第二節　豆類與油料作物檢驗技術

一、大豆蛋白質含量的測定（GB 5009.5—2016）

凱氏法一直被作為蛋白質定量的標準方法。該法是1883年由丹麥化學家凱道爾（Johan’ Kiedahl）創立的，它可用于所有動物性食品、植物性食品的蛋白質含量測定，但因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物，故通常將測定結果稱為粗蛋白質含量。該法具有很高的準確度和精密度，因此在食品分析、飼料分析、糧食品質分析及種子品質鑒定和生化研究工作中得到廣泛應用。

1.適用范圍

適用于油料粗蛋白質的測定，也是各種農產品與食品樣品蛋白質定量分析的標準方法。

2.測定原理

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量計算氮含量，再乘以換算系數，即為蛋白質的含量。

3.儀器和設備

凱氏定氮消化與蒸餾裝置見圖3-1，自動凱氏定氮儀、天平感量為1mg。

4.試劑與配制

（1）試劑

硫酸銅；硫酸鉀；硫酸；硼酸；甲基紅指示劑；溴甲酚綠指示劑；亞甲基藍指示劑；氫氧化鈉；乙醇。

（2）試劑配制

硼酸溶液（20g/L）：稱取20g硼酸，加水溶解并稀釋至1000mL。

氫氧化鈉溶液（400g/L）：稱取40g氫氧化鈉加水溶解后，放冷，稀釋至100mL。

硫酸標準滴定溶液c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L或鹽酸標準滴定溶液c（HCl）=0.0500mol/L。

甲基紅乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。

亞甲基藍乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g亞甲基藍，溶于9 5%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。

溴甲酚綠乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。

A混合指示液：2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍乙醇溶液臨用時混合。

B混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。

5.操作步驟

（1）凱氏定氮法

①試樣處理。稱取充分混勻的固體試樣0.2～2g、半固體試樣2～5g或液體試樣10～25g（約相當于30～40mg氮），精確至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45℃角斜支于有小孔的石棉網上。小心加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續加熱0.5～1h。取下放冷，小心加入20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。

②測定。按圖3-1裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發生器內裝水至2/3處，加入數粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發生器內的水并保持沸騰。

③向接受瓶內加入10.0mL硼酸溶液，1～2滴A混合指示劑或B混合指示劑，并使冷凝管的下端插入液面下，根據試樣中氮含量，準確吸取2.0～10.0mL試樣處理液，由小玻璃杯注入反應室，以10mL水洗滌小玻璃杯并使之流入反應室內，隨后塞緊棒狀玻璃塞。將10.0mL氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩緩流入反應室，立即將玻璃塞蓋緊，并水封。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾10min后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。盡快以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定至終點，如用A混合指示液，終點顏色為灰藍色；如用B混合指示液，終點顏色為淺灰紅色。同時做試劑空白。

（2）自動凱氏定氮儀法

稱取充分混勻的固體試樣0.2～2g、半固體試樣2～5g或液體試樣10～25g（約相當于30～40mg氮），精確至0.001g，置于消化管中，再加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL硫酸于消化爐進行消化。當消化爐溫度達到420℃之后，繼續消化1h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加50mL水，于自動凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液，鹽酸或硫酸標準溶液以及含有混合指示劑A或B的硼酸溶液）上實現自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據的過程。

6.結果計算

試樣中蛋白質的含量按式（3-1）計算：

　　（3-1）

式中　X——試樣中蛋白質的含量，g/100g；

V1——試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL；

V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL；

c——硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L；

0.0140——1.0mL硫酸［c（1/2H2SO4）=1.000mol/L］或鹽酸［c（HCl）=1.000mol/L］標準滴定溶液相當的氮的質量，g；

m——試樣的質量，g；

V3——吸取消化液的體積，mL；

F——氮換算為蛋白質的系數，大豆為5.71；

100——換算系數。

蛋白質含量≥1g/100g時，結果保留三位有效數字；蛋白質含量＜1g/100g時，結果保留兩位有效數字。

注：當只檢測氮含量時，不需要乘蛋白質換算系數F。

7.注意事項

①蒸餾前給水蒸氣發生器內裝水至2/3體積處，加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升以使其始終保持酸性，這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測定結果。

