第二章　表面活性物質基因突變在間質性肺疾病發病的致病機制

間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)發病和進展的機制仍無定論。一直以來，人們認為慢性ILD和肺纖維化主要起因于肺泡上皮損傷繼發的慢性炎癥。若損傷得以控制，修復過程就會逆轉纖維化的趨勢；若損傷持續，修復過程就會導致瘢痕形成和局部結構改變。但一些對于成人ILD病例的研究顯示，過敏性肺炎的疾病早期炎癥很明顯，后期并未出現纖維化，而廣泛纖維化的病理類型中炎癥的成分卻很少。國外有文獻報道，特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種涉及異常創傷愈合的功能紊亂，進行性的上皮損傷和激活是纖維形成和間質細胞增殖的關鍵，這種作用并不依賴于炎癥。

近年來研究認為，IPF的發病機制分為3個病理生理階段，易感階段、起始階段和進展階段。易感階段包括基因突變或變異(即SNPs)，使易患個體發展肺纖維化；個體的生命期間環境暴露導致慢性上皮細胞的損傷，導致端粒縮短，這些因素最終導致上皮細胞功能障礙。并不是所有的人在這個階段均會出現臨床相關的疾病，它取決于暴露于這些因素的程度和持續時間。在起始階段，上皮細胞功能障礙分子介質如內質網應激，過度TGF-β活化，生長因子、趨化因子或Wnt分泌導致EMT，纖維細胞招募和成纖維細胞分化。這些導致疾病的進展階段，在這期間的病理間質細胞釋放異常類型的基質蛋白，從而重塑和瘢痕肺。病理重塑的基質或在成纖維細胞的表觀遺傳學的改變可能會導致間充質細胞激活和加重進行性肺纖維化。

【基因突變和其相關的機制】

1.基因突變

兒童ILD領域的一個重要發展是發現了先天性表面活性物質代謝異常，包括表面活性蛋白B、表面活性蛋白C和ABCA3基因的突變。表面活性蛋白B、C和ABCA3是維持表面活性物質穩態和運輸的必要物質。這些基因突變編碼的蛋白質會導致表面活性物質功能障礙，同時引起致命的嬰兒慢性呼吸系統疾病。早產所致肺表面活性物質缺乏是新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome，RDS)的主要原因?；加蟹尾考膊〉淖阍聥雰汉突加袃和g質性肺疾病的較大兒童均有可能由肺表面活性物質代謝紊亂所引起。2001年Nogee等［1］描述了一家患有間質性肺疾病的病例。采用候選基因方法識別了表面活性蛋白C(SP-C)的編碼基因雜合子突變，外顯子4脫落和末端缺失了37個氨基酸(SPCΔexon4)。此報告顯示了SP-C突變，影響了肺泡Ⅱ型細胞表面活性蛋白的生產和分泌，導致間質性肺疾病。之后Thomas等［2］報道了家族性肺纖維化(familial pulmonary fibrosis，FPF)患者中的一個大家族中，SP-C末端部分Q188L的錯義突變。后續報告發現了另外的6個SP-C基因的突變與肺纖維化相關［3］。這些突變的大多數位于BRICHOS區域，其功能之一為防止SP-C的聚合，同時協助其插入膜［4］。雖然這些研究提供了強有力的證據，表明SPC基因突變與特異家族性肺纖維化有關。但這些突變發生在只有1%的散發性肺纖維化的病例［5-6］。利用單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)在一大家族的肺纖維化個體進行超過6000標記面板全基因組連鎖分析［7］。分析確定染色體10q22為受累部位。位于這一染色體區域的編碼表面活性蛋白A1、A2和D的基因，被確定為候選基因。測序鑒定這些基因的錯義突變預測表面活性蛋白A2的G231V突變［7］。隨后在FPF大家族的表面活性物質A基因發現第二種錯義的突變(F198V)。這兩種突變預測的翻譯蛋白不穩定，在內質網中突變蛋白異常保留，并不能形成高次序的聚合物。

