第五節　肉品在加熱過程中形成的有害物

一、多環芳烴

許多煙熏和糖熏食品中含有多環芳烴類致癌物質，嚴重危害食用者的健康，使得人們對煙熏食品產生了懷疑。在目前已查出的500多種主要致癌物中，有200多種屬于多環芳烴類化合物。

（一）多環芳烴的一般物理化學特性

PAHs主要是由有機物的不完全燃燒產生的。大多數PAHs在常溫下呈固態，沸點比相同碳原子數目的正構直鏈烷烴高。3環以上PAHs大都是無色或淡黃色晶體，個別顏色比較深。因其分子結構對稱、偶極距小、分子量大，PAHs通常為非極性物質，在水中溶解度低，且具有高熔點和高沸點的特征。在常溫下，PAHs是以氣相和固相共存。一般而言，低環PAHs主要存在于氣相中，5～6環PAHs則主要凝聚而吸附在顆粒物表面上，介于兩者之間的含有3～4個苯環的PAHs以氣相和顆粒相共存。1976年美國環保局提出的129種“優先污染物”中，多環芳烴化合物有16種，這16種優先控制的PAHs結構見圖1-11，基本情況見表1-1。具有致癌作用的多環芳香烴一般為4～6環的稠環化合物，如苯并（a）蒽、苯并（b）熒恩、3，4-苯并芘等，其中3，4-苯并芘，又稱為苯并（a）芘，是多環芳烴類化合物中最具有代表性的強致癌稠環芳烴，是首個被發現的環境化學致癌物，其分布廣泛，性質穩定，致癌性強。3，4-苯并芘通常被用來作為多環芳烴類化合物總體污染的標志。

（二）多環芳烴的來源及形成機理

1. 多環芳烴的來源

（1）自然來源　多種陸生植物（如小麥及裸麥幼苗）、多種細菌（如大腸菌等）以及某些水生植物都有合成多環芳烴（包括某些致癌性多環芳烴）的能力。生物體內合成、森林及草原自然起火、火山活動是環境中多環芳烴主要的天然來源。

（2）人為來源　

①各類工業鍋爐、生活爐灶產生的煙塵，如燃煤和燃油鍋爐、火力發電廠鍋爐、燃柴爐灶。

②各種生產過程和使用煤焦油的工業過程，如煉焦、石油裂解，煤焦油提煉、柏油鋪路等。

③各種人為原因的露天焚燒（包括燒荒）和失火，如垃圾焚燒、森林大火、煤堆失火。

④各種機動車輛排出的尾氣。

⑤吸煙和烹調過程中產生的煙霧是室內多環芳烴污染的重要來源。

食品在加工過程中，脂肪、蛋白質和碳水化合物等有機物質的高溫（>200℃）受熱分解是食品中多環芳烴的主要來源，尤其是脂肪在500～900℃的高溫，最有利于多環芳烴的產生，并且產生量隨著脂肪含量的增加而大幅增加。

2.不完全燃燒條件下多環芳烴的形成機理

根據Badger等（1959）的假說，熏煙生成（熱解）過程中3，4-苯并芘的合成步驟如圖1-12所示。首先有機物在高溫缺氧條件下裂解產生碳氫自由基結合成乙炔（1），乙炔經聚合作用形成乙烯基乙炔或1，3-丁二烯（2），然后經環化生成乙基苯（3），再進一步結合成丁基苯（4）和四氫化萘（5），最后通過中間體（6）形成3，4-苯并芘（7）。但這并不意味著3，4-苯并芘一定要從兩個碳原子的化合物開始，實驗已證明，圖中任一中間體均可在700℃下裂化生成3，4-苯并芘。發煙時3，4-苯并芘的生成量與煙熏木材的燃燒溫度有很密切的關系。一般認為發煙溫度在400℃以下時，只形成極微量的3，4-苯并芘，發煙溫度在400～1000℃之間時，3，4-苯并芘的生成量隨溫度的上升急劇增加。

燒烤肉制品中3，4-苯并芘的含量與烤制方式（炭烤、木頭烤、電烤等）、原料肉中的脂肪含量、燒烤溫度、時間、肉樣和火源的距離等因素有關。

（三）多環芳烴的危害

1.直接致癌作用

3，4-苯并芘對人體健康可造成嚴重危害，其主要是通過食物或飲水進入機體，在腸道被吸收，進入血液后很快散布至全身。小劑量3，4-苯并芘就有可能引起局部組織癌變。有研究表明，3，4-苯并芘可引起大鼠肝細胞、肺細胞及外周血淋巴細胞 DNA損傷，對皮膚、眼睛、消化道有刺激作用，可以誘發皮膚、肺、消化道和膀胱等癌癥，且具有胚胎毒性。

2.間接致癌作用

3，4-苯并芘還是一種間接致癌物，所謂間接致癌物是指在體內需經代謝活化才與大分子化合物結合的致癌物。在此代謝活化過程中，細胞色素酶系P450（簡稱CYP450）起到了重要作用。

3. 致畸致突變作用

3，4-苯并芘的毒性還遠不止上述的致癌性，它還是一種很強的致畸、致突變和內分泌干擾物。3，4-苯并芘對兔、豚鼠、大鼠、鴨、猴等多種動物均能引起胚胎死亡或畸形及仔鼠免疫功能下降。

4. 神經毒性

3，4-苯并芘還具有一定的神經毒性。研究表明，以3，4-苯并芘為代表的PAHs具有一定的神經毒性，其中最為突出的是影響暴露者的學習記憶能力。研究認為，3，4-苯并芘可對神經元產生細胞毒性效應，脂質過氧化可能是細胞活力降低的原因之一。

5. 攝入限量標準

自2002年食品科學委員會提出的食品中PAHs對人體健康的危害后，歐洲委員會第一次對食品中的3，4-苯并芘進行了限量，包括煙熏肉制品和魚肉制品。歐盟規定煙熏劑中3，4-苯并芘的含量不超過0.03μg/kg，德國對肉制品中3，4-苯并芘的殘留限量為1μg/kg，隨后，澳大利亞、捷克、瑞士、意大利等國也采用了同樣的限量標準。我國食品衛生標準（GB 2762—2005）中規定，熏烤肉制品中3，4-苯并芘的殘留量不得超過5μg/kg。

（四）多環芳烴的檢測方法

3，4-苯并芘常用的檢測方法有GB/T 5009.27—2003《食品中苯并芘的檢測》中的熒光分光光度法和行業標準NY/T 1666—2008《肉制品中3，4-苯并芘的測定——高效液相色譜法》，前者要求試樣量50g，檢出限為1ng/g，該方法的缺點是試劑使用種類較多，且多為有機試劑，測定時間長，檢測限較高，靈敏度較差；后者所用試劑較少，測定時間較短，分離效果好，檢出限低，適用于燒烤、油炸、煙熏等肉制品中3，4-苯并芘的檢測。3，4-苯并芘的檢測方法還有氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）、薄層色譜法、紙層析法等，隨著現代檢測技術的快速提高，將會出現更加快速、準確、智能化的檢測方法，能夠更好地進行肉制品中3，4-苯并芘殘留的安全檢測。

（五）肉制品中多環芳烴產生的影響因素

1. 燒烤方式影響3，4-苯并芘的含量

炭烤、木柴烤、電烤等烤制方式影響燒烤肉制品中3，4-苯并芘的含量。Bonny等（1983）研究了炭、木柴和電烤三種加工方式對香腸中3，4-苯并芘殘留量的影響，結果表明，使用電烤方式制作的香腸中3，4-苯并芘的殘留量最少，為0.2μg/kg，炭和木柴加工的香腸中3，4-苯并芘的含量分別為0.3μg/kg、54.2μg/kg。Olatunde等（2008）檢測了煙熏、燒烤和鹵煮肉中多環芳烴的含量，結果表明三種加工方式中3，4-苯并芘的含量分別為6.52μg/kg、7.04μg/kg及0.07μg/kg。在熏制過程中，熏煙中的3，4-苯并芘等有害物質會附著在產品的表層，如熏肉制品表層黑色的焦油中就含有大量的3，4-苯并芘等多環芳烴類化合物。

2. 燒烤溫度和時間、肉與火源的距離影響3，4-苯并芘的含量

脂肪在高溫（>200℃）熱解時可以產生3，4-苯并芘，500～900℃的高溫，尤其是在700℃以上，其他有機物質如蛋白質和碳水化合物也會分解產生。食物在烘烤或煙熏過程中若出現烤焦、烤煳或炭化，食物中3，4-苯并芘的含量將明顯提高。另外動物食品在烤制過程中滴下的油滴經檢測，其中3，4-苯并芘的含量是動物食品本身的10～70倍。Kazerouni等（2001）研究表明，經過高溫和低溫處理的樣品，3，4-苯并芘的含量分別為2.6μg/kg和0.13μg/kg。燒烤時間過長，或被烤焦的產品其含量顯著增加。明火燒烤時烤制時間相同，肉樣距離火源越近，其3，4-苯并芘殘留量越高。