②20g/L硼酸吸收液每次用量25mL，用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2滴。

③在蒸餾時，蒸汽發生要均勻充足。蒸餾過程中不得停火斷汽，否則將發生倒吸。

④加堿要足量，操作要迅速；漏斗應采用水封措施，以免氨由此逸出損失。

二、蛋白質的快速測定法

雙縮脲法是測定蛋白質含量常用方法之一。此法簡單、快速，有較好的精密度，分析對象也比較廣泛，適于快速分析。雙縮脲法是一種比色測定方法，測定中需要有與被測樣品成分相似或同類物質做標準樣，標準樣品的蛋白質含量也需要通過凱氏定氮法確定。

雙縮脲法受蛋白質特異性的影響較小，除組氨酸以外，其他的游離氨基酸和二肽化合物均不顯色；除雙縮脲、一亞氨基雙縮脲、二亞氨基雙縮脲、氨基酰胺、丙二酸胺等少數化合物以外，非蛋白質均不顯色。所以，雙縮脲反應基本上可看作是蛋白質的特有反應。

雙縮脲試劑經改進后，對于富含淀粉的糧食樣品，可不預先提取蛋白質雙縮脲而直接進行測定。若將反應溫度提高到60℃，則反應時間可縮短到5min左右。但該法靈敏度不高，樣品用量大。而且事先要用凱氏法測蛋白質含量，繪制出標準曲線或計算回歸方程，比較麻煩。

1.適用范圍

雙縮脲法適用于生物化學領域中測定蛋白質含量，也適用于豆類、油料、米谷類等作物種子及肉類等樣品的測定。

2.測定原理

當脲加熱至150～160℃時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲（也叫雙縮脲），雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，蛋白質分子中含有肽鍵（—CO—NH—），與雙縮脲結構相似，故也能呈現此反應而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質含量成正比，該配合物的最大吸收波長為560nm。

本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故常作為糧食作物的例行分析方法。

3.儀器與設備

①紫外-可見分光光度計。

②離心機（4000r/min）。

③恒溫水浴鍋。

④500mL容量瓶。

⑤50mL、100mL量筒。

4.試劑與配制

①堿性硫酸銅溶液

a.以甘油為穩定劑將10mL 10mol/L氫氧化鉀和3.0mL甘油加到937mL蒸餾水中，劇烈攪拌，同時慢慢加入50mL 40g/L硫酸銅溶液。

b.以酒石酸鉀鈉作穩定劑將10mL 10mol/L氫氧化鉀和20mL 250g/L酒石酸鉀鈉溶液加到930mL蒸餾水中，同時慢慢加入40mL 40g/L硫酸銅溶液，必須劇烈攪拌，否則將生成氫氧化銅沉淀。

②四氯化碳。

5.操作步驟

①標準曲線的繪制。以凱氏定氮法測出標準樣品的蛋白質含量，并按不同蛋白質含量稱取標準蛋白質樣品。分別置于數支50mL比色管中，然后加入1.00mL四氯化碳進行脫脂，再用堿性硫酸銅溶液稀釋至50mL，振搖10min，靜置1h，取上層清液離心10min，取離心后的透明液于比色皿中，選擇在560nm處，以試劑溶液做空白試驗測定各標準樣液的吸光度（A）。以蛋白質含量為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。

②樣品的測定。準確稱取樣品（使得蛋白質含量在40～100mg之間）于50mL比色管中，同樣加1.00mL四氯化碳，按上述步驟①在相同條件下進行顯色，測定吸光A。用測得的A值在標準曲線上即可查得蛋白質的質量，由此求得蛋白質含量。

6.結果計算

按式（3-2）計算測定結果：

　　（3-2）

式中　m1——由標準曲線上查得的蛋白質的質量，mg；

m——樣品質量，g。

7.注意事項

①蛋白質的種類不同，對發色程度的影響不大。

②標準曲線作完整之后，無需每次再作標準曲線。

③脂肪含量高的樣品應預先用醚抽出棄去。

④樣品中有不溶性成分存在時，可預先將蛋白質抽出后再測定。

⑤當肽鏈中含有脯氨酸時，若有大量糖類共存，則顯色不好，會使測定值偏低。

⑥本法操作簡便，但相應的樣品應具有一定的溶解度，或選擇適當的溶劑或介質增加其溶解度，以減少因散射造成的影響。

⑦對渾濁樣液除進行離心處理外，也可與系列濃度的類似樣品顯色液進行目視比色測定。

三、花生脂肪含量的測定（GB 5009.6—2016）

（一）索氏抽提法

1.適用范圍

索氏抽提法適用于脂類含量較高，結合態的脂類含量較少，能烘干磨細，不易吸濕結塊的樣品的測定。水果、蔬菜及其制品、糧食及糧食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、水產及其制品、焙烤食品、糖果等食品中游離態脂肪含量可用本法測定。

