常規采用L-J培養法對一線抗TB藥物進行DST。據2014年我國文獻報道，各地的TB耐藥情況仍很嚴峻。蔣駿等 ^［11］對蘇州市2012年1月至2013年5月371例痰培養陽性的肺結核患者進行菌種鑒定及比例法DST并進行結果分析。371例痰培養陽性患者中，TB患者為316 例，占85.2%；非結核分枝桿菌（NTM）患者55例，占14.8%。耐多藥患者為79例，總耐多藥率為21.3%；其中Mtb 32例（10.1%，32/316），NTM 47 例（85.5%，47/55）；TB患者與NTM患者耐多藥率差異有統計學意義（ P<0.001）。劉菊秀等 ^［12］對吉林市肺結核患者痰標本分離培養出的493株結核分枝桿菌進行了10 種抗結核藥物的絕對濃度法DST，結果493株結核分枝桿菌中，197例對10 種抗結核藥全部敏感，296 例有不同程度耐藥，總耐藥率為60%，有121株為耐多藥結核分枝桿菌，耐多藥率為24.5%。

楊娟等 ^［13］采用WHO推薦的比例法對分離自西藏拉薩地區肺結核患者的198 株Mtb進行4種抗結核藥物利福平（rifampicin，RFP）、異煙肼（isoniazid，INH）、鏈霉素（streptomycin，Sm）、左氧氟沙星（leovfloxacin，Lfx）的DST。結果顯示198 株Mtb中耐藥菌株有125 株，總耐藥率為63.1%（125/198），總耐多藥率為29.8%（59/198），初治耐藥率為55.1%（64/116），復治耐藥率為75.4%（40/53），初治耐多藥率為20.7%（24/116），復治耐多藥率為56.7%（30/53）。對RFP、INH、Sm、Lfx的耐藥率分別為36.3%（72/198）、41.9%（83/198）、41.4%（82/198）和7.0%（14/198）。中國Gao等 ^［14］在北京收集的41 株對結核合并感染AIDS 的患者的臨床菌株做了四種一線抗TB 藥物的DST，結果發現總耐藥率58.4%，原發性耐藥占46.7%，獲得性耐藥占90.9%，明顯高于普通TB 患者。上述研究者均認為TB患者以及TB合并HIV感染患者耐藥情況應引起足夠的重視。

熊瑜等 ^［15］利用PhaB法檢測初治肺結核合并糖尿病患者對一線抗結核藥物INH，Sm，RFP 和EMB的耐藥性，并對結果進行比較，研究結果顯示該院痰培養陽性的初治住院肺結核患者對INH，RFP，EMB，Sm 4種一線抗結核藥物總耐藥率為27.47%，單耐藥率為14.84%，研究者認為初治肺結核合并糖尿病患者耐藥率高于單純初治肺結核患者耐藥率，但差異沒有統計學意義，有待于擴大樣本進行深入研究。

對222份涂片陽性的痰標本改良羅氏培養上直接硝酸還原酶測定（direct nitrate reductase assay，D-NRA）對INH、RFP、卡那霉素（Km）和氧氟沙星（Ofx），進行Mtb鑒定和DST檢測，結果與全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統BACTEC MGIT960（MGIT 960）為金標準進行比較。研究結果顯示D-NRA約16.9天得到結果，而間接MGIT 960需29 天。研究者認為D-NRA是一種低成本的技術，易于臨床實驗室開展，適合用于DST分枝桿菌的所有涂片陽性樣本。Coban等 ^［17］對NRA法檢測四種一線抗TB藥物DST相關文獻進行了搜索，并對查到的文獻進行薈萃分析。共納入35篇INH相關文獻，38 篇RFP相關文獻，22 篇EMB和Sm 相關文獻。研究結果顯示四種藥物的DST 敏感性分別為96%、97%、90%、82%；特異性分別為 99%、100%、98%、96%。直接法和間接NRA 檢測所需時間分別為5～28天、5～14天。研究者認為該方法值得進一步推廣應用。