3. 原料肉種類和脂肪含量影響3，4-苯并芘的含量

肉中脂肪含量是影響3，4-苯并芘形成的另一個重要因素，脂肪含量與3，4-苯并芘的殘留量呈正相關。Doremire（1979）等研究了牛肉脂肪含量對烤牛肉產品中3，4-苯并芘殘留量的影響。結果發現，當脂肪含量從15%增加到40%時，烤牛肉樣品中3，4-苯并芘的殘留量由16.0μg/kg增加到121.0μg/kg。Chen（2001）指出，烤豬肉中多環芳烴相比牛肉和雞肉含量多，原因可能是與豬肉中的脂肪含量有關，即脂質和脂質分解產物參與3，4-苯并芘的形成。

二、甲醛

許多生物代謝時可以產生甲醛，而熏肉制品表層的甲醛，則主要是木材或糖類在缺氧狀態下不完全燃燒時形成并沉積和滲透在產品中的。甲醛具有一定的抗菌作用，可以一定程度上防止熏肉腐敗，同時也給煙熏肉制品帶來安全隱患。

（一）甲醛的基本特性

甲醛，又稱蟻醛，化學式為HCHO，具有強烈的刺激性氣味，溶于水、乙醇、乙醚，低溫下呈透明可流動液體，400℃時分解成CO和H2。水溶液的濃度最高可達55%。

（二）食品中甲醛的一般來源

1. 內源甲醛

甲醛是許多生物體的代謝產物。魚貝類食品、香菇、瓜果、蔬菜中均可檢出天然存在的內源甲醛，鱈魚類中的甲醛含量最高可達200mg /kg。香菇中甲醛是香菇菌酸的分解產物。鮮香菇中甲醛正常范圍為4～54mg/kg，烘干后甲醛含量顯著增加，一般為21～369mg/kg。

2. 加工過程中產生的甲醛

食品在加工過程中，除一些食物成分受機械、物理因素（光、熱、高溫、高壓）、化學因素（酸、堿、鹽、水解及酶解）、生物因素（微生物發酵）等影響，能夠自動氧化分解為甲醛等物質外，美拉德反應、Strecker降解反應、糖類的脫水和熱解反應均可能使碳-碳鍵斷裂生成甲醛和其他揮發性物質。

發酵食品中的糖和氨基酸發生美拉德反應或某些成分自動氧化產生甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酮等多種羰基化合物；乳制品中乳脂肪的酶解反應，糖、氨基酸等水溶性物質發生的美拉德反應，不飽和脂肪酸在空氣中氧的作用下發生氧化、裂解、生成甲醛；環境污染造成的水源污染，及用含氯藥劑及臭氧消毒處理的飲用水都會含有不同濃度的甲醛。食品原輔料、環境、容器中也會存在不同濃度的甲醛。因此在食品加工過程中會不可避免地引入甲醛。

肉制品中甲醛主要來源于冷凍或熟化過程中脂肪組織的氧化，水溶性低分子化合物加熱時發生非酶褐變反應和蛋白質、肽、氨基酸、糖的熱分解反應中一次及二次生成物。干香腸、火腿、熏肉用木材熏制，木材在缺氧狀態下干餾會生成甲醇，甲醇進一步氧化成甲醛，吸附聚集在產品表面；除煙熏成分中含有甲醛外，一部分物質由于熏制熟化過程中脂質的水解、氧化或脂肪酶的作用，最后也生成羰基物質和甲醛。

糖熏肉制品表面色澤好，有糖熏的獨特氣味，但糖熏過程中糖的不完全燃燒也會產生甲醛并沉積到雞皮和雞肉中。

（三）甲醛的危害

甲醛是一種高毒性物質，具有致癌、致畸性，還會導致新生兒染色體異常、白血病，以及引起青少年記憶力和智力的下降等嚴重后果。甲醛的危害主要表現在三大方面：刺激作用、毒性作用、致癌及致突變作用。

1. 刺激作用

相關研究表明，甲醛對人體免疫系統和呼吸道均有較大影響。甲醛通過使細胞中的蛋白質凝固變性，抑制細胞機能，其蒸汽及其溶液對鼻腔、眼睛、呼吸系統黏膜和皮膚有強烈的刺激作用，甲醛溶液滴入眼睛會造成不可逆轉的永久損傷，甚至引發失明。甲醛對呼吸系統的刺激會引起鼻敏感、咳嗽、打噴嚏，引發呼吸道炎癥及肺功能損害等。由于其高度的水溶性，甲醛極易被鼻、鼻竇以及氣管、支氣管黏膜中富含水分的黏液吸收，并與其中的蛋白質、多糖物質結合，破壞黏液及纖毛的運輸機制，表現出明顯的局部刺激癥狀。

2. 毒性作用

人們通過皮膚或者呼吸道與甲醛接觸而受到毒害。甲醛引起的中毒可以分為急性中毒和慢性中毒。其中急性中毒的癥狀為流淚、咳嗽、惡心、嘔吐、頭痛、昏厥、肺氣腫以及腎損害等。慢性中毒的癥狀表現為視力下降、免疫力下降、皮膚變硬、手指變色以及智力發育產生障礙等。

甲醛的基因遺傳毒性已在人工培養的哺乳動物細胞的體內實驗與動物實驗被證實。吸入甲醛將導致機體的免疫功能受損，并出現不同癥狀。甲醛對小鼠的動物實驗表明，甲醛對小鼠淋巴組織具有抑制作用。不同劑量的甲醛均能引起小鼠脾臟和胸腺重量的下降，而免疫器官重量的變化是判定機體損傷的一項主要生物指標。低劑量甲醛能引起細胞輕度的脂質過氧化，而不影響其功能；但高劑量的甲醛可引起蛋白質、DNA等大分子損傷，最終導致細胞壞死。另據報道，工人接觸高濃度的甲醛除了抑制細胞免疫，同時會增強體液免疫的異常性。

甲醛通過危害人類的中樞神經系統，引起人的神經行為的改變，導致神經系統紊亂甚至變性壞死。研究顯示，甲醛可通過降低細胞能量代謝抑制神經元正常生理活動，進而導致整個神經系統功能的損傷。

3.致癌及致突變作用

甲醛與人類腫瘤之間的因果關系已經引起了人們的廣泛關注。動物實驗研究發現，接觸甲醛與口腔癌和鼻咽癌的發生相關性最大，另外接觸甲醛可以增加白血病、肺癌及腦癌的發病率。甲醛致癌的機理除了與甲醛會導致基因的突變和染色體的損傷有關之外，更為重要的是甲醛可導致淋巴細胞損傷或功能失調，以及引起免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷活性明顯降低，從而引起機體對突變細胞免疫監視功能的障礙。

（四）甲醛的限量

通常情況下，當空氣中甲醛含量為0.8×10-6mg/m3時，通過氣味即可感知到甲醛的存在；環境空氣中甲醛含量大于0.05mg/m3即對人體產生危害；當甲醛含量為0.05～0.5mg/m3時，眼睛即會受到刺激。美國環境保護署公布的甲醛每天最大參考劑量（RfD）為0.2mg/（kg·d），當人們接觸環境中甲醛含量超過RfD時，就會對人體健康帶來危害。我國規定，車間空氣中的甲醛含量必須小于0.5mg/m3，地面水中的甲醛含量必須小于0.5mg/m3，居民區范圍內空氣中甲醛含量必須小于0.05mg/m3。我國《室內空氣質量標準》規定室內空氣中甲醛的限值為0.08mg/m3；《乘用車內空氣質量評價指南》規定車內甲醛的濃度標準不超過0.10mg/m3。當人們在甲醛濃度達到50～100mg/m3的環境下暴露5～10min時，會造成很嚴重的傷害。

所以在甲醛的工業生產與消費的過程中，要做好防范工作：降低環境空氣中甲醛的濃度，避免甲醛與皮膚的直接接觸，避免甲醛蒸汽經由呼吸道進入體內等。

（五）甲醛的測定方法

啤酒、水產品等產品中的甲醛測定方法已有很多研究，但是關于肉制品中甲醛檢測方法的研究卻很罕見。若將現有的水產品中甲醛含量檢測的方法直接運用到肉制品的檢測中去，會造成樣品提取液渾濁，進而會對方法的回收率、測定的準確性造成不利的影響。因此建立一套穩定可行的肉制品中甲醛含量的測定方法已刻不容緩。

1. 分光光度法

分光光度法測定的原理是通過甲醛與某種化合物反應，進而產生某種帶有顏色的物質，然后在特定波長下進行測定。

筆者采用改良的水蒸氣蒸餾裝置（圖1-13）測定了不同產地、不同種類煙熏臘肉中的甲醛含量。

取2g粉碎后的熏肉樣品，加蒸餾水定容至10mL，用分散機在5000r/min轉速下分散20s。將分散均勻的肉糊加入到水蒸氣蒸餾器中，再加入3mL磷酸溶液后立即通水蒸氣蒸餾，接收管下口事先插入盛有10mL蒸餾水且置冰浴的接收裝置中，蒸餾50min后將餾出液稀釋到200mL，同法蒸餾空白。