SP-B基因突變可引起致命性新生兒RDS。文獻還報道，SP-B基因多態性與足月兒呼吸窘迫綜合征密切相關［8］。近期發現，SP-C基因及ABCA3基因突變與兒童間質性肺疾病有關［9-11］。SP-C基因變異表現為不同的基因顯型，而有SP-C基因突變的兒童大多數表現為非特異性間質性肺炎，少數合并肺泡蛋白沉積。有SP-C突變的成人常表現為非特異性間質性肺炎、脫屑性間質性肺炎或無癥狀。不伴有SP-B、SP-C基因突變的ABCA3基因突變與新生兒致命性呼吸衰竭有關，年齡稍大的兒童可表現為非致命性肺間質性疾病，嬰兒可表現為肺泡蛋白沉積癥、脫屑性間質性肺炎或嬰兒慢性肺炎［10］。

甲狀腺轉錄因子1(thyroid transcription factor 1，TTF1)，也被稱為NKX2.1。甲狀腺轉錄因子1是轉錄因子同源盒基因家族的一個成員，對重要的表面活性物質的產生和功能的多種基因表達很重要。這些基因包括SP-A、SP-B和SP-C、ABCA3。該基因位于14號染色體長臂(14q13.3)。NKX2.1基因的缺失或完全喪失功能的突變也能導致嚴重的RDS和ILD的表型。NKX2.1基因在甲狀腺、中樞神經系統表達，NKX2.1基因突變的患者可能出現這些器官系統相關的癥狀。所以，這種疾病可用“腦-甲狀腺-肺”綜合征來描述［12］。

關于NKX2.1單倍劑量不足(haplo-insufficiency)的肺疾病自然病史并不清楚。有報道新生兒期和嬰兒早期引起致命性的肺部疾病，也有在較輕或無肺疾病的老年患者中發現。染色體16q24.1微缺失和FOXF1雜合突變功能缺失導致肺泡毛細血管發育不良伴靜脈錯位。

近年研究發現，家族性的肺纖維化患者與TERT、TERC基因突變有關［13-14］。我們在2個家庭的5號染色體上使用疾病基因的連鎖圖譜。在兩個肺疾病的家庭的排序的候選基因TERT區間內，共隔離顯示錯義突變和移碼突變。TERT編碼端粒酶逆轉錄酶與端粒酶RNA組成(RNA component of telomerase，TERC)是維持端粒完整性所需要的。測序44個額外的無關的家庭先證者和44例散發的間質性肺疾病，顯示其他5個TERT突變。在一個家庭內發現 TERC基因雜合突變。所有的 TERT和TERC基因突變雜合子攜帶者比同年齡的家庭成員無突變的端粒較短。因此，在TERT和TERC基因突變導致端?？s短隨著時間的推移，導致成人發病的特發性肺纖維化的敏感性急劇增加。

有研究發現，SFTPA2基因雜合突變(OMIM#178642)和家族性肺纖維化有關［13，15］。GM-CSF受體的基因突變引起的缺陷破壞肺泡巨噬細胞的功能，從而導致肺泡蛋白沉積癥。最近的全基因組連鎖掃描顯示，MUC5B基因啟動子的變異與家族性和散發性IPF的發展有關［16］。

