guò)程進(jìn)行正常肺泡結(jié)構(gòu)的修復(fù)，或通過(guò)EMT過(guò)程參與纖維化。肺上皮細(xì)胞是間質(zhì)性肺疾病肺損傷的原發(fā)部位。雖然有各種啟動(dòng)因素，終端階段的特點(diǎn)是肺纖維化。

在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞的極性和特有標(biāo)記消失，細(xì)胞的緊密連接部溶解，肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重組，間質(zhì)基因表達(dá)程序得以誘導(dǎo)，細(xì)胞在基膜及組織中遷移，而持續(xù)的細(xì)胞凋亡被證實(shí)是推動(dòng)這個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵。細(xì)胞凋亡的一般特征是細(xì)胞內(nèi)表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)，相鄰細(xì)胞特異地識(shí)別磷脂酰絲氨酸需要許多抗炎分子的參與，如TGF-β。而基底膜長(zhǎng)時(shí)間的破壞造成AECs與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用和相互干擾，改變了細(xì)胞功能，使得氧化劑、酶類(lèi)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等產(chǎn)物失衡，造成TGF-β不斷引起上皮細(xì)胞凋亡同時(shí)又不斷促進(jìn)自身產(chǎn)生的惡性循環(huán)。

上皮細(xì)胞凋亡是間質(zhì)性肺疾病的初始事件。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上皮細(xì)胞凋亡之后重建，重建過(guò)程包括上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，凝血途徑的激活，新生血管形成，再上皮化、纖維化。細(xì)胞凋亡在維持細(xì)胞存活與死亡之間的平衡中起重要作用。有2個(gè)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。一個(gè)是直接途徑從死亡受體連接半胱天冬酶(caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活和細(xì)胞死亡。通過(guò)刺激如藥物、輻射、感染病原啟動(dòng)的其他途徑和活性氧在線粒體中的啟動(dòng)。最近證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的細(xì)胞器。各種應(yīng)激會(huì)損害蛋白質(zhì)折疊，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［44］。活性半胱天冬酶介導(dǎo)蛋白質(zhì)底物的裂解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞凋亡在肺疾病中可能起重要作用。實(shí)質(zhì)細(xì)胞過(guò)度死亡意味著不可逆的組織損傷，可能導(dǎo)致肺纖維化。

肺泡上皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)上皮基底膜形成了間隙。成纖維細(xì)胞通過(guò)這些間隙進(jìn)入肺泡腔，導(dǎo)致肺泡內(nèi)纖維化。間質(zhì)纖維化及后續(xù)肺泡內(nèi)纖維化可導(dǎo)致肺損傷后結(jié)構(gòu)重構(gòu)。在IPF已經(jīng)證實(shí)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，［45-46］。以及死亡受體/配體的死亡信號(hào)，如活性氧族、氮族、促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和其他凋亡的分子信號(hào)參與了間質(zhì)性肺疾病的病理生理學(xué)。

肺泡上皮細(xì)胞不僅是肺損傷的原發(fā)部位，也通過(guò)一些機(jī)制參與炎癥反應(yīng)。在IPF上皮細(xì)胞能分泌大量分子，如生長(zhǎng)因子及其受體、蛋白酶、表面活性蛋白、黏附分子和基質(zhì)成分，它們可能調(diào)節(jié)肺內(nèi)的炎癥和纖維化反應(yīng)。突出的肺泡上皮細(xì)胞損傷是IPF的特征。廣泛嚴(yán)重?fù)p傷的急性炎癥區(qū)域Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞顯著降低，肺泡Ⅱ型細(xì)胞是修復(fù)細(xì)胞，上皮細(xì)胞損傷后快速增殖。在大多數(shù)嚴(yán)重?fù)p傷的區(qū)域，基底膜由增殖的立方形Ⅱ型細(xì)胞所覆蓋，Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞的死亡由大量成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞所取代。

博萊霉素可迅速產(chǎn)生大量肺的DNA損傷。該模型電子顯微鏡的研究結(jié)果顯示，在細(xì)支氣管和肺泡上皮有細(xì)胞凋亡的特征。因此，DNA損傷和上皮細(xì)胞凋亡可能與肺纖維化有關(guān)。隨后在IPF患者用原位DNA缺口末端標(biāo)記法和電子顯微鏡也證實(shí)，肺泡上皮細(xì)胞有DNA損傷或上皮細(xì)胞的凋亡。DNA損傷和細(xì)胞凋亡在急性肺損傷和彌漫性肺泡損傷的肺上皮細(xì)胞有報(bào)道［47］。