吸取10mL餾出液，于25mL具塞比色管中加入2.0mL乙酰丙酮溶液，搖勻，在沸水中加熱10min，取出冷卻，倒入1cm比色皿中，在波長415nm處，以空白溶液為參比測量吸光度。

不同熏肉制品中甲醛的含量見表1-2。

所檢測的熏肉制品中甲醛含量均較高，最高甚至達到了124.31910mg/kg。應用改良的水蒸氣蒸餾，分光光度法測定，操作簡單，測定迅速。此法檢出限為1.0mg/kg，定量限為3.0mg/kg，回收率85%以上，準確率較高。

2.氣質聯用色譜法（GC-MS）

氣相色譜法（GC）有頂空氣相色譜及衍生化氣相色譜，頂空法只對甲醛濃度較高的樣品適用，而衍生法則可檢測低濃度甚至痕量的甲醛。

用氣質聯用色譜法測定市售5個公司的臘肉中的甲醛含量：采用0.3mL 2，4-二硝基苯肼（醛類物質可在酸性介質中與2，4-二硝基苯肼反應生成2，4-二硝基苯腙），衍生化溫度60℃，衍生化時間30min，用二氯甲烷萃取熏肉表層中的甲醛，萃取2次；用DB-5彈性石英毛細管柱進行檢測。條件如下：柱溫60℃；進樣口溫度260℃；程序升溫以10℃/min升溫速度升至150℃，然后升溫至260℃，恒溫5min；載氣He；柱前壓40kPa；分流比10∶1；溶劑延遲5min；進樣量1μL。電子電離源；電子能量70eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；電子倍增器電壓1.02kV；接口溫度250℃；選擇離子檢測m/z 79、210。

2，4-二硝基苯腙質譜圖見圖1-14，總離子流和特征離子色譜圖見圖1-15。

不同樣品臘肉中甲醛的含量見表1-3。

市售的5種臘肉表層與內部均存在著一定量的甲醛，最高甚至達到了254.52mg/kg。

在不含甲醛的樣品本底中添加一定量的甲醛標準進行實驗，最低檢測質量濃度0.01mg/L，以取樣量2.0g計，本法對樣品的檢出限為0.50mg/kg。該方法簡便快速、結果準確、靈敏度高，可作為測定煙熏肉制品中甲醛的有效方法。

3. 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法直接測定甲醛含量靈敏度低，對于低濃度甲醛的測定多采用甲醛與衍生劑2，4-二硝基苯肼（DNPH）在一定溫度條件下，反應生成2，4-二硝基苯腙，提取液經液相色譜分離，二極管陣列檢測器或紫外檢測器檢測，外標法定量測定。

有研究者用高效液相色譜（HP1100）帶紫外檢測器（DAD），Hypersil ODS-C18色譜柱，甲醇∶水（60∶40）為流動相，流速0.5mL/min，338nm波長下測定18份水產品中的甲醛含量，17份中甲醛含量為0.45～192.94mg/kg，1份樣品甲醛含量低于0.20mg/kg。此法的檢出限為7.20μg/L，相當于樣品中甲醛的檢出限為0.20mg/kg。甲醛高效液相色譜法吸收圖譜見圖1-16。

應用高效液相色譜法測定甲醛含量，重復性好，專一性強，是一種靈敏、準確的甲醛含量測定方法。目前標準SC/T 3025—2006、GB/T 21126—2007、SN /T 1547—2011中均采用此方法。

三、雜環胺

雜環胺（heterocyclic amines，HCAs）是在肉品熱加工過程中由于蛋白質、氨基酸熱解而產生的一類雜環類化合物，這些雜環化合物有些具有芳香性，所以又稱雜環芳香胺。至今已經發現有30多種雜環胺類化合物，其中有些雜環胺具有致癌、致突變作用。

對于肉中致癌致突變物質的報道最早可追溯到1939年，當時瑞典Lund大學教授Widmark發現用烤馬肉的提取物涂布于小鼠的背部可以誘發乳腺腫瘤，但這一重要發現在當時并沒有引起人們的重視。20世紀70年代，人們建立了以Ames試驗為代表的一系列有效方法，用于致癌、致畸、致突變性物質的篩選。1977年，日本科學家發現，以明火或炭火炙烤的魚和牛肉的烤焦表面及煙氣具有強烈的致突變性；緊接著，Commoner（1978）在小于200℃的正常家庭烹調條件下的牛肉餅和牛肉提取物中也同樣檢出強烈的致突變性。由此，人們對氨基酸、蛋白質熱解產物產生了濃厚的研究興趣，至今已經發現了30多種雜環胺類化合物。

目前許多國家對雜環胺的各個方面展開了廣泛研究，如生物毒性的監測、提取鑒定方法的優化、在不同食品中含量的測定、不同加工方式和條件的影響、生物利用效率和代謝方式等，從而為評估其對人類健康的影響提供依據和指導。我國對雜環胺的研究始于20世紀80年代后期，至今仍比較少。隨著人民生活水平的不斷提高和對自身健康的廣泛關注，食品安全問題已在全球范圍內掀起了一股熱潮，而加工肉制品中的雜環胺更已成為這股熱潮中的焦點。

（一）雜環胺的發現

雜環胺源于日本科學家Sugimura Takashi在20世紀70年代后期一個假日期間的偶然發現。當他的妻子在廚房烤魚時，煙氣引起了這位環境致癌物研究專家的注意。他將烤魚的煙氣與含有許多致突變物的煙草煙氣聯系起來，提出了烤魚煙氣中是否同樣存在致突變物的疑問。帶著這樣的疑問，他在實驗室中用玻璃纖維濾膜收集烤魚煙氣并將其溶解在二甲基亞砜中，結果發現其對鼠傷寒沙門菌TA98菌株具有強烈的致突變性。緊接著，烤魚和烤肉的燒焦部分也被檢測出相同的致突變性。通過加熱色氨酸、谷氨酸等氨基酸和大豆球蛋白等其他蛋白質，2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（AαC）、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（Trp-P-1）和2-氨基-6-甲基二吡啶并[1，2-α：3'，2'-d]咪唑（Glu-P-1）等雜環胺被從中分離出來并進行結構鑒定。1980年后，研究者又陸續從炸牛肉、烤沙丁魚等加工肉制品中分離出了IQ、MeIQ、IQx、PhIP等雜環胺。Harman和Norharman最初是從蒺藜科多年生草本植物駱駝蓬分離出來的，在駱駝蓬堿、煙草煙氣及加工肉制品中均有分布；其形成與色氨酸的熱解密切相關。

（二）雜環胺的結構與特性

雜環胺通常具有平面結構，其結構中含有2～5個（通常為3個）縮合芳香環，環中包含至少一個氮原子，環外通常有一個氨基和1～4個甲基作為取代基團。從化學結構上來看，雜環胺可以進一步分類為氨基咪唑氮雜芳烴（aminoimidazo azaren，AIA）和氨基咔啉（amino-carbolin congener）兩大類。

1.氨基咪唑氮雜芳烴

AIA包括喹啉類（IQ、MeIQ）、喹喔類（IQx、MeIQx、4，8-DiMeIQx、7，8-DiMeIQx）和吡啶類（PhIP）與呋喃吡啶類（IFP）。AIA一般形成于100～300℃，由肉中的氨基酸、肌酸、肌酸酐和己糖生成。AIA均含有咪唑環，其上的α位置有一個氨基，在體內可以轉化成N-羥基化合物而具有致癌、致突變活性。由于AIA上的氨基均能耐受2mmol/L的亞硝酸鈉的重氮化處理，與最早發現的IQ性質類似，并且其形成溫度較低，因此AIA又被稱為IQ型雜環胺。

2.氨基咔啉

氨基咔啉包括α-咔啉（AαC、MeAαC）、β-咔啉（Norharman、Harman）、γ-咔啉（Trp-P-1、Trp-P-2）和ζ-咔啉（Glu-P-1、Glu-P-2），一般是在加熱溫度高于300℃，由氨基酸和蛋白質的熱解反應產生。由于氨基咔啉類環上的氨基不能耐受2mmol/L的亞硝酸鈉的重氮化處理，在處理時氨基脫落轉變成為C-羥基，失去致癌、致突變活性，因此稱為非IQ型雜環胺。常見雜環胺的化學名稱、結構式以及性質見表1-4。

（三）雜環胺的生成機制

如前所述，雜環胺從化學結構上可分為氨基咪唑氮雜芳烴類和氨基咔啉類，這兩類化合物的生成方式各不相同。

1. IQ型雜環胺的生成機制

IQ型雜環胺的研究較多，形成機理也更為清晰。1983年，J?gerstad 等在拉斯維加斯舉辦的第二屆世界美拉德大會上就提出了IQ型雜環胺的形成假說：三種肌肉中天然存在的前體物質，即肌酸、特定氨基酸和糖，參與了雜環胺的形成過程。肌酸在溫度高于100℃時通過自發的環化和脫水而形成2-氨基咪唑部分，而喹啉或者喹喔啉部分則通過吡嗪或者吡啶和乙醛縮合而形成。這個假說已經在部分IQ型雜環胺的合成和鑒定中得到驗證。