2.測定原理

脂肪易溶于有機溶劑。試樣直接用無水乙醚或石油醚等溶劑抽提后，蒸發除去溶劑，干燥，得到游離態脂肪的含量。

3.試劑和材料

（1）試劑

無水乙醚（C4H10O）；石油醚（CnH2n+2）（石油醚沸程為30～60℃）。

（2）材料

石英砂；脫脂棉。

4.儀器和設備

①索氏抽提器。

②恒溫水浴鍋。

③分析天平：感量0.001g和0.0001g。

④電熱鼓風干燥箱。

⑤干燥器：內裝有效干燥劑，如硅膠。

⑥濾紙筒。

⑦蒸發皿。

5.操作步驟

（1）試樣處理

固體試樣：稱取充分混勻后的試樣2～5g，準確至0.001g，全部移入濾紙筒內。

液體或半固體試樣：稱取混勻后的試樣5～10g，準確至0.001g，置于蒸發皿中，加入約20g石英砂，于沸水浴上蒸干后，在電熱鼓風干燥箱中于（100±5）℃干燥30min后，取出，研細，全部移入濾紙筒內。蒸發皿及粘有試樣的玻璃棒，均用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，并將棉花放入濾紙筒內。

（2）抽提

將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內，連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚至瓶內容積的2/3處，于水浴上加熱，使無水乙醚或石油醚不斷回流抽提（6～8次/h），一般抽提6～10h。提取結束時，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢。

（3）稱量

取下接收瓶，回收無水乙醚或石油醚，待接收瓶內溶劑剩余1～2mL時在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1h，放干燥器內冷卻0.5h后稱量。重復以上操作直至恒重（直至兩次稱量的差不超過2mg）。

6.分析結果的計算

試樣中脂肪的含量按式（3-3）計算：

　　（3-3）

式中　X——試樣中脂肪的含量，g/100g；

m1——恒重后接收瓶和脂肪的含量，g；

m0——接收瓶的質量，g；

m2——試樣的質量，g；

100——換算系數。

計算結果保留小數點后一位。

7.注意事項

①樣品應干燥后研細，樣品含水分會影響溶劑提取效果，而且溶劑會吸收樣品中的水分，造成非脂成分溶出。裝樣品的濾紙筒一定要嚴密，不能往外漏樣品，但也不要包得太緊，影響溶劑滲透。放入濾紙筒時高度不要超過回流彎管，否則超過彎管樣品中的脂肪不能抽提，造成誤差。

②對含大量糖及糊精的樣品，要先用冷水使糖及糊精溶解，經過濾除去，將殘渣連同濾紙一起烘干，放入抽提管中。

③抽提用的乙醚或石油醚要求無水、無醇、無過氧化物，揮發殘渣含量低。

④過氧化物的檢查方法：取6mL乙醚，加2mL 10%碘化鉀溶液，用力振搖，放置1min后，若出現黃色，則證明有過氧化物存在，應另選乙醚或處理后再用。

⑤提取時水浴溫度不可過高，以每分鐘從冷凝管滴下80滴左右，每小時回流6～12次為宜，提取過程應注意防火。

（二）酸水解法

1.適用范圍

酸水解法適用于各類食品中脂肪的測定，對固體、半固體、黏稠液體或液體食品，特別是加工后的混合食品，容易吸濕、結塊，不易烘干的食品，不能采用索氏提取法時，用此法效果較好。水果、蔬菜及其制品、糧食及糧食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、水產及其制品、焙烤食品、糖果等食品中游離態脂肪及結合態脂肪總量可用本法測定。