一些細(xì)胞死亡需要Fas/FasL途徑，即半胱天冬酶激活。研究證實(shí)，廣譜半胱天冬酶抑制劑，在體內(nèi)抑制細(xì)胞內(nèi)的半胱天冬酶樣蛋白酶活化，并保護(hù)小鼠免受LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。它也減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，說(shuō)明上皮細(xì)胞凋亡可能在肺損傷和纖維化的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

Fas/FasL途徑是細(xì)胞凋亡信號(hào)受體分子代表系統(tǒng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液能夠誘導(dǎo)人的遠(yuǎn)端肺上皮細(xì)胞的凋亡并表達(dá)Fas，F(xiàn)as/FasL通路被證實(shí)是引起肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞凋亡的重要途徑［48-49］。在IPF患者肺組織中的滲出炎性細(xì)胞的FasL mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)。在小鼠博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化和人類(lèi)的IPF的平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞有FasL分子表達(dá)，體外也證實(shí)FasL陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠肺的上皮細(xì)胞凋亡［50］。抑制這一途徑可能是一種新的肺損傷和纖維化的治療策略。由于氧化還原調(diào)控與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，氧化損傷的細(xì)胞保護(hù)策略也是抗肺損傷和纖維化的有前景的策略。如硫氧還蛋白-1是一種重要的自由基清除劑。硫氧還蛋白-1轉(zhuǎn)基因小鼠可降低高氧暴露后肺泡損傷。

【上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用】

嚴(yán)重的肺上皮細(xì)胞的損傷和不完全的修復(fù)，成纖維細(xì)胞可增殖，可損害正常的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用，從而導(dǎo)致肺纖維化。上皮細(xì)胞也可能通過(guò)釋放細(xì)胞因子控制成纖維細(xì)胞，抑制成纖維細(xì)胞的活性。通過(guò)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖和分化完成上皮層的正常修復(fù)。這個(gè)過(guò)程受肺成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生的因子所影響。如炎癥刺激持續(xù)存在可導(dǎo)致修復(fù)異常，引起肺纖維化。

從纖維化肺分離的異常表型成纖維細(xì)胞在體外可產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡和壞死的因子［51］。這些異常的上皮間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，通過(guò)阻止正常上皮的修復(fù)和促成纖維細(xì)胞異常增殖的進(jìn)展，可引起肺纖維化疾病發(fā)病和加重。

1.上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個(gè)上皮細(xì)胞獲得與間充質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的分子和細(xì)胞生理特征的過(guò)程。通常緊隨特異性生長(zhǎng)因素如TGF-β之后［52-53］。正常組織的平衡不需要EMT；相反，在組織損傷和重塑時(shí)EMT程序激活［54-55］。有免疫組化研究表明，在IPF患者的肺泡細(xì)胞具有EMT的證據(jù)［52，56］。

雖然有證據(jù)表明，在IPF患者肺上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征，這些在間質(zhì)的纖維化過(guò)程中變化的作用仍然不清楚。在人類(lèi)中，唯一支持的證據(jù)是從IPF患者分離的成纖維細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞蛋白角蛋白18［57］。

在IPF患者UPR、TGF-β和EMT激活與肺纖維化有關(guān)。表面活性物質(zhì)的突變導(dǎo)致UPR的激活，這激活是否足以導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)展仍然未證實(shí)。SPA的基因突變導(dǎo)致上皮細(xì)胞的UPR激活，G231V SPA的雜合突變患者支氣管肺泡灌洗液中具有較正常者更高的TGF-β水平［58］。不同表達(dá)的G231V或F198S SPA突變的上皮細(xì)胞也表達(dá)高水平的TGF-β，這些觀察揭示了UPR激活和TGF-β產(chǎn)生的關(guān)系，UPR的激活可能通過(guò)增強(qiáng)分泌TGF-β促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分泌細(xì)胞室，可通過(guò)高爾基復(fù)合體參與膜蛋白的制造、折疊和成熟的包裝和運(yùn)輸。在缺氧、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，未折疊蛋白產(chǎn)生增多，當(dāng)超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，產(chǎn)生了大量的錯(cuò)誤折疊和未折疊的蛋白，細(xì)胞的蛋白質(zhì)需求和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成、加工和包裝必需蛋白的能力之間不平衡［59］。應(yīng)對(duì)這個(gè)應(yīng)激，細(xì)胞增加折疊蛋白的產(chǎn)生和加速未折疊蛋白的降解稱(chēng)為UPR，導(dǎo)致生化通路激活以匹配內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的能力。這樣，可以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，阻止細(xì)胞凋亡。如果UPR無(wú)法達(dá)到需求，激活終端UPR和細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡的途徑死亡［59-60］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含有3個(gè)未重疊蛋白的傳感器-需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)，蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和激活的轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，IRE1α感受與應(yīng)激相關(guān)的未折疊的蛋白，經(jīng)歷反式自身磷酸化。這種磷酸化發(fā)信號(hào)使凋亡通路的激活［61］。IRE1α是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的關(guān)鍵介質(zhì)。此外，IRE1α具有核糖核酸酶，激活時(shí)，拼接X(jué)BP1(x-boxbinding protein 1)的 mRNA并產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1S，其目標(biāo)提高ER蛋白折疊的能力。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR的兩標(biāo)記物是IRE1α的磷酸化和XBP1拼接。