關于IQ型雜環胺中的PhIP形成機制的報道較多，肌酸與亮氨酸、異亮氨酸和酪氨酸加熱可以形成PhIP；肌酐與苯丙氨酸、葡萄糖加熱也可以形成PhIP。有研究者通過同位素標記證明，來自于苯丙氨酸的苯環、3-C原子和氨基上的N原子都參與了PhIP的形成。目前多數學者比較認可的PhIP形成機制是，苯丙氨酸的Strecker降解產物苯乙醛與肌酸酐反應形成羥醛加合物，羥醛加合物通過脫水形成羥醛縮合物，最后羥醛縮合物與一個含有氨基的化合物經過包括環化和裂解在內的一系列反應而形成PhIP。

2. 氨基咔啉類雜環胺的生成機制

對于氨基咔啉類雜環胺的形成機制目前研究較少，通常認為這類雜環胺是在300℃以上的高溫下由蛋白質或者氨基酸直接熱解而來。的確，AαC和MeAαC最初來源于大豆球蛋白的熱解，Trp-P-1和Trp-P-2以及Glu-P-1和Glu-P-2則分別來源于色氨酸和谷氨酸的熱解，但Skog（2000）等發現肉汁模型在200℃加熱30 min下就能產生Harman、Norharman、AαC和微量的 Trp-P-1 、Trp-P-2，同時，許多文獻報道在200℃以下加工條件下諸多肉類可產生含量水平較高的Norharman和Harman。因此300℃不是形成氨基咔啉類雜環胺所必須達到的溫度，氨基咔啉類雜環胺也可能并非由簡單的蛋白質或者氨基酸裂解而成。

3.雜環胺的生物毒性

（1）雜環胺的致突變性　Ames試驗顯示雜環胺具有很強的致突變能力。除誘導細菌突變外，它還可在哺乳動物體內經過代謝活化產生致突變性，引起DNA損傷。在人體中，雜環胺通過細胞色素氧化酶P450IA2激活而形成N-羥基衍生物，N-羥基衍生物在肝臟以及其他靶器官中經N-乙酰轉移酶NAT2作用而形成芳胺基-DNA加合物，導致DNA損傷。

（2）雜環胺對試驗動物的致癌性　大多數雜環胺對嚙齒動物均有致癌性，可誘發多種部位的腫瘤，但主要靶器官是肝臟。其中，Glu-P-1、Glu-P-2、AαC和MeAαC均能誘導肩胛間及腹腔中褐色脂肪組織的血管內皮肉瘤，而Glu-P-1、Glu-P-2、MeIQx和PhIP則能誘導大鼠結腸腺癌。Rohrmann等（2009）發現，如果雜環胺的每天攝入量超過41.4ng，患直腸癌的風險將大大提高。Archer（2000）通過試驗證明，長期攝入雜環胺會誘發直腸癌、胸腺癌和前列腺癌。鑒于眾多研究結果，1993年國際癌癥研究中心（IARC）將IQ歸類為“對人類很可疑致癌物（2A級）”，將MeIQ、MeIQx、PhIP、AαC、MeAαC、Trp-P-1、Trp-P-2和Glu-P-1歸類為“潛在致癌物（2B級）”。

（四）雜環胺的測定方法

每克肉制品的雜環胺含量通常在納克量級，并且由于肉制品基質的復雜性，其提取與檢測手段一直是研究的熱點與難點。

1. 雜環胺的提取方法

肉制品基質成分復雜，包括蛋白質、脂肪等多種物質，這些物質的存在嚴重干擾了雜環胺的分離提取。因此，液液萃取、固相萃取、超臨界流體萃取等許多分離富集雜環胺的方法被應用于樣品的前處理。由Gross等于1992提出的樣品前處理方法已經成為經典，近年來肉制品中雜環胺的提取方法大多是在此方法基礎上稍做修改。

經典的樣品前處理方法可概括如下。第1步，沉淀蛋白，采用氫氧化鈉溶液溶解、均質樣品，并通過離心或過濾去除蛋白質；第2步，液液萃取與使用吸附劑萃取結合使用，通常使用硅藻土作為吸附劑，水相以薄層的形式在化學惰性基質上分散，用二氯甲烷將雜環胺洗脫下來；第3步，兩個固相萃取過程，使用丙基磺酸柱（PRS）以及反相C18柱來實現；第4步，通過氮氣吹干洗脫液后用甲醇定量。

2. 雜環胺的檢測方法

表1-5總結了加工肉制品中雜環胺檢測的常用方法。其中，高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）是定性定量分析雜環胺的最常規的方法。通過比較實際樣品與標準樣品保留時間可初步對目標物進行定性，而通過比對二極管陣列檢測器產生的特征紫外吸收光譜，可對樣品中的目標物進行進一步定量。由于熒光檢測器與紫外檢測器相比具有更高的靈敏度，因此對于具有熒光的非極性雜環胺，通常采用兩種檢測器串聯的方法以排除干擾，提高定性分析的準確性。Y.Yao等（2013）通過乙酸乙酯提取醬牛肉中的雜環胺，經過固相萃取操作后上樣于裝配有紫外和熒光檢測器的高效液相色譜儀，結果表明，12種雜環胺的檢出限（LOD）在0.01～2.97ng/g，加標回收率在68.69%～101.81%，可以很好地滿足醬牛肉中雜環胺檢測的要求。

酶聯免疫吸附法（ELISA）、氣相色譜法（GC）和氣相色譜串聯質譜法（GC-MS）也可用于雜環胺的檢測。但是，由于大部分雜環胺難以揮發，只有少數雜環胺經復雜的衍生化后才能在氣相色譜儀中進行檢測；對于ELISA法只有PhIP等少數雜環胺的單克隆抗體被合成，并沒有實現商品化，因此這些方法的應用范圍較小。

近年來迅速發展的液相色譜串聯質譜（LC-MS）技術，很好地結合了色譜良好分離能力和質譜的高靈敏度和高選擇性，是目前檢測肉制品中雜環胺的最佳方法。GB 5009.243—2016用氫氧化鈉/甲醇提取肉樣中雜環胺，經固相萃取柱凈化后用液相色譜串聯質譜檢測5種雜環胺，該方法檢出限低，5種雜環胺檢出限在0.1～0.3ng/g，不足之處是LC-MS需要繁雜昂貴的儀器，許多實驗室達不到要求，因此也在一定程度上限制了其應用范圍。

隨著超高效液相色譜（UPLC）這種強有力的分離技術的發展，超高效液相色譜串聯二級質譜（UPLC-MS-MS）也被應用于雜環胺的檢測。UPLC借助于傳統的HPLC的理論和方法，通過采用1～2μm的細粒徑填料和細內徑色譜柱而獲得很高的柱效。UPLC不僅縮短了檢測時間，而且相比傳統的HPLC-MS，其檢測限也降低了10倍。Barceló-Barrachina等（2006）采用超高效液相色譜-電噴霧串聯二級質譜（UPLC-ESI-MS-MS）技術分析復雜食品體系中的雜環胺含量，僅在2min內就完成了16種雜環胺的分離和分析。

四、膽固醇氧化物

膽固醇經過光、熱、氧等條件的作用，自身發生一系列氧化反應，最終能形成多種氧化產物，統稱為膽固醇氧化物（cholesterol oxidation products， COPs）。目前研究表明，COPs可能有70余種，但大多數由于自身極不穩定，因此并不常見。食品中常見的COPs有7-酮基膽固醇、7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5α，6α-環氧化膽固醇、5β，6β-環氧化膽固醇、膽甾烷-3β，5α，6β-三醇、20-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇等。

（一）膽固醇及其氧化物的結構與性質

1. 膽固醇的結構與性質

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環戊烷多氫菲的衍生物，由甾體部分和一條長的側鏈組成，含有不飽和鍵（圖1-17）。早在18世紀人們已從膽石中發現了膽固醇，1816年化學家本歇爾將這種具脂類性質的物質命名為膽固醇。

一般，脂類物質主要分為兩大類。一類叫脂肪（主要是甘油三酯），是人體內含量最多的脂類，是體內的一種主要能量來源；另一類叫類脂，是生物膜的基本成分，約占體重的5%，除包括磷脂、糖脂外，還有很重要的一種叫膽固醇。膽固醇溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑。

膽固醇廣泛存在于動物體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高。膽固醇是構成細胞膜的重要組成成分，占質膜脂類的20%以上。血漿中的脂蛋白也富含膽固醇，其中大部分與長鏈脂肪酸構成膽固醇酯，僅有10%不到的膽固醇是以游離態存在的。膽固醇雖然存在于動物性食物之中，但是不同的動物以及動物的不同部位，膽固醇的含量很不一致。