2.表面活性物質的功能

肺表面活性物質是由肺泡Ⅱ型上皮細胞合成的復雜的磷脂蛋白復合物。它的結構在不同種屬間非常類似，包括70%～80%磷脂、10%蛋白質和約10%中性脂質。磷脂的主要成分是磷脂酰膽堿，其中二飽和酯酰卵磷脂約占40%，是最重要的表面活性磷脂。此外，還有其他的磷脂形式，如磷脂酰甘油、磷脂酰肌酐、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂磷酸二酯酶等一些小分子磷脂和中性脂質。目前發現的肺表面活性蛋白有4種，根據發現的順序命名為SP-A、B、C和D四種亞型。其中SP-A、SP-B、SP-D來源于肺泡Ⅱ型上皮細胞和支氣管非纖毛上皮細胞，SP-C來源于肺泡Ⅱ型上皮細胞。按其生物化學特性又分為2大類，大分子親水SP(SP-A、SP-D)和小分子疏水性SP(SP-B、SP-C)。SP-A占SP總量的50%，是鈣離子依賴性糖結合蛋白，在肺泡中的結構是由6個三聚體組成的18個單位的花束狀結構，其分子結構由N-端、膠原樣區、頸區和糖基識別區4個區域組成，在頸區和糖基識別區間有脂質結合位點，可以同二棕擱酞磷脂酞膽堿(brown phthalein phospholipids phthalein choline，DPPC)等表面活性磷脂結合，起到維持表面活性物質結構的作用，并促進脂質重吸收，在一定條件下抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌表面活性物質。在Ca+存在下，SP-A可與脂質結合并促進囊泡狀脂質聚集，SP-A的膠原樣螺旋結構與其免疫防御功能相關。SP-D大部分存在于肺泡液中，因其不能與磷脂酰膽堿結合，故其在表面張力中的意義不大，但在免疫調解中起主要作用。SP-D能識別病原體如細菌、病毒、真菌表面的糖基結構并與之結合，也能與肺泡巨噬細胞及嗜酸性細胞結合，共同調理吞噬作用。另外，在補體實驗中發現，SP-D有抗氧化作用，在SP-D缺乏的大鼠體內，活性氧的危害明顯增加。SP-D同時具有調節免疫和抑制炎癥的作用，SP-D能與免疫系統的其他成分一起調節由感染原或過敏原引起的二級免疫反應，能夠快速消除凋亡細胞，避免炎癥反應的進一步發展，SP-D缺乏可增加內毒素血癥時肺損傷［17］。

SP-B和SP-C是疏水性SP，SP-B主要作用是促進磷脂的吸附，加速肺泡氣-液界面上肺表面活性物質薄膜的形成。SP-C分子是疏水性多肽，主要成α螺旋，僅來自肺泡Ⅱ型上皮細胞，通過共價鍵與2個棕櫚?；Y合，維持脂質的表面活性。研究表明，肺表面活性物質能降低肺泡表面張力，從而降低呼吸做功、防止呼氣時肺泡萎陷，這種功能主要依賴于磷脂、中性脂質和表面蛋白B和C的相互作用［18］。

其次，表面活性物質在肺的固有防御反應中起著重要作用，過去這種作用絕大部分歸功于親水蛋白SP-A和SP-D［19］。而近來研究表明，SP-C在對病原體局部免疫反應(包括直接和間接)中有重要調節作用。成熟SP-C和脂多糖的直接作用表明，SP-C參與肺部防御［20］。SP-B缺乏可引起SP-C合成受阻。此外，發現SP-C基因敲除的小鼠和缺乏SP-C患間質性肺疾病的患者中有持續的炎癥反應和進行性肺泡結構改變也印證了這一論點。研究發現，I73T突變導致肺泡Ⅱ型細胞前SP-C處理受損，壓力承受力的改變和表面活性物質的脂質成分改變，并激活免疫系統的細胞［21］。SP-B缺乏可引起原因不明的足月新生兒RDS，新生兒RDS SP-B mRNA較對照組明顯減低，也證實了SP-B缺乏與新生兒RDS發病有關［22］。SFTPC突變與家族性和散發性有關［23］。

一般認為，表面活性物質的主要活性成分磷脂酰膽堿由肺泡Ⅱ型上皮細胞在內質網合成，肺泡Ⅱ型細胞中含有合成肺表面活性物質的關鍵酶，這些磷脂成分在內質網中合成后，而后通過某種機制轉移到高爾基體，轉化成大的聚集體即板層體。在板層體內卵磷脂與表面活性蛋白結合成雙分子層后以胞外分泌形式分泌到肺泡腔中，形成一定規律的管狀結構分布于氣-液交界面，維持肺泡形態的穩定。肺泡內表面活性物質有2種形式，一種為具有生物活性的高密度脂蛋白的大聚合體，包括板層體、管髓體和多層脂囊；另一種是無生物活性的低密度脂蛋白的小聚合體，由代謝終產物單層脂囊構成。正常情況下，大聚合體和小聚合體有穩定的比例，處于動態平衡。

