實驗二十二　有機物質紙色譜與薄層色譜

色譜法（又稱層析法）是一種物理的分離方法。色譜法有兩個相：一個固定相和一個流動相，因為流動相的流動以及各成分在兩相中的溶解和吸附性質的差別而得到分離。按分離方法，色譜法可分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法和液相色譜法。

紙色譜法是以紙為載體，以紙上所含水分或其它物質為固定相，用展開劑展開的分配色譜。按照操作，分上行法和下行法兩種。薄層色譜法是以玻璃板、塑料板或鋁基片為載體，在載體上涂布均勻的固定相，把要分析或分離的樣品點在薄層板上，用展開劑展開，再用顯色劑顯色的分配色譜。將要分離的混合物點在色譜帶或用固定相均勻涂布在薄層板上，用適當的展開劑在密閉的層析缸中展開，被分離的組分隨展開劑流動而選擇性地分離在原點和溶劑前沿之間，記錄原點至樣品點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值（Rf）：

每種化合物都有自己特定的比移值。因為同一物質在相同的實驗條件下才具有相同的Rf值，所以在利用色譜分離與鑒定各種化合物時，為了得到重復和較可靠的結果，必須嚴格控制條件，如吸附劑和展開劑的種類、層析溫度等；在測定時，最好用標準物質進行對照。

紙色譜也可用于有機物的分離、鑒定和定量測定。它特別適用于多官能團或極性大的化合物的分析，例如碳水化合物、氨基酸和天然色素等，只要紙的質量、展開劑和溫度等條件相同，比移值（Rf值）對于每種化合物都是一個特定的值，可作為各組分的定性指標。實際上，由于影響比移值的因素很多，實驗數據與文獻記載的不完全相同，因此在測定時要與標準樣品對照才能斷定是否為同一物質。紙色譜的缺點是溶劑的展開所需的時間長，操作不如薄層色譜方便。薄層色譜主要用于：①作為柱色譜的先導；②監控反應進程；③檢測其它分離純化過程；④確定混合物中的組分數目；⑤確定兩個或多個樣品是否為同一物質；⑥根據薄層板上各組分斑點的相對濃度可粗略地判斷各組分的相對含量；⑦迅速分離出少量純凈樣品。

一、紙色譜

【實驗目的】

1.理解紙色譜法的原理。

2.掌握紙色譜的基本操作。

3.學會用紙色譜法鑒定蛋白質水解液的主要氨基酸組分。

【儀器與試劑】

1.儀器　1號濾紙、鉛筆、尺、點樣毛細管、移液管（10mL）、帶蓋的廣口瓶或用保鮮薄膜封口的燒杯（200mL）、回形針或訂書釘、鑷子、噴霧器、烘箱或電爐、鐵架臺、鐵圈、試管。

2.試劑　各種標準氨基酸［天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和精氨酸（Arg）］、苯酚（80%）、茚三酮乙醇溶液（0.25%）。

【實驗步驟】

1.色譜紙的準備

取一張20cm×10cm的長方形1號濾紙（只能握此濾紙的頂部邊緣），置于一張清潔的紙巾或練習本紙上，放置時“×”要在右上角。

從濾紙的兩個下角各剪去一塊邊長為1cm的方塊。距紙底約1.5cm處用鉛筆（勿用鋼筆或圓珠筆）畫一直線。沿此線用鉛筆標出十個間距均勻的點，第一個點距左側3cm。在實驗記錄本中記下點樣順序，把姓名寫在色譜圖的右上角（見圖3-10）。

2.點樣

用毛細管取1mm長度的樣品液，點在標記處，斑點大小為1～2mm。

在點實際的色譜圖之前，可先在前面剪下的濾紙上練習點樣技術。然后，用點樣管分別把每個樣品點在原點上，讓這些點完全風干后，再在同一點上點第二次。水解產物應點三次。展開之前必須讓各樣品點完全干燥。

點樣順序為（從左到右）：天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、頭發蛋白水解液、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和精氨酸（Arg）。

3.展開

用移液管吸取適量80%苯酚到200mL帶蓋的廣口瓶或用保鮮薄膜封口的200mL燒杯中。移入時要小心，不要濺到瓶壁。將濾紙卷成一個大圓筒，使滴點線在底部且在筒的內面，濾紙頂部重疊0.5cm并一定要保證底邊平齊，用回形針夾起來或用訂書釘釘在一起。把圓筒塞入展開室內，使紙的底端浸沒于展開劑中，蓋上塞子，待溶劑展開至離濾紙頂端邊緣0.5cm處時，取出色譜紙（勿用手指），并立即用鉛筆標出溶劑前沿。注意展開時不要移動展開室。