2.測定原理

食品中的結合態脂肪必須用強酸使其游離出來，游離出的脂肪易溶于有機溶劑。試樣經鹽酸水解后用無水乙醚或石油醚提取，除去溶劑即得游離態和結合態脂肪的總含量。

3.試劑與配制

（1）試劑

鹽酸；乙醇；無水乙醚；石油醚（沸程為30～60℃）；碘；碘化鉀。

（2）試劑的配制

鹽酸溶液（2mol/L）：量取50mL鹽酸，加入到250mL水中，混勻。

碘液（0.05mol/L）：稱取6.5g碘和25g碘化鉀于少量水中溶解，稀釋至1L。

4.材料

藍色石蕊試紙；脫脂棉；濾紙（中速）。

5.儀器和設備

①恒溫水浴鍋。

②電熱板：滿足200℃高溫。

③錐形瓶。

④分析天平：感量為0.1g和0.001g。

⑤電熱鼓風干燥箱。

6.操作步驟

（1）試樣水解

固體試樣：稱取約2～5g，準確至0.001g，置于50mL試管內，加入8mL水，混勻后再加10mL鹽酸。將試管放入70～80℃水浴中，每隔5～10min以玻璃棒攪拌1次，至試樣消化完全為止，約40～50min。

液體試樣：稱取約10g，準確至0.001g，置于50mL試管內，加10mL鹽酸。將試管放入70～80℃水浴中，每隔5～10min以玻璃棒攪拌1次，至試樣消化完全為止，約40～50min。

（2）抽提

取出試管，加入10mL乙醇，混合。冷卻后將混合物移入100mL具塞量筒中，以25mL無水乙醚分數次淋洗試管，一并倒入量筒中。待無水乙醚全部倒入量筒后，加塞振搖1min，小心開塞，放出氣體，再塞好，靜置12min，小心開塞，并用乙醚沖洗塞及量筒口附著的脂肪。靜置10～20min，待上部液體清晰，吸出上清液于已恒重的錐形瓶內，再加5mL無水乙醚于具塞量筒內，振搖，靜置后，仍將上層乙醚吸出，放入原錐形瓶內。

（3）稱量

取下接收瓶，回收無水乙醚或石油醚，待接收瓶內溶劑剩余1～2mL時在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1h，放入干燥器內冷卻0.5h后稱量。重復以上操作直至恒重（直至兩次稱量的差不超過2mg）。

7.結果計算

試樣中脂肪的含量按式（3-4）計算：

　　（3-4）

式中　X——試樣中脂肪的含量，g/100g；

m1——恒重后接收瓶和脂肪的含量，g；

m0——接收瓶的質量，g；

m2——試樣的質量，g；

100——換算系數。

計算結果保留小數點后一位。

8.注意事項

①測定的樣品需充分磨細，液體樣品需充分混合均勻，以使消化完全。

②水解后加的乙醇可使蛋白質沉淀，促進脂肪球聚合，同時溶解一些碳水化合物、有機酸等。后面用乙迷提取，因乙醇可溶于乙醚，故需加入石油醚，降低乙醇在醚中的溶解度，使乙醇溶解物殘留在水層，并使分層清晰。

③揮干溶劑后，殘留物中若有黑色焦油狀雜質，是分解物與水一同混入所致，會使測定值增大，造成誤差，可用等量的乙迷及石油醚溶解后過濾，再次進行揮干溶劑的操作。

④因磷脂在酸水解條件下分解為脂肪酸和堿，故本法不宜用于測定含有大量磷脂的食品如魚類、貝類和蛋品。此法也不適于含糖高的食品，因糖類遇強酸易碳化而影響測定結果。

四、花生中黃曲霉毒素的測定（GB 5009.22—2016）

黃曲霉毒素（AFT）是一類化學結構類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，是黃曲霉菌、寄生曲霉菌產生的代謝產物。黃曲霉毒素有劇毒，同時還有致癌、致畸、致突變的作用，主要引起肝癌，還可以誘發骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。黃曲霉毒素是目前發現的化學致癌物中最強的物質之一，主要存在于被黃曲霉污染過的糧食、油及其制品中，例如黃曲霉污染的花生、花生油、玉米、大米、棉籽中最為常見，在干果類食品如胡桃、杏仁、榛子中，在動物性食品如肝、咸魚中以及在乳和乳制品中也曾發現過黃曲霉毒素。黃曲霉毒素在紫外線照射下能產生熒光，根據熒光顏色不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物。

1.適用范圍

本測定方法為高效液相色譜-柱前衍生法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的測定。

2.測定原理

試樣中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經黃曲霉毒素固相凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質、色素及糖類化合物等干擾物質，凈化液用三氟乙酸柱前衍生，液相色譜分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。