表面活性物質分泌到肺泡腔后可迅速被清除，以維持其穩定。其清除的途徑有多種，可經氣管清除，少數也可通過淋巴系統、血液循環系統清除或肺泡巨噬細胞吞噬后降解。此外，大部分的表面活性物質通過入胞作用被肺泡Ⅱ型上皮細胞重攝取，重新運送至板層體貯存以備再利用。也有研究認為，表面活性物質被攝取后成為多囊泡體，部分囊泡體與初級溶酶體融合，降解為膽堿、脂肪酸等，然后進入內質網重新合成表面活性物質。其他囊泡體則與板層體結合直接循環利用。

3.基因突變引起間質性肺疾病的機制

攜有雜合SP-B生產障礙相關基因的小鼠模型中，SP-B產生減少可導致小鼠在暴露于過氧環境時出現慢性肺損傷［24］。外源性SP-B可修復由此導致的肺功能障礙。SP-B缺乏癥導致異常的表面活性物質成分和功能，以及板層小體的結構破壞［25-26］。在體外卵磷脂的成分和合成正常，但在患兒體內用同位素示蹤其表面活性物質的前體研究中，磷脂有一定程度減少［25］。SP-B缺乏的同時有SP-C的不完全加工，6KDa的SP-C前體(保留氨基末端側翼12個氨基酸)的存在表明，缺乏SP-C前體的最終切割步驟，這很可能是因為板層體的功能缺失引起的［27］。而不完全加工的SP-C前體在體外抑制表面活性物質的功能，可以進一步增強SP-B缺乏癥的表面活性物質功能缺失。通過研究SP-B基因缺乏的小鼠發現，SP-B在降低肺表面張力、proSP-C的水解加工過程、將表面活性磷脂運送到板層體及維持新生兒階段正常呼吸功能中起著至關重要的作用。

目前，對于SP-C基因突變的致病機制認為有2種模式［28］：一種如前所述，基因突變發生在SP-C基因的BRICHOS結構域部位。BRICHOS結構域與癌癥、神經退行性病變、肺間質性疾病有關。BRICHOS區域在SP-C蛋白前體復雜的翻譯過程中起著重要作用：①輔助蛋白質進入分泌途徑；②協助細胞內蛋白酶解系統的獨特性轉化；③避免蛋白質在細胞內淀粉樣沉積。BRICHOS區域基因突變的SP-C前體蛋白可導致蛋白錯誤折疊、轉運和合成異常，導致一系列毒性作用，如誘導內質網應激作用、細胞毒性、細胞凋亡蛋白酶3和4誘導的細胞凋亡。這些因素可使細胞損傷和肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡導致ILD。如基因突變發生在鄰近SP-C基因的BRICHOS結構域部位，含SP-C突變體的多囊小泡或被轉運至細胞膜進而融合、釋放出的SP-C突變體會抑制細胞膜的再吸收循環功能或經高爾基體轉運至細胞內包涵體后被逐漸降解，這種突變不會影響BRICHOS結構域。這時，SP-C的合成僅輕度減少，肺組織損傷相對較輕［27］。

ABCA3基因突變可以分為2類，類型Ⅰ為細胞內定位異常，如L101P、L982P、L1553P、Q1591P突變；類型Ⅱ為細胞定位正常，但ATP水解活性異常，如R295C、N568D、G1221S和L1580P突變。R280C和L101P突變導致體外培養的肺上皮細胞ABCA3蛋白轉運或折疊異常，滯留在內質網中，增加了內質網的應激性、損傷易感性和凋亡標記物表達，促進細胞死亡［29］。此外，ABCA3基因突變導致肺上皮細胞的完整性和功能受到破壞，且表現出間質細胞的特點。

在FPF或散發的IPF患者基因突變和多態性分析，研究肺纖維化的遺傳易感性致病機制取得了重大進展。目前為止所有突變確定共同的問題是，突變所影響的基因(如SPA、SPC、MUC5B)是否在肺泡上皮細胞表達或是否導致肺泡上皮細胞可識別分子改變(TERT、TERC)。例如端粒在幾乎所有散發的IPF患者的肺泡上皮細胞均短。這些知識使IPF發病機制理解圍繞在上皮細胞的作用和功能，在肺纖維化的發展起著作用。