2. 膽固醇氧化物的結構與性質

食品中常見的幾種膽固醇氧化物結構如圖1-18所示。

在常溫下，大多數膽固醇氧化物為白色粉末固體，沸點均超過300℃，在水中的溶解度不是很大，但能夠溶于正己烷、丙酮等有機溶劑中，也具有易溶于脂肪的特性。在通常情況下，大多數膽固醇氧化物較為穩定，如果是處于中性和堿性環境中，不太容易分解，然而在有氧、加熱等特定條件下也能發生加成等反應，轉變為其他膽固醇氧化物。

（二）膽固醇氧化物形成機理

1.自由基機制

膽固醇分子含有一個雙鍵，因此容易在氧自由基或其他自由基作用下發生氧化反應。在動物組織細胞中，膽固醇是質膜的重要組成成分，它嵌于磷脂雙分子層之間，其分子的取向與鄰近的磷脂分子的脂肪酸平行。細胞膜含有豐富的磷脂，因此，在氧化過程中，細胞膜中磷脂的不飽和脂肪酸氧化產生自由基，膽固醇通過自由基機制發生自動氧化。Smith（1981）推測食品或生物系統中膽固醇氧化可分為分子間和分子內兩種形式。在分子間氧化過程中，膽固醇分子中的氫是由細胞膜上與之相鄰的多不飽和脂肪酸氧化產生的過氧自由基或氧自由基時所提供的。在分子內氧化過程中，氧化的脂肪?；糠止敉荒懝檀减シ肿又械哪懝檀蓟糠郑▓D1-19）。

膽固醇酯自動氧化中涉及的自由基反應與膽固醇相同，但兩者的氧化速率存在顯著差異。膽固醇在堿溶液中的氧化速率顯著快于膽固醇酯，但在空氣中或溶解于油中加熱時，膽固醇酯的氧化速率更快。

Osada等（1993）研究發現，膽固醇在不添加甘油三酯的情況下于100℃加熱24h，幾乎不產生膽固醇氧化物，但當它分別與不同飽和度的甘油三酯混合加熱時，發生了不同程度的氧化。當膽固醇與不飽和度低的脂肪混合加熱時，如硬脂酸甘油酯、牛油等，經過長時間加熱才產生膽固醇氧化物；而多不飽和脂肪酸酯存在時，膽固醇的氧化速率明顯加快。因此，膽固醇與不飽和度越高的脂肪共存，越容易發生自動氧化反應。其中，檢測到的膽固醇氧化物主要是7-酮基膽固醇、5β-環氧化膽固醇、5α-環氧化膽固醇，而7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇和膽甾烷三醇含量很低。

2.膽固醇氧化的路徑

Smith（1987）提出的食品中膽固醇氧化的路徑已被普遍接受（圖1-20）。啟動氧化時，其C7位上脫去一個氫，再加上氧后形成了差向異構體：3β-羥膽固醇基-5-烯-7α-氫過氧化物和3β-羥膽固醇基-5-烯-7β-氫過氧化物。脫氫也可能發生在C20和C25位置上，

導致形成3β-羥膽固醇基-5-烯-20α-氫過氧化物和3β-羥膽固醇基-5-烯-25-氫過氧化物。上述變化所形成的氫過氧化物隨后轉變為一系列不同的化合物，食品中常見的膽固醇氧化物有8種，包括7-酮基膽固醇、7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5α，6α-環氧化膽固醇、5β，6β-環氧化膽固醇、膽甾烷-3β，5α，6β-三醇、20-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇。在分析、處理等過程中，某些膽固醇氧化物之間會相互轉化。其中，環氧化膽固醇水解可形成膽甾烷-3β，5α，6β-三醇，7α（β）-羥基膽固醇脫氫形成7-酮基膽固醇。7-酮基膽固醇似乎是一種相當穩定的產物。

（三）膽固醇氧化物的有害作用

醫學研究結果表明，食源性膽固醇氧化物會對健康造成一定損害，血液中膽固醇氧化物濃度的增加是動脈粥狀硬化的早期預警，并可能進一步導致血栓的形成和中風。大多數調查報告顯示，膽固醇氧化物還是強效的細胞死亡誘導劑，會造成細胞凋亡或脹亡，細胞死亡失衡，將會導致許多疾病，特別是癌癥的發生。除此之外，也有研究表明膽固醇氧化物會造成其他疾病的發生，如阿爾茨海默癥、帕金森癥、多發性硬化癥等神經障礙。

1.致動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化的發生與膽固醇及其氧化物有直接的關系。1913年，Anitschkow首次使用溶解在植物油中純膽固醇來喂養兔子，發現會導致兔子動脈粥樣硬化。1969年，Kritchevsky等分別用含結晶膽固醇和無定型膽固醇的飼料喂養家兔，結果發現無定型膽固醇最易導致動脈粥樣硬化的發生，后來證實這些無定型膽固醇中含有膽固醇氧化物。1996年，Brooks等報道了人動脈粥樣斑塊內含有膽固醇氧化物。Berliner等發現膽固醇氧化物能快速地在組織中聚集，尤其是動脈壁中。1999年，Garcia-Cruset等發現動脈粥樣斑塊中7-酮基膽固醇和7β-羥基膽固醇含量很高。20世紀90年代以來，對低密度脂蛋白，特別是對氧化型低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化關系的深入研究，發現氧化型低密度脂蛋白中含有大量的膽固醇氧化物，且其毒性主要來自膽固醇氧化物。此外，大量實驗表明，膽固醇氧化物對動脈粥樣硬化形成有關因素（炎癥、氧化應激、細胞凋亡）具有促進作用。

血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化的啟動環節。Peng等（1985）研究發現，25-羥基膽固醇和膽甾烷-3β，5α，6β-三醇會損害家兔血管內皮細胞。羥基化的膽固醇是膽固醇合成限速酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的抑制劑，因此會抑制膽固醇的生物合成，造成細胞膜功能障礙而導致細胞死亡，細胞死亡使脂質積聚在動脈內膜上，久了容易形成血栓，最終導致動脈粥樣硬化。實驗證明，膽甾烷三醇可引起90%的血管內皮細胞損傷，25-羥基膽固醇可引起67%的血管內皮細胞損傷。

泡沫細胞堆積形成脂質條紋乃至脂質斑塊是動脈粥樣硬化形成的關鍵環節。有研究者在小鼠實驗中發現，一些膽固醇氧化物（7-酮基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5β，6β-環氧化膽固醇）能夠激活巨噬細胞NADPH氧化酶，促進花生四烯酸釋放和超氧陰離子產生，這會導致巨噬細胞介導的低密度脂蛋白氧化增加，從而造成更多泡沫細胞堆積。

2.細胞毒性

研究表明，7-酮基膽固醇、7β-羥基膽固醇等會誘導不同類型的細胞發生細胞凋亡，而25-羥基膽固醇的細胞毒性強弱取決于細胞類型。事實上，一些促進細胞凋亡的膽固醇氧化物會改變生物膜特性和參與信號轉導的脂筏的組成，其中一些還可引起細胞內鈣振蕩，從而影響細胞的正常生理功能。當膽固醇濃度過高時，會引起細胞脹亡，這是一種表現為細胞腫脹和核溶解的細胞損傷過程，細胞脹亡在腫瘤發生、發展過程中具有重要作用。

在不同類型的細胞體外試驗中發現，7-酮基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5α，6α-環氧化膽固醇、5β，6β-環氧化膽固醇、25-羥基膽固醇表現出強烈的氧化作用，有時會引發復雜的細胞凋亡程序。另外，有研究者用含有膽甾烷-3β，5α，6β-三醇的飼料飼喂大鼠，發現其血管平滑肌細胞中的谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性受到了抑制，并且發生細胞凋亡。

細胞間縫隙連接在細胞間物質交換、信息傳遞以及在組織內環境的穩定中起著非常重要的作用，它的功能異常被認為是導致腫瘤發生化學物質毒性作用表現的關鍵一環。研究發現7-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇以及25-羥基膽固醇顯著地抑制細胞間的信息傳遞，其中以后者的作用最為明顯。研究表明純化后的膽固醇氧化物在80μg/mL濃度下對大鼠肝細胞表現出顯著毒性作用。

3.神經毒性

阿爾茨海默癥是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病，特點是大腦中淀粉樣蛋白沉積和神經元廣泛丟失導致的突觸數量減少。目前，關于膽固醇氧化物在阿爾茨海默癥發生過程中的作用是有爭議的。其中，25-羥基膽固醇、27-羥基膽固醇可能與該疾病的發生有關。

帕金森病是一種以多巴胺能神經元喪失和細胞內路易小體存在為特征的漸進性神經系統疾病，一些因素如線粒體功能障礙、細胞凋亡可能是誘發本病的主要原因。研究表明，膽固醇氧化物與α-突觸核蛋白（在路易小體聚集的主要蛋白）之間有一定聯系，Bosco（2006）發現具有路易小體的患者大腦皮層中的膽固醇氧化物代謝產物比同年齡的對照組更高。