4.顯色

待色譜紙溶劑風干后，用噴霧器均勻地噴灑0.25%茚三酮乙醇溶液于濾紙上，然后置濾紙于110℃烘箱中烘5min顯色，或用小火烘至斑點出現。

【數據處理與結論】

用鉛筆畫出所有斑點的輪廓，量出每個樣品從原點到斑點的距離及到溶劑前沿的距離，計算每個樣品的Rf值。對照標準氨基酸的Rf值確定頭發蛋白水解產物的主要氨基酸組成。記錄實驗結果。

【注意事項】

1.“×”在裁紙時就應標在長方形色譜紙上。由于紙的厚度略為有些不均勻，這樣做記號的目的是確保學生用的每張色譜紙上的溶劑流向都一樣，使Rf值更有重復性。

2.每10mL這些0.1mol·L-1標準氨基酸溶液用10滴6mol·L-1鹽酸加以酸化。

3. 80%苯酚由20mL水與80g苯酚混合而成。將此混合物加熱，直至苯酚完全溶解。加入一層石油英（石油醚）保護層可使空氣與苯酚水溶液隔絕。若不加石油英，就應盡快使用此溶液。

4.拿時如不加留心，指印會同顯色的斑點一起在色譜圖上顯出。

5.剪下的濾紙可留做點樣練習之用。

6.點樣時斑點要點得愈小愈好，點好的斑點直徑應小于2mm，并且不能過量。否則會造成展開后的斑點拖尾或相互覆蓋。

7.苯酚接觸皮膚會引起灼傷。若不小心弄到皮膚上，應立即用水和肥皂洗滌。

【思考題】

1.為什么可用縮二脲反應檢驗蛋白質水解是否完全？

2.為什么可用茚三酮作為氨基酸的顯色劑？

二、薄層色譜

【實驗目的】

1.了解薄層色譜的原理。

2.掌握薄層色譜的操作技術。

【實驗原理】

1.薄層板

薄層色譜所用的基板通常為玻璃板，也有用塑料板的，根據用途的不同而有不同的規格。作分析鑒定用的多為7.5cm×2.5cm的載玻片。若為分離少量純樣品，可將普通玻璃板裁成20cm×15cm的大小，將棱角用砂紙稍加打磨，以免割破手指，然后洗凈干燥即可使用。近年來，有些廠商將吸附劑涂在大張金屬箔片上出售。購回后只需用剪刀剪成合適大小即可點樣展開。用完后可用適當溶劑將箔片上樣點浸萃掉，經干燥后即可重復使用，但吸附劑涂層很薄，一般只可作分析鑒定用。

2.層析缸

展開槽也叫層析缸，規格形式不一。圖3-11繪出了其中的幾種，圖（a）為立式，（b）為臥式，（c）和（d）為斜靠式，（e）為下行式，（f）為制備純樣品所用的大型展開槽，亦為斜靠式。（a），（b），（c），（d），（f）統稱上行式。

3.吸附劑

薄層色譜中所用吸附劑最常見的有硅膠和氧化鋁兩類。其中不加任何添加劑的以H表示，如硅膠H、氧化鋁H；加有煅石膏（CaSO4·1/2H2O）為黏合劑的用G表示（gypsum），如硅膠G、氧化鋁G；加有熒光素的用F表示（fluorescein），如硅膠HF254，意思是其中所加熒光素可在波長254nm的紫外線下激發熒光；同時加有煅石膏和熒光素的用GF表示，如硅膠GF254、氧化鋁GF254 。如在制板時以羧甲基纖維素鈉的溶液調和，則用CMC表示（carboxymethyl cellulose），如硅膠CMC。添加黏合劑是為了加強薄層板的機械強度，其中以添加CMC者機械強度最高；添加熒光素是為了顯色的方便。習慣上把加有黏合劑的薄層板稱為硬板，不加黏合劑的薄層板稱為軟板。

供薄層色譜用的吸附劑粒度較小，通常為200目，標簽上有專門說明，如Silicagel H for thin layer chromatography，使用時應予注意，不可用柱色譜吸附劑代替，也不可混用。

