第六節(jié)　基于應(yīng)激理論的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>

一、慢性束縛應(yīng)激模型

在眾多動(dòng)物模型中，束縛應(yīng)激作為一種與人類(lèi)心身性疾病的過(guò)程有相似性，同時(shí)與應(yīng)激由急性轉(zhuǎn)入慢性的發(fā)展趨勢(shì)相似的非損傷性刺激，日益引起人們的關(guān)注，已成為應(yīng)激研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。束縛使大鼠失去行動(dòng)自由，造成身體的不適，很容易使動(dòng)物產(chǎn)生厭惡情緒，由此而使杏仁核強(qiáng)烈激活，同時(shí)各種刺激信息大量涌入海馬，從而出現(xiàn)海馬的興奮性氨基酸毒性損害。此類(lèi)模型的共同特點(diǎn)是將動(dòng)物置于無(wú)法避免的應(yīng)激環(huán)境中，直接給予一種或多種刺激，誘發(fā)其心理應(yīng)激反應(yīng)。

1.建模方法

對(duì)身體進(jìn)行束縛是最普遍應(yīng)用的神經(jīng)刺激類(lèi)應(yīng)激原。最簡(jiǎn)單可行固定的做法是用固定在木板上的軟帶子將四肢捆綁，常將頭部也固定以防自傷及動(dòng)物咬掉軟帶鐐銬。束縛7天或21天，每天3小時(shí)，這種做法剝奪了動(dòng)物的活動(dòng)自由，是純粹的挫折性應(yīng)激。還有將動(dòng)物放入空心圓筒中進(jìn)行束縛的方法。圓筒周?chē)谱髯銐蚨嗟耐笟饪祝趫A筒的蓋子中間打一孔以便讓動(dòng)物的尾巴露出。動(dòng)物在桶內(nèi)無(wú)法移動(dòng)、翻身等。

后來(lái)人們依據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)需要，對(duì)束縛進(jìn)行了各種改進(jìn)。如束縛加懸吊。選擇20只雄性大鼠，2~2.5月齡，正常飲食，晝夜飼養(yǎng)48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)前12~24小時(shí)禁食但不限水，隨機(jī)分為正常組和應(yīng)激組，每組10只。將應(yīng)激組大鼠四肢用繃帶分別固定在鼠板上，頭朝下尾朝上懸掛，持續(xù)6小時(shí)后將正常組和應(yīng)激組隔離放置6小時(shí)。

或?qū)?yīng)激動(dòng)物固定在不銹鋼圓筒上。頭部置筒內(nèi)底部封閉的一側(cè)，身體束縛固定于不銹鋼圓筒的壁上，使動(dòng)物處于束縛、禁飲食、避光狀態(tài)并倒懸，四肢可動(dòng)但不能逃脫。選擇清潔級(jí)3月齡雌鼠，質(zhì)量150~200g。動(dòng)物房溫度維持在22℃，相對(duì)濕度為50%。大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼料喂養(yǎng)1周后，將應(yīng)激大鼠固定在不銹鋼圓筒上。頭部置筒內(nèi)底部封閉的一側(cè)。身體束縛固定于不銹鋼圓筒的壁上，使大鼠處于束縛、禁飲食、避光并倒懸于1m高的支架上每天持續(xù)6小時(shí)。四肢可動(dòng)但不能逃脫，分別連續(xù)應(yīng)激處理3天和21天。非應(yīng)激時(shí)與對(duì)照組一起正常飼養(yǎng)，如圖8-13。

圖8-13　慢性束縛應(yīng)急模型

應(yīng)激動(dòng)物固定在不銹鋼圓筒上，頭部置筒內(nèi)底部封閉的一側(cè)，使動(dòng)物處于束縛、禁飲食、避光狀態(tài)并倒懸，四肢可動(dòng)但不能逃脫

還有將束縛和浸水結(jié)合的方法。束縛-浸水應(yīng)激模型的制備，先將大鼠置于安靜的動(dòng)物房?jī)?nèi)籠養(yǎng)，室溫22℃，自然光照，自由進(jìn)食、飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng).適應(yīng)l周后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)激前禁食24小時(shí)，自由飲水.乙醚輕度麻醉后，應(yīng)激組大鼠被束縛四肢于木板或鐵絲網(wǎng)上，限制動(dòng)物的自由活動(dòng)，即單純束縛應(yīng)激。待其清醒后，分別“立位”浸于21℃冷水中，水位與胸骨劍突齊平。所有的應(yīng)激在上午8：00~12：00完成，以減少應(yīng)激反應(yīng)的晝夜節(jié)律變化。因此，束縛-浸水應(yīng)激實(shí)際是一種強(qiáng)度較大的復(fù)合應(yīng)激。固定加復(fù)合強(qiáng)刺激方法屬于持續(xù)惡性心理應(yīng)激，能有效建立持久、反復(fù)應(yīng)激所致恐懼性、無(wú)助的心理合并智力障礙的動(dòng)物模型。

束縛應(yīng)激的實(shí)施時(shí)間每天持續(xù)2~12小時(shí)不等，總實(shí)施天數(shù)有3~21天，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要具體決定。