多發性硬化癥的特點是脫髓鞘和軸突的損失，這是一種中性神經系統免疫性疾病，可能與膽固醇氧化物有密不可分的聯系。

（四）膽固醇氧化物的測定方法

1.脂質提取

在食品中，膽固醇氧化物溶解在脂類物質中，故提取膽固醇氧化物須先提取與之相溶的脂溶性物質。脂質在生物基質中主要以兩種形式存在：一是以液滴形式存在于儲藏組織；二是細胞膜的組成部分。但任何一種形式下，膽固醇與脂質不僅彼此密切結合，還與非脂質（如蛋白質等）通過疏水作用、范德華力、氫鍵和靜電作用力結合在一起。因此，需要采用合適的方法將組織中的脂溶性化合物提取出來，其中提取溶劑的選擇尤為重要，需要既能夠溶解脂類物質，又能夠破壞脂質與其他組織基質之間的相互作用力。所以單一的非極性有機溶劑（如正己烷）的使用是不合適的，為了滿足這一要求，必須采用適當極性的溶劑或混合物。

在一些研究報道中，使用最頻繁的方法是以2種或者3種溶劑以不同的比例混合來提取脂質，這樣可以充分提取不同脂類物質，同時將其他非脂類物質去除，避免了提取液基質的復雜性。其中，甲醇-氯仿體系經常被用于膽固醇氧化物的提取。

2.凈化

膽固醇氧化物在提取物中是痕量級別，所提取脂類物質中含有甘油三酯、酯化游離甾醇、游離脂肪酸等，所以需要對提取的脂類物質進行凈化操作。一個有效的凈化方法應該能夠去除大部分非待測物質，并且不引入新的雜質，使膽固醇氧化物得到富集。皂化和固相萃取法是常用的凈化方法。

皂化在膽固醇氧化物分析測定中起著兩個重要的作用。首先，它能通過水解反應將甘油酯轉化為水溶性脂肪酸鹽和游離甘油，從而去除脂質提取物中占主導地位的甘油酯。其次，它能夠水解膽固醇酯。在皂化過程中，一般將脂質提取物加入KOH或NaOH的甲醇或乙醇溶液中反應一段時間，然后通過液-液萃取法將未被皂化部分提取出來。皂化溫度和堿溶液濃度是兩個關鍵參數，選擇不當會造成某些膽固醇氧化物的分解。目前多采用冷皂化，即在室溫或略高于室溫下進行皂化，皂化反應多在15h以上。

目前，許多研究者為了避免膽固醇氧化物的分解和轉化，采用固相萃取法取代皂化步驟，使膽固醇氧化物得到分離和富集。相比于皂化法，固相萃取法具有更快速、溫和的優勢。硅膠柱和氨基柱常被用于膽固醇氧化物的凈化，這兩款都為正相柱。脂質提取物中，膽固醇酯和甘油三酯極性最弱，磷脂極性最強，而膽固醇及其氧化產物極性處于兩者之間。因此，根據待測物質與雜質極性的差異，通常逐步增強洗脫溶劑的極性以達到分離效果。較常用的方法是將脂質提取物加入固相萃取柱中，首先選用非極性溶劑洗脫膽固醇酯和甘油三酯，然后再用少量中極性溶劑洗脫膽固醇氧化物，而磷脂由于極性最強被保留在柱上。

有研究表明，在固相萃取之前采用皂化步驟，可避免造成測得膽固醇氧化物含量與實際值相比偏少的情況。已知膽固醇酯的氧化速率比膽固醇更快，可能有部分氧化產物以膽固醇酯的形式存在，因此需要進行皂化反應，將這部分氧化產物分離出來，若直接進行固相萃取，這部分物質將被去除。

3.衍生化

膽固醇氧化物具有高沸點、雙性基團、化學不穩定性的特點，故色譜分析前通常需要進行衍生化反應，改變其物理性狀，有利于色譜分析時分離度的改善和檢測靈敏度的提高。常用衍生試劑有BSTFA[N，O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺]、BTZ[N，O-雙（三甲基硅烷）乙酰胺∶三甲基氯硅烷∶N-三甲基硅烷咪唑為3∶2∶3]、Sylon BFT[N，O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷為99∶1]等。此外，在衍生化過程中需將水分去除干凈，水分會與膽固醇氧化物競爭衍生化試劑，導致衍生化反應不完全，將會使一種膽固醇氧化物出現幾個色譜峰。

4.色譜分析

膽固醇氧化物的測定方法有多種，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法（簡稱氣質聯用法）、核磁共振和酶法等。常用的是氣相色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法。

氣相色譜法特別是毛細管氣相色譜法是膽固醇氧化物的主要分析方法之一，這主要是因為膽固醇形成的氧化物結構十分類似，必須用高分辨率的毛細管柱才能分開。所用柱型大多是非極性的聚甲基硅氧烷和弱極性的5%苯基甲基聚硅氧烷，如DB-5、DB-1、HP-5、Rtx-1、SPB-1等。采用這類非極性和弱極性柱的主要原因是膽固醇氧化物具有較強極性、低蒸汽壓、高沸點，所需柱溫較高，而這類柱子高溫穩定性好是其主要優勢。柱溫操作方式均為程序升溫，且大多為多階程序升溫。氫火焰離子化檢測器（FID）在膽固醇氧化物的氣相色譜分析中仍占絕對優勢。

高效液相色譜法分離效率高，一般在室溫下分析即可，不需高柱溫，因此不會造成待測物質高溫分解的情況，但在檢測膽固醇氧化物方面存在一些缺陷。首先，液相色譜儀所使用的色譜柱的容量和分離效果達不到所需要求；其次，液相色譜儀的紫外或者熒光檢測器不能用于大多數膽固醇氧化物的檢測，因為它們無紫外吸收，更無熒光。

氣質聯用法是將氣相色譜和質譜結合起來的一種用于確定測試樣品中不同物質的定性定量分析方法。氣相色譜-質譜聯用技術兼顧了氣相色譜和質譜兩者各自的優點，其具有氣相色譜的高分辨率和質譜的高靈敏度，是分離和檢測復雜化合物的最有力工具之一。此類方法中，色譜柱的選擇、柱溫升溫程序設置同氣相色譜法相近。質譜部分采用標準的電子轟擊離子源（70eV），質譜掃描范圍多在m/z100～650之間。膽固醇氧化物定量一般根據質譜特征離子峰計算。

五、反式脂肪酸

反式脂肪酸是包含反式雙鍵的一類脂肪酸。反式雙鍵指非共軛雙鍵上兩個相鄰的氫原子處于不同側面。反式脂肪酸已引起各國的關注，其中美國要求食品營養標簽上必須標注反式脂肪酸含量，一些歐盟和亞洲國家也制訂其最低限量標準。

（一）物理化學特性

反式脂肪酸按碳原子數目可分為16碳、18碳和20碳三種，加工食品中以18碳的反式脂肪酸含量較多。反式脂肪酸按照雙鍵數目分為反式單烯酸和反式雙烯酸。按照反式脂肪酸的異構位置分類，18碳的單烯酸可以進一步分為反式9-十八碳烯酸、反式11-十八碳烯酸。

反式脂肪酸的空間結構為直線型，此結構使得其較順式脂肪酸熔點高且具有更好的熱力學穩定性，其性質與飽和脂肪酸接近。反式脂肪酸表現出的一些特性是介于飽和脂肪酸和順式脂肪酸之間的。一般反式脂肪酸的熔點高于順式脂肪酸，如油酸的熔點是13.5℃，室溫下呈液態油狀，而反式油酸的熔點為46.5℃，室溫下呈固態脂狀。

（二）反式脂肪酸形成機制

反式脂肪酸進入食品主要有兩種不同的渠道：一是植物油脂經高溫處理；二是一些動物脂肪中自然存在。但不管哪種渠道，反式脂肪酸都是由不飽和脂肪酸異構化反應而來。

在日常生活中，許多人習慣在烹飪時將油加熱到冒煙，由于油的溫度較高，油脂異構化產生的反式脂肪酸較多，而且一些經過反復煎炸的油，油溫更是遠遠高于發煙點的溫度，會積累較多的反式脂肪酸，而且還會產生其他具有揮發性的醛、酮、醇等化合物，嚴重影響油脂的品質。在高溫條件下發生的不飽和脂肪酸異構化，主要由高于活化能的熱能作用使順式結構發生異構化。

植物油傳統壓榨法或浸出法制取的毛油中含有游離脂肪酸、膠質、色素等雜質，需經精煉過程去除。油脂的脫臭過程在真空、高溫條件下進行，順式脂肪酸在高溫、金屬離子等因素影響經過異構化作用而生成不同類型的反式脂肪酸。在高溫條件下，不飽和脂肪酸中的雙鍵容易被破壞，發生異構化生成反式脂肪酸的同時有一部分發生不飽和鍵斷裂生成短碳鏈的揮發性化合物。不同的脫臭溫度和時間會引起亞油酸和亞麻酸的異構化。

