3.5　定性與定量分析方法

3.5.1　定性方法

利用紫外光譜對有機化合物進行定性鑒別的主要依據是吸收光譜的形狀，吸收峰的數目，各吸收峰的波長、強度和相應的吸收系數等。通常采用比較的方法進行鑒別，即將測定樣品與對照品的紫外光譜進行對照、比較；也可以將測定樣品與文獻所載的紫外標準圖譜進行比較。

（1）比較吸收光譜

兩個化合物如果相同，則其吸收光譜應完全一致?？蓪⒃嚇优c對照品用同樣的方法配制成相同濃度的溶液，分別測定其吸收光譜，然后比較光譜圖是否完全一致，從而加以判斷。

例如醋酸可的松、醋酸氫化可的松與醋酸潑尼松的λmax（240nm）、ε值（1.57×104）與值（390），幾乎完全相同，但從它們的吸收曲線（圖3-19）上可以看出某些差別，據此可以得到鑒別。

（2）比較吸收光譜的特征數據

最常用于鑒別的光譜特征數據是吸收峰所在的波長λmax。若一個化合物中有幾個吸收峰，并存在吸收谷或肩峰，可同時作為鑒定依據。

具有不同或相同發色團與助色團的不同化合物，可能具有相同的λmax值。但由于它們的分子量不同，所以ε或存在著差別，可以作為鑒別的依據。

例如安宮黃體酮（M=386.5）和炔諾酮（M=298.4）

安宮黃體酮（M=386.5）　　　　　　　　炔諾酮（M=298.4）

λmax=（240±1）nm，　　　　　　　　 λmax=（240±1）nm，=571

（3）比較吸光度比值

有些化合物不只一個吸收峰，可用在不同吸收峰（或峰與谷）處測得吸光度的比值A1/A2或ε1/ε2作為鑒別的依據。

例如《中華人民共和國藥典》（2015年版）對維生素B12采用下述方法鑒別：將檢品按規定方法配成25μg/mL的溶液，分別測定278nm、361nm和550nm處的吸光度A1、A2和A3，A2/A1應為1.70～1.88；A2/A3應為3.15～3.45。

3.5.2　單組分定量方法

常用的單組分定量分析方法有標準曲線法、標準對照法、吸收系數法等。

（1）標準曲線法

標準曲線法又稱工作曲線法或校正曲線法。本法在藥物分析中應用廣泛，簡便易行，而且對儀器精度的要求不高。

首先配制一系列不同濃度的標準溶液，在相同條件下分別測定吸光度。以濃度為橫坐標、相應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3-20所示，計算吸光度與濃度的回歸方程。然后在相同的條件下測定供試液的吸光度，從標準曲線或回歸方程中求出被測組分的濃度。制備一條標準曲線至少需要5～7個點，并不得隨意延長；待測液濃度必須包括在標準曲線濃度范圍內，否則應進行適當調整；供試品溶液和對照品溶液必須在相同的操作條件下進行測定。理想的標準曲線應該是一條通過原點的直線。實際上，有的標準曲線可能不通過原點。其原因主要包括空白溶液的選擇不當、顯色反應的靈敏度不夠、吸收池的光學性能不一致等幾方面，應當采取適當措施加以改善。