2.觀測(cè)指標(biāo)

結(jié)果顯示正常組無(wú)變化，應(yīng)激組模型大鼠均出現(xiàn)胃潰瘍，同時(shí)血清中NE、DA、間腦NE含量明顯升高，血清、間腦、小腦、5-HT含量明顯降低。束縛大鼠模型在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，其水平移動(dòng)和垂直移動(dòng)得分均低于對(duì)照組，表現(xiàn)出抑郁、反應(yīng)遲緩等創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙樣癥狀。

3.模型分析

束縛應(yīng)激模型是推進(jìn)應(yīng)激機(jī)制研究的有力工具，應(yīng)具備與人類(lèi)疾病的相似性、可重復(fù)性及程度的可量化，作為非損傷性刺激更接近于人的心理應(yīng)激，可重復(fù)性也比較好。但是由于方法各異，造模工具不統(tǒng)一，所以很難在不同方法之間建立溝通的橋梁，量化確定不同造模方法的應(yīng)激強(qiáng)度，難以把握模型的具體程度和分期。尤其是在篩選模型時(shí)，各家選用的指標(biāo)不同，客觀上造成對(duì)模型評(píng)價(jià)的不統(tǒng)一。這些都妨礙了不同慢性束縛應(yīng)激模型的綜合評(píng)價(jià)，以及不同模型之間的比較與交流。需要提出能夠統(tǒng)一不同模型的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)激量單位，確定基于不同檢測(cè)指標(biāo)特色的模型綜合評(píng)價(jià)體系。束縛制動(dòng)可以制造較為純粹的挫折應(yīng)激，屬于慢性激怒應(yīng)激反應(yīng)。此類(lèi)模型的軀體應(yīng)激因素較小，能夠較好的突出心理或情緒因素。有資料表明慢性束縛應(yīng)激大鼠血漿和下丘腦DA、5-HT含量明顯降低，血漿NE、E含量明顯升高。

二、電擊模型

電擊模型是目前創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙研究中使用最為廣泛的動(dòng)物模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的不同，不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的電擊強(qiáng)度和電擊時(shí)間。

1.建模方法

（1）Rau等制備小鼠創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型時(shí)，首先將8周齡小鼠置于25℃環(huán)境中，每5只小鼠放在一個(gè)籠子里面，晝夜隨意飲食，并且讓小鼠在該環(huán)境中適應(yīng)5天以上。隨后對(duì)小鼠兩側(cè)足底進(jìn)行0.8mA的電刺激，持續(xù)時(shí)間10秒，連續(xù)進(jìn)行2天。此后的5天內(nèi)每天給予1次刺激作為強(qiáng)化階段，再隨后每周給予1次條件提醒直至3周結(jié)束。訓(xùn)練結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)活動(dòng)檢測(cè)、穿梭箱檢測(cè)和高架迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

（2）Siegmund等建立具有創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙核心特征模型小鼠的電擊方法。首先將成年小鼠置于25℃環(huán)境中，并讓小鼠在環(huán)境中至少適應(yīng)5天。實(shí)驗(yàn)在09：30~17：30進(jìn)行。將小鼠放入電擊箱內(nèi)，3分鐘后通過(guò)電擊箱的金屬網(wǎng)格對(duì)小鼠足底進(jìn)行令小鼠厭惡的電刺激（1.8mA，持續(xù)時(shí)間2秒），電擊后讓小鼠在電擊箱內(nèi)停留60秒后再回到原來(lái)的生活環(huán)境。28天后將小鼠再次放置于電擊箱內(nèi)3分鐘，但不給予電擊，隨后通過(guò)強(qiáng)迫游泳等行為學(xué)檢測(cè)小鼠的行為改變。

（3）Sawamura等的實(shí)驗(yàn)對(duì)模型的建立進(jìn)行了一定改進(jìn)，采用幽閉+電擊的方法：將大鼠置于密閉不透光的穿梭箱中，穿梭箱下部為間距1cm可通過(guò)電流的不銹鋼柵欄，箱體由左右兩個(gè)20cm×20cm×30cm的部分組成，中間有一隔板，隔板上的通道可根據(jù)需要保持開(kāi)放或關(guān)閉。箱內(nèi)安裝傳感器，監(jiān)測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡和所處位置。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，關(guān)閉隔板，使大鼠處于無(wú)法逃避足部受到持續(xù)電流刺激的狀態(tài)，刺激電流強(qiáng)度0.8mA，刺激間隔隨機(jī)，30分鐘內(nèi)給予大鼠60次電擊，每次持續(xù)時(shí)間10秒。14天后在給予大鼠足底80次不可逃避電擊，強(qiáng)度0.8mA，持續(xù)時(shí)間10秒，以檢測(cè)大鼠的適應(yīng)行為、運(yùn)動(dòng)行為和逃避行為的變化。

（4）王禾等的束縛+電擊創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校笫笾糜诿荛]不透光小盒子中，盒子下部為可通過(guò)電流的不銹鋼柵欄，大鼠處于無(wú)法逃避足部受到持續(xù)電流刺激的狀態(tài)，刺激電流強(qiáng)度8mA，刺激時(shí)間10秒，刺激間隔隨機(jī)，每次刺激30分鐘。上下午各1次，間隔不少于4小時(shí)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)3天。