外部損傷是基因突變的易感個體發展為肺纖維化的必要因素。理論上這些突變可能直接導致肺纖維化，但實驗數據均不支持這種可能性。研究發現，環境因素如污染、粉塵或煙霧，可能在遺傳易感個體導致肺纖維化。IPF患者比健康者煙霧和粉塵接觸往往更為常見，非吸煙 IPF患者較吸煙患者存活長［30］。其他暴露因素還有胃食管反流(gastroesophageal reflux，GER)，尤其是微量吸入。有研究認為，GER與特發性肺纖維化有關［31］。但也有研究并不支持GER與IPF相關［32］。應用質子泵抑制劑或外科胃底折疊術治療GER與疾病發展減緩和更好的生存率有關［33］，說明了GER和微量吸入與疾病的發展和(或)遺傳易感個體的疾病加重有關。

特發性肺纖維化的基因突變是持久的，不可逆的變化。通過持續激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)或分泌TGF-β可能有助于疾病的進展。然而，表面活性物質的突變是唯一明確的分子途徑的基因突變，可以解釋它們在肺纖維化的作用。MUC5B、TERT、TERC突變患者導致肺纖維化的分子機制仍不清楚。IPF的進行性進展非遺傳性的因素必須考慮，IPF的成纖維細胞表型的持久的改變導致IPF進展。

4.表觀遺傳學

最近公認由表觀遺傳學影響的基因表達的調控是一個環境或其他應激可以引起持久的細胞，組織或生物體的表型變化的重要機制［34］。表觀遺傳改變包括DNA甲基化改變，組蛋白修飾或microRNA的表達［34-35］。暴露于環境壓力如煙草煙霧［36-37］、空氣污染［38］和年齡老化［39］可導致表觀遺傳DNA改變。對IPF肺的表觀遺傳學改變的研究，miRNA微陣列分析顯示，18個小分子RNA包括let-7d水平下降［40］。Let-7d microRNA的定位局限于肺泡上皮，且上皮細胞let-7d水平下降與間充質蛋白如N-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-SMA的表達增加有關。全基因組甲基化分析在IPF的肺確定了大量的差異甲基化基因［41-42］。許多基因的DNA甲基化變化與mRNA表達相對應，其中一些在IPF中起重要作用，如細胞凋亡和生物合成細胞過程的調控［43］。這些研究結果表明，甲基化和(或)其他表觀遺傳變化在IPF發病起很重要的作用和持久的影響基因表達可部分解釋病情的進展。

5.環境因素

除了遺傳因素外，環境因素也影響疾病的發展。目前研究認為，煙草煙霧、暴露于空氣污染物和病毒的作用均影響肺纖維化的發病。一些研究還表明，肺纖維化患者肺組織中存在各種病毒蛋白，且表達于肺泡上皮細胞。

6.年齡老化

年齡老化與間質性肺疾病發病有關。在兒童肺纖維化疾病的患病率比成人要低得多。一方面，兒童和成人接觸的環境不同；另一方面，隨年齡增長，機體對損傷的修復能力減低，與胚胎干細胞不同，成人干細胞并非不朽，隨著年齡的增長其端粒長度降低。這樣的內源性干細胞池的自然有限的置換能力，可能通過干細胞池耗盡，或通過遺傳，或獲得的突變改變了相應的干細胞功能的后果。在應對各種壓力包括DNA損傷、氧化劑和端粒侵蝕，由于衰老致細胞的有限壽命。在成人ILD患者的肺，所有這些損傷的形式得到證實。

【肺泡上皮細胞的關鍵作用】

基于臨床和實驗研究，肺泡上皮在ILD的發病中起關鍵性作用。損傷后AECs通過再上皮化過程進行正常肺泡結構的修復，或通過EMT過程參與纖維化。肺上皮細胞是間質性肺疾病肺損傷的原發部位。雖然有各種啟動因素，終端階段的特點是肺纖維化。

在EMT過程中，上皮細胞的極性和特有標記消失，細胞的緊密連接部溶解，肌動蛋白的細胞骨架重組，間質基因表達程序得以誘導，細胞在基膜及組織中遷移，而持續的細胞凋亡被證實是推動這個過程的關鍵。細胞凋亡的一般特征是細胞內表面磷脂酰絲氨酸的表達，相鄰細胞特異地識別磷脂酰絲氨酸需要許多抗炎分子的參與，如TGF-β。而基底膜長時間的破壞造成AECs與間質細胞的相互作用和相互干擾，改變了細胞功能，使得氧化劑、酶類、細胞因子和生長因子等產物失衡，造成TGF-β不斷引起上皮細胞凋亡同時又不斷促進自身產生的惡性循環。

