3.2 結果

建立在優化ISSR擴增體系的基礎上，選取100條ISSR引物進行初篩和復篩，最終篩選出12條多態性較好的引物，用于擴增反應。引物由上海生物工程公司合成，引物的堿基序列見表3-2。

表3-2 用于ISSR擴增的引物及引物擴增的條帶數

1. ISSR-PCR（內部簡單重復序列間擴增）反應體系成分組成：DNA模板2μL; MgCl2 1.2μL; dNTPs 2μL；引物0.6μL; Ta q聚合酶0.2μL; PCR 10×緩沖液2μL；加入ddH2O 12μL; PCR反應的總體積為20μL。

2. PCR熱循環儀L9600。

3．熱循環儀的溫度：起始變性步驟的溫度為94℃，維持時間為5min；循環變性步驟的溫度為94℃，維持時間為60s；循環退火步驟的溫度為54℃，維持時間為45s；退火與延伸步驟之間的變溫速率為1℃/s；循環延伸步驟的溫度為72℃，維持時間為2min；循環周期總數為45個循環；最后延伸步驟的溫度為72℃，維持時間為7min。

4. ISSR-PCR片段的分析：瓊脂糖凝膠電泳；電泳緩沖液為0.5×TBE（三羥甲基氨基甲烷+硼酸+乙二胺四乙酸）；所用膠濃度為1.5%；電泳條件為電流50mA、電壓130V、泳動時間3h；染料為溴化乙啶（EB），終濃度0.5μg/mL; DNA標記物為100bp DNA plus ladder（MBI公司）[1]。

對100條ISSR引物進行多態性篩選，從中選出擴增效果好、條帶清晰、多態性及重復性好的12條引物，對19個竹種的DNA樣品進行PCR擴增，擴增結果如圖3-1所示。根據表3-2,12條引物共擴增出188個位點，平均每個引物擴增出15.7個，擴增片段多集中在300～5000bp。這說明19個竹種擴增位點較為豐富，多態性顯著，具有豐富的遺傳多樣性，種間差異比較明顯，表明ISSR標記能夠有效地揭示材料間的多態性。

圖3-1 ISSR-02引物對19個竹種ISSR擴增的電泳結果