薄層色譜用的氧化鋁也有酸性、中性、堿性之分，還分五個活性等級。選擇原則主要由被分離物質的性質決定。

4.展開劑

在薄層色譜中用作流動相的溶劑稱為展開劑，它相當于柱色譜中的淋洗劑，其選擇原則也與淋洗劑類同，也是由被分離物質的極性決定的，被分離物極性小，選用極性較小的展開劑；被分離物極性大，選用極性較大的展開劑。環己烷和石油醚是最常使用的非極性展開劑，適合于非極性或弱極性試樣；乙酸乙酯、丙酮或甲醇適合于分離極性較強的試樣，氯仿和苯是中等極性的展開劑，可用作多官能團化合物的分離和鑒定。若單一展開劑不能很好分離，也可采用不同比例的混合溶劑展開。

選擇展開劑的一條快捷的途徑是在同一塊薄層板上點上被分離樣品的幾個樣點，各樣點間至少相距1cm，再用滴管分別汲取不同的溶劑，各自點在一個樣點上，溶劑將從樣點向外擴展，形成一些同心的圓環。若樣點基本上不隨溶劑移動［見圖3-12（a）］，或一直隨溶劑移動到前沿［見圖3-12（d）］，這樣的溶劑則不適用。若樣點隨溶劑移動適當距離，形成較寬的環帶［見圖3-12（b）］，或形成幾個不同的環帶［見圖3-12（c）］，則該溶劑一般可作為展開劑使用。

【儀器與試劑】

1.薄層板制備

也稱鋪板或鋪層，有“干法”和“濕法”兩種，由于干燥的吸附劑在玻璃板上附著力差，容易脫落，不便操作，所以很少采用，此處只介紹濕法鋪板。

（1）供分析、鑒定、監控用的載玻片的鋪制　首先將吸附劑用溶劑調成糊狀，所用溶劑可以是低沸點有機溶劑，也可以是蒸餾水。有機溶劑中應用較廣的是氯仿，一般按照每克硅膠3mL氯仿的比例在廣口瓶中調成糊狀，立即以帶螺旋的蓋子蓋緊備用。在鋪板時用力搖勻，旋開蓋子，將兩塊載玻片疊在一起，以食指和拇指捏住它們的側面靠近一端處，緩慢平穩地浸入瓶中的糊狀吸附劑里，使糊狀物浸沒至離載玻片頂端約1cm處，然后緩緩提起（圖3-13），在空氣中握持片刻，使氯仿大部分揮發掉。將兩塊載玻片拆開，浸涂面向上，平放在桌上，干燥后即可使用。每次浸涂后應立即將廣口瓶蓋緊密封，以免溶劑揮發。這樣制得的薄層板力學性能稍差。為了提高薄層強度，可用甲醇代替氯仿，或將甲醇與氯仿按不同的比例混合使用。

以蒸餾水作溶劑時，首先將待鋪的載玻片平放在水平臺面上，將吸附劑置于干凈研缽內，按照每克硅膠G 2～3mL蒸餾水（或3～4mL羧甲基纖維素鈉溶液），或每克氧化鋁1～2mL蒸餾水的比例加入溶劑，立即研磨成糊狀。用牛角匙舀取糊狀物倒在載玻片上迅速攤布均勻，也可輕敲載玻片邊緣，或將載玻片托在手中前后左右稍稍傾斜，靠糊狀物的流動性使之分布均勻。然后再平放在臺面上，使其固化定型并晾干。固化的過程是吸附劑內的煅石膏吸收水形成新固體的過程，反應式為：

研磨糊狀物和涂鋪薄層板都需盡可能迅速。若動作稍慢，糊狀物即會結成團塊狀無法涂鋪或不能涂鋪均勻，即使再加水也不能再調成均勻的糊狀。通常研磨糊狀物需在1min左右完成，鋪完全部載玻片也只需數分鐘，最多在十幾分鐘內完成。每次鋪板都需臨時研磨糊狀物。以蒸餾水作溶劑制得的薄層板具有較好的力學性能，如欲獲得力學性能更好的薄層板，可用1%的羧甲基纖維素鈉水溶液來調制糊狀物。將1g羧甲基纖維素鈉加在100mL蒸餾水中，煮沸使充分溶解，然后用砂芯漏斗過濾。用所得濾液如前述方法調糊鋪板，這樣的薄層板具有足夠的力學性能，可以用鉛筆在上面寫字或作其它記號，但需注意在活化時嚴格控制烘焙溫度，以免溫度過高引起纖維素炭化而使薄層變黑。

（2）涂布器制板法　圖3-14為薄層涂布器。將幾塊玻璃板放在涂布器中間擺好，兩邊是兩塊比前者約厚0.5mm的玻璃板，向涂布器槽中倒入預先調好的糊狀吸附劑，將涂布器自左向右推去即能將糊狀物均勻地涂在玻璃板上。待晾干定型之后，將幾塊玻璃板分開，刮去邊上多余的吸附劑即得到一定厚度的薄層色譜板。