傳統油脂生產過程中通過將油脂部分氫化來改善油脂的品質。在此過程中油脂分子中一部分雙鍵被飽和，另一部分雙鍵發生位置異構或轉變為反式構型，產生反式脂肪酸，主要是n-9反式油酸。

亞油酸和亞麻酸在瘤胃微生物的酶促氫化作用下會產生反式和共軛脂肪酸。在反芻動物進食區域里發現一種異構化酶，它導致了不飽和脂肪酸的順反異構化。通過還原酶的氫化作用反式脂肪酸在反芻動物的瘤胃中產生，并傳遞到乳脂以及自身脂肪當中。

（三）有害作用

1.流行病學調查

（1）對心血管疾病的影響　有確鑿的證據顯示反式脂肪酸與心血管疾病有相關性。反式脂肪酸能引起血清總膽固醇和低密度脂蛋白（LDL）含量的升高，一定程度降低了高密度脂蛋白（HDL）含量，從而促進動脈硬化。

反式脂肪酸能使血液黏稠度和凝聚力增加。當反式脂肪酸的攝入量達到總能量的6%時，人體的全血凝集程度比反式脂肪酸攝入量為2%的人高，更易產生血栓。而血漿總膽固醇和甘油三酯水平升高、載脂蛋白B水平的降低、血液黏稠度的升高都是動脈硬化、冠心病和血栓形成的重要因素。也有一些研究認為，反式脂肪酸與細胞膜磷脂結合，改變了膜脂分布，直接改變膜的流動性和通透性，進而影響膜蛋白結構和離子通道，改變心肌信號傳導的閾值，從而成為導致心肌梗死等疾病發病率增高的重要原因。

（2）對Ⅱ型糖尿病的影響　部分研究結果證實，反式脂肪酸攝入過多會增加婦女患Ⅱ型糖尿病的概率。脂肪總量、飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸的攝入均與糖尿病發病率無關，但攝入的反式脂肪酸能顯著增加患糖尿病的概率。有實驗結果表明，反式脂肪酸能使脂肪細胞對胰島素的敏感性降低，從而增加機體對胰島素的需求量，增大胰腺的負荷，容易誘發Ⅱ型糖尿病。這可能也與反式脂肪酸進入內皮細胞，導致內皮細胞功能障礙，影響與炎癥反應相關的信號傳導有關。反式脂肪酸與Ⅱ型糖尿病的關系需進一步研究。

（3）對嬰兒發育的影響　孕婦和哺乳期婦女攝入的反式脂肪酸可以通過胎盤和乳汁進入嬰幼兒體內，對嬰幼兒生長發育產生不可低估的影響。反式脂肪酸通過影響Δ6-脂肪酸脫氫酶活性，從而使體內多不飽和脂肪酸的生成受到抑制，直接影響嬰兒的正常生長。體內的反式脂肪酸還會干擾正常脂質代謝。反式脂肪酸在合成組織時優先占據細胞膜磷脂的sn-1位，取代飽和脂肪酸；少數的反式脂肪酸會結合在sn-2位與多不飽和脂肪酸形成競爭。反式脂肪酸通過抑制Δ6-脫氫酶和Δ9-脫氫酶的活性抑制體內花生四烯酸和其他多不飽和脂肪酸的合成。

反式脂肪酸對嬰幼兒生長的影響有以下三個方面。

①由于嬰幼兒的生理調節能力較差，反式脂肪酸對多不飽和脂肪酸代謝的干擾會導致胎兒和新生兒體內必需脂肪酸的缺乏，影響生長發育。

②反式脂肪酸還可結合機體組織脂質，特別是結合于腦中脂質，抑制長鏈多不飽和脂肪酸的形成，從而對嬰幼兒的中樞神經系統的發育產生嚴重的影響。

③反式脂肪酸抑制前列腺素的合成，母體中的前列腺素可通過母乳作用于嬰兒，通過調節嬰兒胃酸分泌、平滑肌收縮和血液循環等功能而發揮作用，因此反式脂肪酸可通過對母乳中前列腺素含量的影響而干擾嬰兒的生長發育。

（4）對癌癥發病率的影響　反式脂肪酸與乳腺癌、結腸癌和前列腺癌的發病率有關。流行病學調查結果顯示，增加反式脂肪酸攝入量與患乳腺癌的風險呈顯著正相關。

2.相關法律法規

世界衛生組織和聯合國糧農組織于2003年發表的“膳食、營養與慢性病預防專家委員會報告”指出，為增進心血管健康，應盡量控制飲食中的反式脂肪酸，最大攝取量不超過總能量的1%。許多國家已經頒布反式脂肪酸相關的法律、法規以及建議。美國1999年強制在營養標簽中標示反式脂肪的含量。2003年發布新的增補法規，強制要求在傳統食品及膳食補充劑的營養標簽中標示反式脂肪酸的含量，并最終于2006年實施。丹麥營養委員會多次公布“反式脂肪酸對健康不良影響的報告”，丹麥政府于2003年立法，要求丹麥市場上銷售的食品中反式脂肪酸含量不得高于脂肪含量的2%，這一舉措有效控制了丹麥食品中反式脂肪酸含量。荷蘭及瑞典等國制定食品中人造脂肪的限量標準，其中反式脂肪酸含量控制在5%以下。

我國衛生部2007年發布的《中國居民膳食指南》建議，“遠離反式脂肪酸，盡可能少吃富含氫化油脂的食物”。2013年實施的《預包裝食品營養標簽通則》規定，如食品配料含有或生產過程中使用了氫化和（或）部分氫化油脂，必須在食品標簽的營養成分表中標示反式脂肪酸含量。標準指出，每天攝入反式脂肪酸不應超過2.2g，反式脂肪酸攝入量應少于每日總能量的1%。

根據流行病學研究結果，歐美在反式脂肪酸攝入量上逐漸減少，而發展中國家的反式脂肪酸攝入量則有增加的趨勢。因此，對食品中反式脂肪酸含量實施限量管理勢在必行。

（四）測定方法

國標GB 5009.027—2016《食品安全國家標準食品中反式脂肪酸的測定》中規定檢出限為0.012%（以脂肪計），定量限為0.024%（以脂肪計）。反式脂肪酸的分析方法還包括Ag+技術、紅外吸收光譜法（IR）、毛細管電泳法（CE）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜質譜聯用法（GC-MS）以及結合使用的方法。

六、亞硝胺

N-亞硝胺是一類很強的化學致癌性物質，包括亞硝胺和亞硝酞胺兩大類物質，通常泛稱為亞硝胺，是四大食品污染物之一。亞硝胺可以在人體中合成，是一種很難完全避開的致癌物質。

（一）亞硝胺的種類

N-亞硝胺是世界公認的三大致癌物質之一，其中低分子量的N-亞硝胺在常溫下為黃色油狀液體，高分子量的N-亞硝胺多為固體。二甲基亞硝胺可溶于水及有機溶劑，其他則不能溶于水，只能溶于有機溶劑。在通常情況下，N-亞硝胺不易水解，在中性和堿性環境中較穩定，但在特定條件下也發生水解、加成、還原、氧化等反應。N-亞硝胺是一類化學結構和性質極為多樣化的化合物，依照化學結構可以分為對稱性二烷基亞硝胺、不對稱二烷基亞硝胺、具有功能團的亞硝胺、環狀亞硝胺和烷基（芳基）亞硝酰胺。按照物理性質又有揮發性和非揮發性亞硝胺之分。

（二）亞硝胺的形成機理

亞硝酸鹽是亞硝胺類化合物的前體物質。在自然界，亞硝酸鹽極易和胺類物質化合，生成亞硝胺。在人體胃的酸性環境里，亞硝酸鹽也可以轉化為亞硝胺。亞硝胺的形成是一個復雜的過程，依賴于胺類物質、酰胺類物質、蛋白質、肽類物質和氨基酸的存在。此外，微生物也參與了亞硝胺的形成，把硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，還能把蛋白降解為胺類物質和氨基酸。

（三）亞硝胺的致癌作用

300多種N-亞硝胺在動物身上顯示出致癌作用。這類強致癌物質在實驗動物身上誘導的腫瘤在形態學特點上和與具有血型特異性抗原進行的表達在生化特點上都與相應的人的器官上發現的腫瘤相似，并且更多的試驗和一些流行病學數據表明，人類是N-亞硝胺引起癌癥的易感群體。

亞硝胺是一類重要致癌物質，在體內細胞色素P450的作用下經代謝活化生成活潑親電物質。在細胞色素P450的催化氧化作用下，N-亞硝胺首先發生α羥基化反應，即與N原子緊密相連的碳原子首先發生羥基化，形成α-羥基二烷基亞硝胺，隨后在體內生理環境下分解，變成醛和羥基偶氮化合物，羥基偶氮化合物進一步離解后形成羥基重氮化合物，羥基重氮化合物具有很高的親電性，可以與水反應生成醇，而與DNA結合后，可以使DNA的堿基發生烷化作用形成DNA加合物，最終導致腫瘤的產生。所以在癌癥的初始階段，DNA的烷基化被認為是致癌物質的關鍵性細胞靶向活動。