日本Nishiyama等 ^［18］綜述了在Mtb 標準菌株以及臨床株上進行的一線抗TB藥物DST的MODS法的藥物濃度優化。研究顯示39種標準菌株得到DST的Cut off值：INH 0.8μg/ml（敏感度為 96.0%，特異度為92.9%），RFP 2.0μg/ml（敏感度100%，特異性 95.5%），Sm 4.0μg/ml（敏感度為90.5%，特異性為 93.8%），EMB 4.0μg/ml（敏感度100%，特異性為91.7%）。即使是涂片陰性的菌株也可以快速得到DST結果。英國Coronel等 ^［19］ 用MODS對接受治療的TB患者進行RFP、INH的DST的檢測，264 份TB患者痰標本同步進行L-J培養和MODS檢測。菌株在國家參比實驗室進行RFP，INH 的比例法DST。研究顯示該方法對MDR-TB檢出率為95.8%。與比例法相比較，MODS的INH、RFP藥敏結果一致性分別為96.8%和92.6%。研究者認為，對于此類患者改良MODS 法在培養1周后判讀RFP，INH藥敏結果與參照方法的結果趨于一致，可以更好地為臨床服務。

Wikman等 ^［20］綜述了MODS 在HIV 感染患者中診斷TB的準確率。該研究在8種常用數據庫中以培養為診斷測試金標準，MODS對HIV感染者進行TB診斷等相關內容全面搜索，并運用了薈萃分析對結果進行處理。3259 篇引文中，選定29 篇進行全文瀏覽，其中10 項研究包括3075 份樣品最終用于分析。研究顯示MODS對結核病的診斷總體診斷敏感性為88.3%（95%CI 為86.18%～90.2%）和特異性為98.2%（95%CI為97.75%～98.55%）。對MDR-TB的檢測靈敏度為89%（95%CI為66.07%～97%），特異性為100%（95%CI 94.81%～100%）。對于涂陰肺結核其檢測敏感度為88.2%（95%CI 86.1%～89.9%）和特異性為98.2%（95%CI 為96.8%～98.9%）。每份標本成本在0.72 美元和7.31 美元之間。平均培養陽性檢測時間是8.24 天。研究者認為 MODS 法價廉、快速，對HIV病毒感染者的結核病和耐多藥結核病的診斷準確。有研究者以金標準如MGIT 960 以及SD Bioline MPT64 抗原檢測為參照，評價自動MODS 檢測系統對TB診斷。研究共收集清萊17 家醫院360 份標本，結果顯示，221 例MGIT 960 培養陽性，而自動MODS 檢測結果221 例陽性標本中有9 例假陰性，139 例MGIT 960 培養陰性標本中有4 例自動MODS 檢測為假陽性，靈敏度為95.9%，特異性為97.1%。自動MODS培養陽性的中位數時間為10 天 ^［21］。Martin等 ^［22］對一種商品化MODS試劑盒進行了評價。該研究同時對2446 份痰標本做了L-J 培養，普通MODS 以及MODS 商品化試劑盒檢測。與傳統MODS 法比較，該試劑盒的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為99.3%（98.3%～99.8%）、98.3%（97.5%～98.8%）、95.8%（94.0%～97.1%）、99.7%（99.3%～99.9%）。MODS 商品化試劑盒培養陽性報告時間可從10 天縮短到8.5天。MODS 試劑盒對RFP，INH 的藥敏結果與傳統MODS以及間接培養法的一致性均為97.9%。研究者認為MODS 試劑盒與傳統PCR相比表現更為突出，方便、便宜且安全，未來臨床一、二線抗TB 藥物DST檢測必將對其有巨大的需求。

Jang等 ^［23］開發了一種兼具固體和液體培養基快速、低成本和高效率等諸多優點的水凝膠Mtb 培養法。研究者將卡介苗（BCG）的懸浮液和200 例抗酸桿菌（AFB）陽性臨床標本接種在M7H9 液體培養基，并將其與75μl的9-芴甲氧羰基-苯氨酸水凝膠原液混合后培養，37℃監測培養狀態至14 天。研究發現BCG的數量隨時間增加，14 天內 200 例 AFB涂片陽性標本中158 例中155 例常規培養陽性，3例培養陰性或污染。液體培養法陽性的128 例樣本，使用水凝膠培養陽性時間（平均12.6天，區間：7～14天）比常規的液體培養（平均16.2天，區間：6～31天）顯著縮短（ P<0.0001）。研究者認為，水凝膠支架培養有助于加速臨床Mtb的診斷。