（2）標準對照法

在相同條件下配制對照品溶液和供試品溶液，在選定波長處，分別測定其吸光度，根據Beer定律計算供試品溶液中被測組分的濃度。

計算公式為

A標=Elc標

A樣=Elc樣

因對照品溶液和供試品溶液是同種物質，兩者在同臺儀器及同一波長處且于厚度相同的吸收池中進行測定，故a和b均相等，所以

　?。?-10）

　　（3-11）

標準對照法應用的前提是制備的標準曲線應通過原點。

（3）吸收系數法

根據Beer定律A=Elc，若l和吸收系數已知，且大于100，即可根據供試品溶液測得的A值求出被測組分的濃度。

　?。?-12）

【例1】　維生素B12的水溶液在361nm處的值是207，盛于1cm吸收池中，測得溶液的吸光度為0.457，則溶液濃度為：

c=0.457/（207×1）=0.002g/100mL

應注意計算結果是100mL中所含質量（g），這是由百分吸收系數的定義所決定的。

通常可以從手冊、文獻或藥典中查到；也可將供試品溶液吸光度換算成樣品的百分吸收系數，然后與純品（對照品）的吸收系數相比較，求算樣品中被測組分含量。

【例2】　維生素B12樣品25.0mg用水溶成1000mL后，盛于1cm吸收池中，在361nm處測得吸光度A為0.516，則：

3.5.3　多組分定量方法

若樣品中有兩種或兩種以上的組分共存時，可根據吸收光譜相互重疊的情況分別采用不同的測定方法。最簡單的情況是各組分的吸收峰不重疊，如圖3-21（a）所示。我們可按單組分的測定方法分別在λ1處測a組分的濃度，在λ2處測b組分的濃度。

第二種情況是a、b兩組分的吸收光譜有部分重疊，如圖3-21（b）所示。在a組分的吸收峰λ1處b組分沒有吸收，而在b組分的吸收峰λ2處a組分有吸收?？上仍?span id="cmp46et" class="italic">λ1處按單組分測定法測出混合物中a組分的濃度ca，然后在λ2處測得混合物的吸光度，最后根據吸光度的加和性原理計算出b組分的濃度cb。

　?。?-13）

在混合物的測定中最常見的情況是各組分的吸收光譜間相互重疊，如圖3-21（c）所示。原則上，根據吸光度具有加和性的原理，只要各組分的吸收光譜有一定的差異，都可以設法進行測定。特別是近年來計算分光光度法的推廣運用及計算機技術的普及，各種測定新技術不斷出現，為藥物分析提供了行之有效的測試手段和方法。下面介紹幾種已在藥物及其制劑含量測定方面得到廣泛應用的方法。

①解線性方程組法　吸收光譜相互重疊的兩組分，若事先測出λ1與λ2處兩組分各自的吸收系數E或ε，再在兩波長處分別測得混合溶液吸光度與，當b為1cm時，即可通過解線性方程組法計算出兩組分的濃度，如圖3-21（c）所示。

　?。?-14）

　　（3-15）

解得

　　（3-16）

　?。?-17）

采用這種方法進行定量分析時，要求兩個組分濃度宜相近，否則誤差較大。

②雙波長分光光度法　吸收光譜重疊的a、b兩組分混合物中，若要消除b組分的干擾以測定a組分，可從干擾b組分的吸收光譜上選擇兩個吸光度相等的波長λ1和λ2，然后測定混合物的吸光度差值，最后根據ΔA值來計算a組分的含量。

　?。?-18）

等吸收點法的關鍵之處是兩個測定波長的選擇，其原則是必須符合以下兩個基本條件：①干擾組分b在這兩個波長處應具有相同的吸光度，即ΔAb=-=0；②被測組分在這兩個波長處的吸光度差值ΔAa應足夠大。下面用作圖法說明兩個波長的選定方法。如圖3-22所示，a為待測組分，可以選擇組分a的最大吸收波長作為測定波長λ2，在這一波長位置作x坐標軸的垂線，此直線與干擾組分b的吸收光譜相交于某一點，再從這一點作一條平行于x坐標軸的直線，此直線可與干擾組分b的吸收光譜相交于一點或數點，則選擇與這些交點相對應的波長作為參比波長λ1。當λ1有若干波長可供選擇時，應當選擇使待測組分的ΔA盡可能大的波長。若待測組分的最大吸收波長不適合作為測定波長λ2，也可以選擇吸收光譜上其他波長，關鍵是要能滿足上述兩個基本條件。

根據式（3-18）被測組分a在兩波長處的ΔA值愈大愈有利于測定。同樣方法可消去a組分的干擾，測定b組分的含量。

多組分定量方法還有：三波長分光光度法、差示分光光度法、導數分光光度法、薄層掃描紫外光譜法、光聲光譜法、熱透鏡光譜分析法、催化動力學分光光度法、速差動力學分光光度法、流動注射分光光度法以及化學計量學輔助的紫外分光光度法等，這些方法大都可用于藥物分析的含量測定之中。計算機技術、化學信息學的發展，大大加快了分光光度法的發展，使得分光光度法成為一種快速、準確、可靠的多組分混合物分析方法。