上皮細胞凋亡是間質性肺疾病的初始事件。內質網應激也誘導細胞凋亡。上皮細胞凋亡之后重建，重建過程包括上皮細胞和成纖維細胞活化，細胞因子的產生，凝血途徑的激活，新生血管形成，再上皮化、纖維化。細胞凋亡在維持細胞存活與死亡之間的平衡中起重要作用。有2個細胞凋亡信號通路。一個是直接途徑從死亡受體連接半胱天冬酶(caspase)級聯反應激活和細胞死亡。通過刺激如藥物、輻射、感染病原啟動的其他途徑和活性氧在線粒體中的啟動。最近證明，內質網也是執行細胞凋亡的細胞器。各種應激會損害蛋白質折疊，引起內質網應激，嚴重的內質網應激可引起凋亡信號轉導［44］?；钚园腚滋於附閷У鞍踪|底物的裂解，導致細胞凋亡的形態學特征。細胞凋亡在肺疾病中可能起重要作用。實質細胞過度死亡意味著不可逆的組織損傷，可能導致肺纖維化。

肺泡上皮細胞損傷和細胞死亡誘導上皮基底膜形成了間隙。成纖維細胞通過這些間隙進入肺泡腔，導致肺泡內纖維化。間質纖維化及后續肺泡內纖維化可導致肺損傷后結構重構。在IPF已經證實了細胞凋亡的發生，［45-46］。以及死亡受體/配體的死亡信號，如活性氧族、氮族、促炎性細胞因子、趨化因子和其他凋亡的分子信號參與了間質性肺疾病的病理生理學。

肺泡上皮細胞不僅是肺損傷的原發部位，也通過一些機制參與炎癥反應。在IPF上皮細胞能分泌大量分子，如生長因子及其受體、蛋白酶、表面活性蛋白、黏附分子和基質成分，它們可能調節肺內的炎癥和纖維化反應。突出的肺泡上皮細胞損傷是IPF的特征。廣泛嚴重損傷的急性炎癥區域Ⅰ型肺泡上皮細胞顯著降低，肺泡Ⅱ型細胞是修復細胞，上皮細胞損傷后快速增殖。在大多數嚴重損傷的區域，基底膜由增殖的立方形Ⅱ型細胞所覆蓋，Ⅰ型和Ⅱ型細胞的死亡由大量成纖維細胞、平滑肌細胞所取代。

博萊霉素可迅速產生大量肺的DNA損傷。該模型電子顯微鏡的研究結果顯示，在細支氣管和肺泡上皮有細胞凋亡的特征。因此，DNA損傷和上皮細胞凋亡可能與肺纖維化有關。隨后在IPF患者用原位DNA缺口末端標記法和電子顯微鏡也證實，肺泡上皮細胞有DNA損傷或上皮細胞的凋亡。DNA損傷和細胞凋亡在急性肺損傷和彌漫性肺泡損傷的肺上皮細胞有報道［47］。

一些細胞死亡需要Fas/FasL途徑，即半胱天冬酶激活。研究證實，廣譜半胱天冬酶抑制劑，在體內抑制細胞內的半胱天冬酶樣蛋白酶活化，并保護小鼠免受LPS誘導的急性肺損傷。它也減輕博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化，說明上皮細胞凋亡可能在肺損傷和纖維化的發病機制中起重要作用。

Fas/FasL途徑是細胞凋亡信號受體分子代表系統。在體外實驗中，ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液能夠誘導人的遠端肺上皮細胞的凋亡并表達Fas，Fas/FasL通路被證實是引起肺泡上皮Ⅱ型細胞凋亡的重要途徑［48-49］。在IPF患者肺組織中的滲出炎性細胞的FasL mRNA和蛋白的表達上調。在小鼠博萊霉素誘導肺纖維化和人類的IPF的平滑肌肌動蛋白陽性細胞有FasL分子表達，體外也證實FasL陽性的肌成纖維細胞，誘導小鼠肺的上皮細胞凋亡［50］。抑制這一途徑可能是一種新的肺損傷和纖維化的治療策略。由于氧化還原調控與細胞凋亡關系密切，氧化損傷的細胞保護策略也是抗肺損傷和纖維化的有前景的策略。如硫氧還蛋白-1是一種重要的自由基清除劑。硫氧還蛋白-1轉基因小鼠可降低高氧暴露后肺泡損傷。