（3）較大薄層板的鋪制　供分離純化用的薄層板具有較大的尺寸，通常都是用蒸餾水來調制糊狀物的，方法同前。鋪板的方法如下。

①傾注法　將玻璃板平放在臺面上，把研好的糊狀物迅速傾倒在玻璃板上，用干凈玻璃棒攤平，或手托玻璃板微微傾斜，并輕輕敲擊玻璃板背面，使之流動，即可獲得平整均勻的薄層。

②刮平法　將待鋪玻璃板平放在臺面上，在其長條方向的兩邊各放一條比玻璃板厚1mm的玻璃板條。將調好的糊狀物倒在中間的玻璃板上，用一根有機玻璃尺將糊狀物沿一個方向刮平，即形成厚1mm的均勻薄層。待固化定型后抽去兩邊的玻璃板條即可。

不管以何種方法鋪板，都要求鋪得的薄層厚薄均一，沒有紋路，沒有團塊凸起。紋路或團塊的產生原因是糊狀物調得不均勻，或鋪制太慢，或在局部固化的板子上又加入新的糊狀物，所以為獲得均勻的薄層，應動作迅速，一次研勻，一次傾倒，一次鋪成。

2.活化

將晾干后的薄層板移入烘箱內“活化”。活化的溫度因吸附劑不同而不同。硅膠薄層板在105～110℃烘焙0.5～1h即可；氧化鋁薄層板在200～220℃烘焙4h，其活性約為Ⅱ級，若在150～160℃烘焙4h，活性相當于Ⅲ～Ⅳ級。活化后的薄層板就在烘箱內自然冷卻至接近室溫，取出后立即放入干燥器內備用。

3.點樣

固體樣品通常溶解在合適的溶劑中配成1%～5%的溶液，用內徑小于1mm的平口毛細管吸取樣品溶液點樣。點樣前可用鉛筆在距薄層板一端約1cm處輕輕地畫一條水平橫線作為“起始線”。然后將樣品溶液小心地點在“起始線”上。樣品斑點的直徑一般不應超過2mm。如果樣品溶液太稀需要重復點樣時，需待前一次點樣的溶劑揮發之后再點樣。點樣時毛細管的下端應輕輕接觸吸附劑層。如果用力過猛，會將吸附劑層戳成一個孔，影響吸附劑層的毛細作用，從而影響樣品的Rf值。若在同一塊板上點兩個以上樣點時，樣點之間的距離不應小于1cm。點樣后待樣點上溶劑揮發干凈才能放入展開槽中展開。

4.展開

展開劑帶動樣點在薄層板上移動的過程叫展開。展開過程是在充滿展開劑蒸氣的密閉的展開槽中進行的。展開的方式有直立式、臥式、斜靠式、下行式、雙向式等。

直立式展開是在立式展開槽中進行的，如圖3-11（a）所示。先在展開槽中裝入深約0.5cm的展開劑，蓋上蓋子放置片刻，使蒸氣充滿展開槽，然后將點好樣的薄層板小心地放入其中，使點樣端向下（注意展開劑不可浸及樣點），蓋好蓋子。由于吸附劑的毛細作用，展開劑緩緩向上爬升。如果展開劑選得合適，樣點也隨之展開。當展開劑前沿升至距薄層板上端約1cm處時取出薄層板并立即標記出前沿位置。分別測量各樣點中心及前沿到起始線的距離，計算各組分的比移值。如果樣品中各組分的比移值都較小，則應該換用極性大一些的展開劑；反之，如果各組分的比移值都較大，則應換用極性小一些的展開劑。每次更換溶劑，必須等展開槽中前一次的溶劑揮發干凈后，再加入新的溶劑。更換溶劑后，必須更換薄層板并重新點樣、展開，重復整個操作過程。直立式展開只適合于硬板。

臥式展開如圖3-11（b）所示，薄層板傾斜15°放置，點樣端向下，涂層向上，操作方法同直立式，只是展開槽中所放的展開劑應更淺一些。臥式展開既適用于硬板，也適用于軟板。

斜靠式展開如圖3-11（c）、圖3-11（d）、圖3-11（f）所示，薄層板的傾斜角度在30°～90°，一般也只適合于硬板。

下行式展開如圖3-11（e）所示。薄層板豎直懸掛在展開槽中，一根濾紙條或紗布條搭在展開劑和色譜板上沿，靠毛細作用引導展開劑自板的上端向下展開。此法適合于比移值較小的化合物。