我國臺灣Yu等 ^［24］ 通過對已被Mtb 抗原檢測試劑 MeDiPro或Amplicor 鑒定為Mtb的432份MGIT 960 培養陽性標本進行檢測，評估了改良的直接瓊脂比例法（MDAPM）作為一種快速檢測技術取代了傳統的間接瓊脂比例法進行DST。結果發現兩種方法對一線抗TB藥物RFP、INH、EMB、Sm的DST 結果的一致性分別為99.31%、98.38%、98.38%和97.22%。前者比后者可提前2周出報告。因此，作者認為，MDAPM 被認為有助于已經配備MGIT 960 的實驗室開展TB診斷。

Patil等 ^［25］用刃天青試管（RTM）培養法檢測100株臨床菌株抗結核藥的DST，8 天后得到MIC的結果，并將結果與金標準比較。研究者證實該方法對RFP，INH檢測敏感度均為100%，特異度分別為98.7%、95.3%，認為RTM是可以同步進行DST以及MDR-TB快速診斷可信賴的檢測方法，其最主要優點是沒有生物安全危害。

Trollip等 ^［26］于2011年2月至2012年8月在四個國家和地區進行MODS法二線抗TB藥物的藥敏濃度的界定的多中心研究。最終確定藥物濃度分別為莫西沙星（oxifloxacin，Mfx）0.5μg/ml，氧氟沙星（ofloxacin，Ofx）1μg/ml，阿米卡星（amikacin，Am）2μg/ml，卡那霉素（kanamycin，Km）5μg/ml，卷曲霉素（capreomycin，Cm）2.5μg/ml。研究者認為直接二線抗結核藥物 DST時各種藥物濃度的最終確定仍需做更多的實驗數據支持。申曉娜等［27］綜述了L-J比例培養法對194 株Mtb 菌株進行對氨基水楊酸異煙肼（pasiniazid isoniazide para-aminosalicylate，Pa）及INH 耐藥性檢測，并采用微孔板靛青藍（Alarma blue）細胞增殖與細胞毒檢測法檢測其MIC，比較兩種藥物的體外抗Mtb 活性，以探索Pa對耐藥結核病的臨床使用價值。

在0.2μg/ml藥物濃度下，INH 耐藥菌株對Pa耐藥菌株的耐藥率為50.4%（69/137），敏感率為49.6%（68/137）；INH 敏感菌株對Pa耐藥菌株的耐藥率為1.8%（1/57），敏感率為98.2%（56/57）；耐多藥菌株對Pa 耐藥菌株的耐藥率為46.2%（24/52），敏感率為53.8%（28/52）。

經Alarma bule 法測得Mtb 標準菌株H37Rv的異煙肼MIC 為0.063μg/ml，Pa 的MIC 為0.031μg/ml結果提示，在相同藥物濃度下，異煙肼達到臨床耐藥水平后，仍有近半數菌株表現為Pa 敏感，雖然在異煙肼敏感的情況下，兩者的MIC 分布差別不大，但對于耐INH和MDR-TB，Pa 的MIC分布明顯趨向于較低濃度，體外殺菌效力強于INH。研究者認為在耐異煙肼或耐多藥結核病的治療方案中用Pa代替INH可能有一定的效果。

美國Banu等 ^［9］ 對87株Mtb臨床分離株用六種檢測方法進行了耐藥性檢測，并對其結果的一致性進行了評估。六種方法包括：L-J比例法、MGIT960、利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert Mtb/RIF）、線性探針檢測技術MTBDR plus、MycoTB MIC檢測和實驗室自制的Mtb 噬菌體定量PCR。80%的分離株為多耐藥菌株。結果顯示分枝桿菌定量PCR方法報告時間最短，L-J比例法最耗時，而MGIT方法常需重復測試（ P<0.05）。所有方法對異煙肼（INH）檢測結果敏感或耐藥的檢測一致的菌株占82%，而對于RFP、EMB和Sm等檢測結果完全一致分別為77%、50%和51%。EMB和Sm藥敏結果一致性減弱的原因主要在于MGIT的EMB結果（Kappa系數區間0.26～0.30）和L-J 培養的Sm結果（Kappa系數區間0.35～0.45）與其他方法有很大程度差異。Mtb噬菌體PCR和MycoTB MIC板是唯一可檢測除環絲氨酸外的所有二線抗TB藥物敏感性并揭示所有藥物顯著地定量關系的檢測方法，以及除對氨基水楊酸外對所有藥物檢測結果均有中度至良好的Kappa系數。綜上所述，實驗室更應考慮上述因素來選擇適合的藥敏檢測方法，尤其對臨床急需的EMB和Sm檢測更要仔細。