【上皮細胞和成纖維細胞的相互作用】

嚴重的肺上皮細胞的損傷和不完全的修復，成纖維細胞可增殖，可損害正常的上皮細胞和成纖維細胞的相互作用，從而導致肺纖維化。上皮細胞也可能通過釋放細胞因子控制成纖維細胞，抑制成纖維細胞的活性。通過Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖和分化完成上皮層的正常修復。這個過程受肺成纖維細胞所產生的因子所影響。如炎癥刺激持續存在可導致修復異常，引起肺纖維化。

從纖維化肺分離的異常表型成纖維細胞在體外可產生能夠誘導肺泡上皮細胞凋亡和壞死的因子［51］。這些異常的上皮間質細胞的相互作用，通過阻止正常上皮的修復和促成纖維細胞異常增殖的進展，可引起肺纖維化疾病發病和加重。

1.上皮細胞向間充質細胞轉化

上皮細胞向間充質細胞轉化是一個上皮細胞獲得與間充質細胞有關的分子和細胞生理特征的過程。通常緊隨特異性生長因素如TGF-β之后［52-53］。正常組織的平衡不需要EMT；相反，在組織損傷和重塑時EMT程序激活［54-55］。有免疫組化研究表明，在IPF患者的肺泡細胞具有EMT的證據［52，56］。

雖然有證據表明，在IPF患者肺上皮細胞獲得間充質特征，這些在間質的纖維化過程中變化的作用仍然不清楚。在人類中，唯一支持的證據是從IPF患者分離的成纖維細胞表達上皮細胞蛋白角蛋白18［57］。

在IPF患者UPR、TGF-β和EMT激活與肺纖維化有關。表面活性物質的突變導致UPR的激活，這激活是否足以導致肺纖維化的發展仍然未證實。SPA的基因突變導致上皮細胞的UPR激活，G231V SPA的雜合突變患者支氣管肺泡灌洗液中具有較正常者更高的TGF-β水平［58］。不同表達的G231V或F198S SPA突變的上皮細胞也表達高水平的TGF-β，這些觀察揭示了UPR激活和TGF-β產生的關系，UPR的激活可能通過增強分泌TGF-β促進肺纖維化的發展。

2.內質網應激

內質網是分泌細胞室，可通過高爾基復合體參與膜蛋白的制造、折疊和成熟的包裝和運輸。在缺氧、氧化應激等刺激時，未折疊蛋白產生增多，當超過內質網處理能力時，引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。內質網應激發生時，產生了大量的錯誤折疊和未折疊的蛋白，細胞的蛋白質需求和內質網的合成、加工和包裝必需蛋白的能力之間不平衡［59］。應對這個應激，細胞增加折疊蛋白的產生和加速未折疊蛋白的降解稱為UPR，導致生化通路激活以匹配內質網生產蛋白質的能力。這樣，可以維持內質網的穩態，阻止細胞凋亡。如果UPR無法達到需求，激活終端UPR和細胞通過細胞凋亡的途徑死亡［59-60］。哺乳動物細胞中含有3個未重疊蛋白的傳感器-需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)，蛋白激酶RNA樣內質網激酶(protein kinase RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和激活的轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。當內質網應激，IRE1α感受與應激相關的未折疊的蛋白，經歷反式自身磷酸化。這種磷酸化發信號使凋亡通路的激活［61］。IRE1α是細胞凋亡啟動的關鍵介質。此外，IRE1α具有核糖核酸酶，激活時，拼接XBP1(x-boxbinding protein 1)的 mRNA并產生的轉錄因子XBP1S，其目標提高ER蛋白折疊的能力。因此，內質網應激和UPR的兩標記物是IRE1α的磷酸化和XBP1拼接。