雙向式展開是采用方形玻璃板鋪制薄層，樣品點在角上，先向一個方向展開，然后轉動90°再換一種展開劑向另一方向展開。此法適合于成分復雜或較難分離的混合物樣品。

用于分離的大塊薄層板，是在起點線上將樣液點成一條線，使用足夠大的展開槽展開，如圖3-11（f）所示，展開后成為帶狀，用不銹鋼鏟將各色帶刮下分別萃取，各自蒸去溶劑，即可得到各組分的純品。

若無展開槽，可用帶有螺旋蓋的廣口瓶代替，如圖3-11（c）所示。若展開槽較大，則應預先在其中放入濾紙襯里，如圖3-11（c），圖3-11（d），圖3-11（f）所示。襯里的作用是使展開劑沿襯里上升并揮發，使展開劑蒸氣迅速充滿展開槽。

5.顯色

分離和鑒定無色物質，必須先經過顯色，才能觀察到斑點的位置，判斷分離情況。常用的顯色方法有如下幾種。

（1）碘蒸氣顯色法　由于碘能與很多有機化合物（烷烴和氯代烴除外）可逆地結合形成有顏色的配合物，所以先將幾粒碘的晶體置于廣口的密閉容器中，碘蒸氣很快地充滿容器，再將展開后的薄層板（溶劑已揮發干凈）放入其中并密閉起來，有機化合物即與碘作用而呈現出棕色的斑點。取出薄層板后應立即標記出斑點的位置和形狀（因為碘易揮發，斑點的棕色在空氣中很快就會消失）。

（2）紫外線顯色法　如果被分離（或分析）的樣品本身是熒光物質，可在暗處在紫外燈下觀察到它的光亮的斑點。如果樣品并無熒光性，可以選用加有熒光劑的吸附劑來制備薄層板，或在制板時加入適量熒光劑，或在制好的薄層板上用噴霧法噴灑熒光劑以制取熒光薄層板。熒光薄層板經點樣、展開后取出，標記好前沿，待溶劑揮發干后放在紫外燈下觀察。有機化合物在光亮的背景上呈現暗紅色斑點。

（3）試劑顯色法　除了上述顯色法之外，還可以根據被分離（分析）化合物的性質，采用不同的試劑進行顯色。操作時，先將薄層板展開，風干，然后用噴霧器將顯色劑直接噴到薄層板上，被分開的有機物組分便呈現出不同顏色的斑點。

6.計算比移值

及時標記出斑點的形狀和位置，特別是對碘蒸氣顯色法，因為碘易揮發，斑點的棕色在空氣中很快就會消失，計算比移值Rf。

本實驗用薄層色譜法分離偶氮苯的兩種幾何異構體。偶氮苯有順反兩種異構體，多種情況下以反式形式存在，但在日光或紫外線照射下，反式可以部分轉化成順式。

【實驗步驟】

1.將 0.1g 反式偶氮苯溶于 5mL無水苯中，溶液分成兩份置于小試管中，不用時旋緊試管蓋。將一個試管置于日光下照射1h，或用紫外燈（波長為 365nm）照射0.5h，使部分反式偶氮苯轉化為順式偶氮苯；另一個試管用黑紙包起來以免受到陽光的照射。

2.將10mL環己烷/甲苯（體積比為3∶1）加入層析缸中，在 2.5cm×7.0cm 的硅膠板上離底邊1cm處用鉛筆畫一條直線。用一根干凈的毛細管吸取被日光或紫外線照射過的偶氮苯溶液，在薄層板的鉛筆線上距左側0.7cm處點樣。另取一支干凈的毛細管吸取未被日光或紫外線照射過的偶氮苯溶液，在薄層板的鉛筆線上距右側0.7cm 處點樣。

3.將點好樣的薄層板放入層析缸中，層析缸用黑紙包起來。薄層板展開至溶劑前沿離頂部約1cm時結束。

4.取出薄層板，在溶劑揮發前迅速將溶劑前沿標出，然后讓溶劑揮發至干。

5.將觀察到薄層板的右側只有一個樣品點，而薄層板的左側有兩個樣品點，分別量出展開劑、順式偶氮苯和反式偶氮苯的爬移距離。

【數據處理與結論】

計算反式和順式偶氮苯的Rf 值。

【注意事項】

1.層析缸市場上可以買到。層析缸中的溶劑一般為2～3mm高。可用小燒杯蓋上玻璃板代替。

2.薄層板市場上可以買到。一般是在玻璃板上涂布了硅膠，尺寸為7.5cm×2.5cm。

【思考題】

1.薄層色譜有哪些用途？

2.影響薄層色譜效果的因素有哪些？