谷蘊婷等 ^［10］探討和分析了使用絕對濃度法DST時不同報告時間結果不一致的原因。研究共收集采用絕對濃度法于37℃含INH的L-J培養基上培養4周時無菌落生長、時間延長至6周后才生長的13株菌株（含藥培養基延遲生長菌株）。這些菌株來源于11例結核病患者（2例患者的菌株在低濃度和高濃度INH時均有菌落生長）；同時收集這11例結核病患者的臨床敏感株作為對照菌株，共計24株菌株，進行比例法藥敏試驗和PCR菌種鑒定，并利用Mtb散在分布重復單位（mycobacterium interspersed repetitive unit，MIRU）和結核分枝桿菌間隔區寡核苷酸分型（spoligotyping）技術進行基因分型，并選擇對照菌株和含藥培養基延遲生長菌株MIRU分型不同的3株菌株進行人工模擬不同濃度INH時混合的敏感菌株和耐藥菌株進行絕對濃度法藥敏試驗，觀察不同報告時間（4周和6周）的藥敏試驗結果。結果發現24株菌株經PCR鑒定均為結核分枝桿菌復合群。比例法藥敏試驗中13株含藥培養基延遲生長菌株均對INH耐藥，11株對照菌株均對INH敏感。3例患者的對照菌株和含藥培養基延遲生長菌株分型屬于不同型別，分別為北京基因型和T2型、北京基因型和H3型、北京基因型和T2型。人工混合感染的3株菌株比例（臨床株：H37Rv）小于1︰128時可能會出現4周無菌落生長而6周有菌落生長的結果。研究者認為對藥物敏感性不同的Mtb造成的混合感染，如耐藥菌株的比例較低時，可能造成不同報告時間藥敏試驗結果不一致的情況。

綜上所述，本年度結核病細菌學研究并未有突破性進展。而擁有可以同步進行診斷和藥物敏感性試驗、價格低廉等諸多優點的MODS法，在WHO的推薦下，在多方學者努力下，進一步向自動化、商業化邁進，這將對其世界范圍的推廣應用奠定了良好的基礎。隨著耐藥結核病的高發，對于二線抗結核藥物敏感性試驗的需求將會使其繼續成為結核病細菌學研究焦點之一。

1.Chandra TJ，Raj RS，Sharma YV.Same day sputum smear microscopy approach with modified ZN staining for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in a microscopy centre at Rajahmundry.Indian J Med Microbiol，2014，32（2）：153-156.

2.Nayak P，Kumar AM，Claassens M，et al.Comparing same day sputum microscopy with conventional sputum microscopy for the diagnosis of tuberculosis--Chhattisgarh，India.PLoS One，2013，8（9）：e74964.

3.Huang Z，Xiong G，Luo Q，et al.Evaluation of the performance of the microscopic observation drug susceptibility assay for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis in China：A preliminary study.Respirology，2014，19（1）：132-137.

4.張繼萍，柳曉金，葉迎賓，等.支氣管鏡肺泡灌洗液改良抗酸染色法診斷菌陰性肺結核的價值探討.國際檢驗醫學雜志，2014，35（13）：1702-1703.

5.Ryan GJ，Shapiro HM，Lenaerts AJ.Improving acid-fast fluorescent staining for the detection of mycobacteria using a new nucleic acid staining approach.Tuberculosis（Edinb），2014，94（5）：511-518.

6.Mccall B，Olsen RJ，Nelles NJ，et al.Evaluation of a miniature microscope objective designed for fluorescence array microscopy detection of Mycobacterium tuberculosis.Arch Pathol Lab Med，2014，138（3）：379-389.

7.李輝.液體培養方法在結核病和耐藥結核病診斷中的應用.中華檢驗醫學雜志，2014（8）：637-638.

8.Phunpae P，Chanwong S，Tayapiwatana C，et al.Rapid diagnosis of tuberculosis by identification of Antigen 85 in mycobacterial culture system.Diagn Microbiol Infect Dis，2014，78（3）：242-248.