研究證實(shí)，在IPF肺泡Ⅱ型細(xì)胞UPR激活的標(biāo)記物增加［62-64］，證實(shí)從IPF分離的Ⅱ型細(xì)胞活性的磷酸化的IRE1α、XBP1S的水平增加。

在IPF中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的許多可能的原因已確定，如皰疹類(lèi)病毒感染、基因突變［64-65］。因此，如果UPR激活是一個(gè)促進(jìn)發(fā)展IPF的中心途徑，那么觸發(fā)UPR激活的其他因子與肺纖維化有關(guān)。

3.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

IPF患者肺的活性TGF-β水平增加。TGF-β的激活的纖維化過(guò)程包括抑制AEC增殖，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化［66］，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的程序的活化［52］。

TGF-β是細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)的最有力的推動(dòng)者，也是一個(gè)強(qiáng)有力的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化因子。上皮細(xì)胞TGF-β增加和IPF患者肺組織和嚙齒類(lèi)動(dòng)物博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的巨噬細(xì)胞的增加一致。在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的肺膠原沉積的增加可通過(guò)抗TGF-β抗體治療減少或重組TGFRⅡ治療減少［67］。核心蛋白聚糖，一種自然產(chǎn)生拮抗TGF-β1的生物活性的生物分子，可以減輕損傷肺的TGF-β過(guò)度信號(hào)。

TGF-β1在各種細(xì)胞可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TGF-β1介導(dǎo)凋亡的機(jī)制在不同細(xì)胞類(lèi)型變化。TGF-β1是通過(guò)激活caspase-3和下調(diào)p21表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也是Fas介導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)因子，在治療肺損傷和纖維化時(shí)TGF-β1在肺上皮細(xì)胞凋亡的這種功能應(yīng)考慮。TGF-β1在肺上皮細(xì)胞過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠的肺纖維化，TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡是肺纖維化早期的關(guān)鍵。

內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)也被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要因素。ET-1是一個(gè)21個(gè)氨基酸的肽，已證明具有包括成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的有絲分裂原、刺激膠原合成的許多功能。特發(fā)性肺纖維化患者血漿ET-1水平均提高。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)度表達(dá)ET-1表達(dá)引起肺和腎間質(zhì)纖維化。最近的研究表明，AEC產(chǎn)生ET-1在生理上相關(guān)的水平可通過(guò)刺激內(nèi)源性TGF-β的產(chǎn)生引起肺泡EMT。這些數(shù)據(jù)支持了ET-1聯(lián)合TGF-β在EMT和肺纖維化起作用［68］。

上皮細(xì)胞在TGF-β1介導(dǎo)下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)作用下，可激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)纖維化的發(fā)生［69］。

4.血管緊張素Ⅱ

研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ1類(lèi)受體(angiotensin I，AT1)過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)局部肺纖維化的發(fā)生，參與氣道重構(gòu)，血管緊張素可能在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。血管緊張素Ⅱ和血管緊張素原體外誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。血管緊張素Ⅱ體外通過(guò)血管緊張素Ⅱ的1類(lèi)受體激活和TGF-β的自分泌作用誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞增生。ACE抑制劑抑制在體外Fas和TNF-α誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞凋亡，ACE抑制劑卡托普利減輕野百合堿或胺碘酮誘發(fā)的大鼠肺的纖維化［70］，并減輕呼吸機(jī)所致大鼠肺肺損傷［71］。AT1拮抗劑減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化和支氣管肺泡灌洗液中的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、TNF-α和TGF-β1減少［72］。

總之，基因突變或變異是個(gè)體的易患疾病的基礎(chǔ)，而環(huán)境暴露是必要的因素。脆弱的肺泡上皮細(xì)胞在反復(fù)的損傷因素作用下，引起異常的修復(fù)和進(jìn)行性纖維化［73-74］，見(jiàn)圖2-1。上皮細(xì)胞功能障礙是間質(zhì)性肺疾病的發(fā)病其關(guān)鍵作用。上皮細(xì)胞功能障礙分子介質(zhì)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，過(guò)度TGF-β活化，生長(zhǎng)因子、趨化因子、EMT、纖維細(xì)胞招募和成纖維細(xì)胞分化。這些分子介質(zhì)與間質(zhì)性疾病的纖維化有關(guān)。

（劉秀云　江載芳）

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