2.觀測(cè)指標(biāo)

Rau模型中該電擊過(guò)程誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的行為缺陷，如僵立行為增加，逃避傷害潛伏期增長(zhǎng)和焦慮水平提高，而且該癥狀可持續(xù)4周。Siegmund模型中小鼠出現(xiàn)僵立等創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙樣癥狀。29天后將上述處理的小鼠置于一個(gè)新的環(huán)境中，經(jīng)過(guò)3分鐘適應(yīng)后給予80dB、90kHz的中性聲音刺激3分鐘，檢測(cè)小鼠的行為學(xué)改變。結(jié)果顯示小鼠存在情感遲鈍和回避社交等抑郁相關(guān)的行為學(xué)改變。Sawamura模型中大鼠總體運(yùn)動(dòng)量呈現(xiàn)兩極化，大部分減少，少部分增加。進(jìn)入陌生環(huán)境后，大鼠短期內(nèi)運(yùn)動(dòng)行為以緊張和逃避為主，同時(shí)記憶能力受損嚴(yán)重。王禾等的模型中大鼠在活動(dòng)受限、密閉不透光的小紙盒內(nèi)出現(xiàn)焦躁不安的情況，同時(shí)給予隨機(jī)間隔的電刺激，大鼠出現(xiàn)撕咬、凄叫等行為學(xué)表現(xiàn)。反復(fù)進(jìn)行上述應(yīng)激刺激，可以在較短時(shí)間內(nèi)制備與正常對(duì)照組相比行為學(xué)改變比較顯著的大鼠創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

3.模型分析

本模型實(shí)驗(yàn)條件下的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物具有條件反射性恐懼的心理特征，能反映機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷相關(guān)事件的反應(yīng)。同時(shí)中性聲音刺激顯示該模型動(dòng)物具有敏感性恐懼及過(guò)度覺(jué)醒的心理特征，可模擬對(duì)潛在危險(xiǎn)刺激的防御反應(yīng)。大鼠模型出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退和逃避等創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙癥狀，較好的反映了臨床創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的回避性行為。該模型在不同刺激條件下分別模擬了創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的創(chuàng)傷事件再體驗(yàn)和過(guò)度覺(jué)醒的典型臨床癥狀，可用于研究恐懼易感性的生物學(xué)關(guān)系，以及條件反射性恐懼和致敏性恐懼在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙形成以及維持中的影響和相互關(guān)系。王禾等發(fā)現(xiàn)8mA作為刺激電流，較一般刺激電流效果明顯，可以造成實(shí)驗(yàn)大鼠的痛苦不安，但又未達(dá)到傷害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物軀體的程度。此外，刺激間隔隨機(jī)化可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)下一次的傷害刺激產(chǎn)生心理準(zhǔn)備，此舉可以加大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的驚恐程度，這與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙臨床發(fā)生有類(lèi)似之處。

此外，也有用電擊或電擊結(jié)合閃光、噪聲等信號(hào)作為條件刺激，使應(yīng)激心理成分大大增加，易化動(dòng)物的心理反應(yīng)。心理上的改變進(jìn)一步影響生理功能，引起以交感神經(jīng)腎上腺系統(tǒng)為中心的一系列反應(yīng)。有較多的文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)：應(yīng)激對(duì)照組與心理應(yīng)激組受到的軀體刺激相同，但后者無(wú)法根據(jù)光信號(hào)預(yù)見(jiàn)電刺激，因此較前者更緊張，心理應(yīng)激程度更高。有研究表明，心理應(yīng)激組大鼠下丘腦室周核生長(zhǎng)抑素mRNA陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量明顯多于軀體應(yīng)激組，其表達(dá)程度也明顯強(qiáng)于軀體應(yīng)激組。

三、鋼珠標(biāo)準(zhǔn)致傷模型

1.建模方法

選擇成年健康家犬16只，雌雄不限，體重10.5~14.0kg。創(chuàng)傷前隨機(jī)分為對(duì)照組（4只），低速組（6只），高速組（6只）。首先通過(guò)3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉。然后1.03g銅珠室內(nèi)靶道致傷，低速組和高速組的撞擊速度分別為625m/s，1368m/s。瞄準(zhǔn)點(diǎn)在犬雙后肢大腿肌肉豐滿(mǎn)處，盡量避免傷及股骨、大血管及神經(jīng)干。傷后局部加壓包扎止血。

2.觀測(cè)指標(biāo)

犬類(lèi)產(chǎn)生創(chuàng)傷性反應(yīng)性、精神異常等CNS反應(yīng)現(xiàn)象。

3.模型分析

此模型創(chuàng)傷效應(yīng)較穩(wěn)定，兩種致傷速度產(chǎn)生兩種不同強(qiáng)度的應(yīng)激模型，以次探索創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙早期CNS應(yīng)激損傷的某些內(nèi)在聯(lián)系及病理生理基礎(chǔ)。