9.Banu S，Rahman S M，Khan M S，et al.Discordance across several methods for drug susceptibility testing of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in a single laboratory.J Clin Microbiol，2014，52（1）：156-163.

10.谷蘊婷，于霞，李云絮，等.不同報告時間結核分枝桿菌藥物敏感性試驗結果不一致的原因.中國防癆雜志，2014，36（10）：874-879.

11.蔣駿，張曉龍.蘇州市痰培養陽性肺結核患者的菌型鑒定及藥物敏感性試驗結果分析.結核病與肺部健康雜志，2014，3（2）：91-95.

12.劉菊秀，劉丹丹.493例結核分枝桿菌耐藥情況分析.結核病與肺部健康雜志，2014，3（2）：133-134.

13.楊娟，央拉，巴桑瓊達，等.西藏拉薩地區198株結核分枝桿菌耐藥性分析.西藏大學學報：自然科學版，2014，29（1）：36-39.

14.Gao GJ，Lian L，Sun Y，et al.Drug resistance characteristics of Mycobacterium tuberculosis isolates to four first-line antituberculous drugs from tuberculosis patients with AIDS in Beijing，China.Int J Antimicrob Agents，2015，45（2）：124-129.

15.熊瑜，高緒勝，丁彩紅.初治肺結核合并糖尿病患者噬菌體檢測法一線抗結核藥物耐藥分析.中國防癆雜志，2014，36（3）：211-213.

16.mperiale BR，Morcillo NS，Palomino JC，et al.Predictive value of direct nitrate reductase assay and its clinical performance in the detection of multiand extensively drug-resistant tuberculosis.J Med Microbiol，2014，63（Pt 4）：522-527.

17.Coban AY，Deveci A，Sunter AT，et al.Nitrate reductase assay for rapid detection of isoniazid，rifampin，ethambutol，and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis：a systematic review and meta-analysis J Clin Microbiol，2014，52（1）：15-19.

18.Nishiyama H，Aono A，Sugamoto T，et al.Optimization of the microscopic observation drug susceptibility assay for four first-line drugs using Mycobacterium tuberculosis reference strains and clinical isolates.J Microbiol Methods，2014，101：44-48.

19.Coronel J，Roper MH，Herrera C，et al.Validation of microscopic observation drug susceptibility testing for rapid，direct rifampicin and isoniazid drug susceptibility testing in patients receiving tuberculosis treatment.Clin Microbiol Infect，2014，20（6）：536-541.

20.Wikman-Jorgensen P，Llenas-Garcia J，Hobbins M，et al.Microscopic observation drug susceptibility assay for the diagnosis of TB and MDR-TB in HIV-infected patients：a systematic review and meta-analysis.Eur Respir J，2014，44（4）：973-984.

21.Wang L，Mohammad SH，Chaiyasirinroje B，et al.Evaluating the Auto-MODS Assay，a Novel Tool for Tuberculosis Diagnosis for Use in Resource-Limited Settings.J Clin Microbiol，2015，53（1）：172-178.

22.Martin L，Coronel J，Faulx D，et al.A field evaluation of the Hardy TB MODS Kit for the rapid phenotypic diagnosis of tuberculosis and multi-drug resistant tuberculosis.PLoS One，2014，9（9）：e107258.

23.Jang MH，Kim SY，Kim CK，et al.Early detection of mycobacteria using a novel hydrogel culture method.Ann Lab Med，2014，34（1）：26-30.

24.Yu FL，Lee JC，Wang MS，et al.Evaluation of a modified direct agar proportion method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis from MGIT samples.J Microbiol Immunol Infect，2014.March 21.［Epub ahead of print］

25.Patil SS，Mohite ST，Kulkarni SA，et al.Resazurin tube method：rapid，simple，and inexpensive method for detection of drug resistance in the clinical isolates of mycobacterium tuberculosis.J Glob Infect Dis，2014，6（4）：151-156.

26.Trollip AP，Moore D，Coronel J，et al.Second-line drug susceptibility breakpoints for Mycobacterium tuberculosis using the MODS assay.Int J Tuberc Lung Dis，2014，18（2）：227-232.

27.申曉娜，趙雁林，肖和平，等.對氨基水楊酸異煙肼及異煙肼體外抗結核分枝桿菌活性分析.中華結核和呼吸雜志，2014，37（2）：132-134.