（四）亞硝胺的測定方法

隨著近代分析化學的發展和新儀器的應用，N-亞硝胺的測定方法己經相當多樣和完善，選擇性和靈敏度也在不斷提高。根據分析方法的原理可以分為紫外和可見光光度法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、極譜法和膠束電動毛細管色譜法（MEKC）。紫外分光光度法可以直接測定N-亞硝胺的含量，N-亞硝胺特征的紫外光譜有兩個吸收峰，在340nm有一個較弱的吸收峰，在230nm處有一個較強的吸收峰。MEKC結合了高效液相色譜和毛細管電泳的優點，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、自動化程度較高的特點，在N-亞硝胺分析中的應用也取得了良好的效果。

七、PM2.5

食品在油炸、燒烤等加工過程中揮發的油脂、有機質及熱氧化和熱裂解產生的混合物形成了食品加工油煙。這些油煙在形態組成上包括顆粒物及氣態污染物兩類，其中直徑小于2.5μm的顆粒物質即為PM2.5。PM2.5粒徑小比表面積大、重量輕、吸附能力強，能吸附各種有害物質且能長時間懸浮于空氣中，被人們吸入直接進入肺部，對人體健康產生較大危害。近年來，PM2.5已成為政府和社會各界關注的熱點問題。

（一）PM2.5來源

PM2.5成分復雜，來源廣泛。如火山噴發、風吹起的塵土、森林大火、工業中的燃料源、汽車尾氣、生物質燃燒、垃圾焚燒、建筑施工揚塵、食品醫藥工業等都會排放PM2.5。本章主要介紹食品加工業及家庭廚房排放的PM2.5。

1.廚房油煙中的PM2.5

日常烹調油的化學結構是三酰甘油，在油炸過程中，食物在約180℃下接觸熱油，油脂揮發凝聚，產生顆粒物，在空氣中呈飄浮狀態而長期存在，屬于典型的PM2.5；同時食物和油脂也部分暴露于氧氣當中，發生氧化反應，形成的氫過氧化物在高溫作用下快速分解，產生揮發性物質，包括飽和與不飽和醛酮類、烴類、醇類、內酯、酸和酯類。其中很多揮發性物質都有毒，如丙烯醛已被確認是油煙中提高肺癌風險的因素之一。油煙中還含有大量的3，4-苯并芘、雜環胺等致癌物質，吸附到PM2.5上，比普通的灰塵更具危害性，被人體吸入后容易引發肺癌、胃癌等疾病。炒菜油炸溫度越高，時間越長，產生的有害物質越多。據統計，在一個800萬人口的城市，全年的廚房油煙顆粒物排放量將近12600t，對PM2.5的貢獻率超過10%。

2.食品工業中的PM2.5

一個規?；氖称芳庸て髽I油炸食品一年用油150～250t，按吸油煙機的油脂去除率90%計算，一年排出顆粒物達15～25t。一個省級城市具規?；挠驼ㄊ称菲髽I按100家計算，一年排放顆粒物就達1500～2500t。普通的油條攤點每天用油約5～10kg，一年排出顆粒物約為180～360kg，一個省級城市油條攤點按5000家計算，一年排放顆粒物就達900～1800t，而油炸油煙中的顆粒物主要為PM2.5。此外，燒烤、煙熏等加工方式均會產生大量的PM2.5。

（1）燒烤產生的PM2.5　燒烤污染物質其實包括兩類，一類是煤炭燃氣燃燒排出的，另一類便是被燒烤物質在烤制過程中排出的。

燒烤主要用的是木炭或焦炭，燒烤過程中處于一個木炭的不完全燃燒的過程，木炭燃燒產物中尚殘存有一氧化碳、二氧化硫、硫氧化物、氫、甲烷等可燃物質，這些氣體在環境中經化學反應或物理過程轉化成液態及固態的顆粒物；燒烤同時會產生烷類、芳烴類、烯類、酯類、醛類等揮發性有機物，而揮發性有機物恰恰是導致PM2.5生成的重要條件。燒烤排出的顆粒物中大部分組成了PM2.5中的物質。

燒烤溫度往往超過200℃，在此高溫下，蛋白質受熱產生雜環胺類物質，而且如果肉被烤焦，局部溫度接近300℃時，食物脂肪焦化產生的物質與肉里的蛋白質發生熱聚合反應，同樣會產生大量3，4-苯并芘等致癌物。3，4-苯并芘不僅能通過烤肉的煙霧進入呼吸道，還能通過食用烤肉進入消化道。燒烤燃燒產生的顆粒物比其他PM2.5要細得多，PM2.5中的粒子越細，表面積就越大，它吸附空氣中的有害物就越多。這種集中、低空排放的高濃度有害氣體，對接觸的人們危害極大。

筆者測定了傳統烤鴨加工過程中生成的煙氣中PM2.5排放情況：燃氣烤鴨爐烤制烤鴨，每批次加工20只，烤鴨爐200℃預熱15min，將腌制后的原料鴨懸掛在烤鴨爐內，在250～270℃條件下烘烤1h左右，用智能中流量大氣總懸浮顆粒物采樣器（配PM2.5采樣切割頭）在100L/min流速條件下收集250℃烤制階段產生的煙氣。按照國標HJ 618—2011環境空氣PM10和PM2.5的測定重量法，得到燃氣加工方式煙氣中PM2.5質量濃度為（2020.00±198.04）μg/m3，超過我國環境空氣質量標準二級限值75μg/m3的25.9倍左右。

（2）油炸產生的PM2.5　油炸過程經歷復雜的物理和化學變化，如油的吸收、氧化、水解和熱分解，產生許多有害成分，影響油炸食品感官，危害身體健康。燒雞是我國的傳統食品，深受消費者喜愛，全國每年產量可達數億只，燒雞加工期間油炸煙氣中的有害物質對環境和人體造成的傷害不可小覷。

為評估燒雞油炸煙氣的安全性和對環境的污染狀況，筆者在南京某肉制品加工企業燒雞生產線油炸工序排煙口外1m處設置采樣點，使用智能中流量大氣總懸浮顆粒物采樣器（配PM2.5采樣切割頭），在100L/min流速條件下收集1h燒雞油炸工序排放的煙氣。

燒雞油炸多使用棕櫚油，加工溫度在180℃以上，每100kg油可加工1000～1400只雞，加工過程中油會多次循環使用，直至油色變黑、油哈味明顯或煙氣有嗆感時更換新油。在采集煙氣的過程中，將使用12～25h的油定義為中期油，將使用30h以上的油定義為后期油。中期油炸煙氣中PM2.5最高超過我國環境空氣質量標準二級限值75μg/m3的23.4倍；繼續使用30h以上煙氣中PM2.5最高超過國標的31.5倍。

（3）煙熏產生的PM2.5　熏制用的熏煙是直接燃燒整塊木頭、小塊木頭或者鋸木碎屑，將待熏制的產品直接懸掛，或者置于金屬網上面進行直接煙熏。熏制時需陰燒不見明火，以最大限度地產生煙。用在食品加工中的熏煙主要是通過燃燒木材所發煙產生的，主要使用的是硬木，如山毛櫸、山核桃木、橡樹。

熏煙是水蒸氣、空氣、CO2、CO，還有數百種的有機物質以不同濃度的氣溶膠、蒸汽相、極小的分子顆粒形式存在的混合物，熏煙是在不完全燃燒的情況下產生的。木材的不完全燃燒產生的顆粒物不但是PM2.5的重要組成成分，而且使產品中含有多環芳烴類等對人類健康有害的物質。

（二）PM2.5的危害

1.PM2.5成分

PM2.5的化學成分主要包括無機成分、有機成分、微量重金屬元素等。無機成分主要包含硫酸鹽、硝酸鹽等；有機成分主要包括多環芳烴；微量重金屬元素包括鉻、銅、鋅、鉛、鎳等。

2.PM2.5對環境的影響

首先，PM2.5對空氣質量和能見度等有重要的影響。與較粗的大氣顆粒物相比，粒徑小的細顆粒物富含大量的有毒、有害物質，且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠，從而對人體健康和大氣環境質量的影響更大。細顆粒物能飄到較遠的地方，影響范圍較大。其次，PM2.5會影響全球的氣候。PM2.5能影響成云和降雨過程，間接影響著氣候變化。PM2.5對太陽的輻射有一定的吸收和反射的作用，從而進一步改變當地的溫度、濕度等氣候條件，形成局部的水循環并導致部分地區的極端天氣，嚴重影響人們的正常生活。

3.PM2.5對人類健康的危害

PM2.5比表面積較大，易成為其他污染物的載體和反應體，可吸附大量的有毒、有害物質，通過呼吸系統直接進入人的肺部并沉積下來，導致人體呼吸系統和心血管系統等罹患各種急性和慢性疾病。