研究證實，在IPF肺泡Ⅱ型細胞UPR激活的標記物增加［62-64］，證實從IPF分離的Ⅱ型細胞活性的磷酸化的IRE1α、XBP1S的水平增加。

在IPF中內質網應激的許多可能的原因已確定，如皰疹類病毒感染、基因突變［64-65］。因此，如果UPR激活是一個促進發展IPF的中心途徑，那么觸發UPR激活的其他因子與肺纖維化有關。

3.轉化生長因子β

IPF患者肺的活性TGF-β水平增加。TGF-β的激活的纖維化過程包括抑制AEC增殖，成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化［66］，促進上皮細胞向間充質轉變的程序的活化［52］。

TGF-β是細胞外基質生產的最有力的推動者，也是一個強有力的單核細胞和巨噬細胞的趨化因子。上皮細胞TGF-β增加和IPF患者肺組織和嚙齒類動物博萊霉素誘導的肺纖維化的巨噬細胞的增加一致。在博萊霉素誘導的肺纖維化的肺膠原沉積的增加可通過抗TGF-β抗體治療減少或重組TGFRⅡ治療減少［67］。核心蛋白聚糖，一種自然產生拮抗TGF-β1的生物活性的生物分子，可以減輕損傷肺的TGF-β過度信號。

TGF-β1在各種細胞可直接誘導細胞凋亡。TGF-β1介導凋亡的機制在不同細胞類型變化。TGF-β1是通過激活caspase-3和下調p21表達誘導細胞凋亡，也是Fas介導的肺上皮細胞凋亡的增強因子，在治療肺損傷和纖維化時TGF-β1在肺上皮細胞凋亡的這種功能應考慮。TGF-β1在肺上皮細胞過度表達可誘導小鼠的肺纖維化，TGF-β1誘導上皮細胞凋亡是肺纖維化早期的關鍵。

內皮素-1(endothelin-1，ET-1)也被認為是肺纖維化發生發展過程中的一個重要因素。ET-1是一個21個氨基酸的肽，已證明具有包括成纖維細胞、平滑肌細胞的有絲分裂原、刺激膠原合成的許多功能。特發性肺纖維化患者血漿ET-1水平均提高。此外，轉基因小鼠過度表達ET-1表達引起肺和腎間質纖維化。最近的研究表明，AEC產生ET-1在生理上相關的水平可通過刺激內源性TGF-β的產生引起肺泡EMT。這些數據支持了ET-1聯合TGF-β在EMT和肺纖維化起作用［68］。

上皮細胞在TGF-β1介導下向間充質細胞轉化。在結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)作用下，可激活成纖維細胞，促進纖維化的發生［69］。

4.血管緊張素Ⅱ

研究發現，血管緊張素Ⅱ1類受體(angiotensin I，AT1)過度表達可促進局部肺纖維化的發生，參與氣道重構，血管緊張素可能在肺纖維化中發揮重要作用。血管緊張素Ⅱ和血管緊張素原體外誘導肺泡上皮細胞凋亡。血管緊張素Ⅱ體外通過血管緊張素Ⅱ的1類受體激活和TGF-β的自分泌作用誘導人肺成纖維細胞增生。ACE抑制劑抑制在體外Fas和TNF-α誘導的人肺上皮細胞凋亡，ACE抑制劑卡托普利減輕野百合堿或胺碘酮誘發的大鼠肺的纖維化［70］，并減輕呼吸機所致大鼠肺肺損傷［71］。AT1拮抗劑減輕博萊霉素誘導的肺纖維化和支氣管肺泡灌洗液中的淋巴細胞、中性粒細胞、TNF-α和TGF-β1減少［72］。

總之，基因突變或變異是個體的易患疾病的基礎，而環境暴露是必要的因素。脆弱的肺泡上皮細胞在反復的損傷因素作用下，引起異常的修復和進行性纖維化［73-74］，見圖2-1。上皮細胞功能障礙是間質性肺疾病的發病其關鍵作用。上皮細胞功能障礙分子介質如內質網應激，過度TGF-β活化，生長因子、趨化因子、EMT、纖維細胞招募和成纖維細胞分化。這些分子介質與間質性疾病的纖維化有關。

（劉秀云　江載芳）

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