3.試劑和材料

（1）試劑

甲醇（CH3OH）：色譜純。

乙腈（CH3CN）：色譜純。

正己烷（C6H14）：色譜純。

三氟乙酸（CF3COOH）。

（2）試劑配制

乙腈-水溶液（84+16）：取840mL乙腈加入160mL水。

甲醇-水溶液（70+30）：取700mL甲醇加入300mL水。

乙腈-水溶液（50+50）：取500mL乙腈加入500mL水。

乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500mL乙腈加入500mL甲醇。

（3）標準品

AFTB1標準品（C17H12O6，CAS號：1162-65-8）：純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

AFTB2標準品（C17H14O6，CAS號：7220-81-7）：純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

AFTG1標準品（C17H12O7，CAS號：1165-39-5）：純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

AFTG2標準品（C17H14O7，CA號：7241-98-7）：純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

注：標準物質可以使用滿足溯源要求的商品化標準溶液。

（4）標準溶液配制

標準儲備溶液（10μg/mL）：分別稱取AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG21mg（精確至0.01mg），用乙腈溶解并定容至100mL。此溶液濃度約為10μg/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。

混合標準工作液（AFTB1和AFTG1：100ng/mL；AFTB2和AFTG2：30ng/mL）：準確移取AFTB1和AFTG1標準儲備溶液各1mL，AFTB2和AFTG2標準儲備溶液各300μL至100mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，三個月內有效。

標準系列工作溶液：分別準確移取混合標準工作液10μL、50μL、200μL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL至10mL容量瓶中，用初始流動相定容至刻度（AFTB1和AFTG1濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL；AFTB2和AFTG2濃度為0.03ng/mL、0.15ng/mL、0.6ng/mL、1.5ng/mL、3.0ng/mL、6.0ng/mL、12.0ng/mL的系列標準溶液）。

4.儀器和設備

①勻漿機。

②高速粉碎機。

③組織搗碎機。

④超聲波/渦旋振蕩器或搖床。

⑤天平：感量0.01g和0.00001g。

⑥渦旋混合器。

⑦高速均質器：轉速6500～24000r/min。

⑧離心機：轉速≥6000r/min。

⑨玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。

⑩氮吹儀。

液相色譜儀：配熒光檢測器。

色譜分離柱。

黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱（以下簡稱凈化柱）或相當者。

一次性微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜使用。

篩網：1～2mm試驗篩孔徑。

恒溫箱。

pH計。

5.操作步驟

（1）樣品制備

采樣量需大于1kg，用高速粉碎機將其粉碎，過篩，使其粒徑小于2mm孔徑試驗篩，混合均勻后縮分至100g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。

（2）樣品提取

稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質器均質3min），在6000r/min下離心10min（或均質后用玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。

（3）樣品黃曲霉毒素固相凈化柱凈化

移取適量上清液，按凈化柱操作說明進行凈化，收集全部凈化液。

（4）衍生

用移液管準確吸取4.0mL凈化液于10mL離心管后在50℃下用氮氣緩緩地吹至近干，分別加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，渦旋30s，在（40±1）℃的恒溫箱中衍生15min，衍生結束后，在50℃下用氮氣緩緩地將衍生液吹至近干，用初始流動相定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，過0.22μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

（5）色譜參考條件

色譜參考條件列出如下：

①流動相：A相，水；B相，乙腈-甲醇溶液（50+50）。

②梯度洗脫：24%B（0～6min），35% B（8.0～10.0min），100% B（10.2～11.2min），24% B（11.5～13.0min）。

③色譜柱：C18柱（柱長150mm或250mm，柱內徑4.6mm，填料粒徑5.0μm），或相當者。

④流速：1.0mL/min。

⑤柱溫：40℃。

⑥進樣體積：50μL。

⑦檢測波長：激發波長360nm；發射波長440nm。

⑧液相色譜圖見圖3-2。

（6）樣品測定

①標準曲線的制作。系列標準工作溶液由低濃度到高濃度依次進樣檢測，以峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標作圖，得到標準曲線回歸方程。

②試樣溶液的測定。待測樣液中待測化合物的響應值應在標準曲線線性范圍內，濃度超過線性范圍的樣品則應稀釋后重新進樣分析。

③空白試驗。不稱取試樣，按操作步驟中（2）～（4）的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。

6.結果計算

試樣中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的殘留量按式（3-5）計算：

　　（3-5）

式中　X——試樣中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2的含量，μg/kg；

ρ——進樣溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2按照外標法在標準曲線中對應的濃度，ng/mL；

V1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積，醬油、醋按定容總體積），mL；

V3——凈化液的最終定容體積，mL；

1000——換算系數；

V2——凈化柱凈化后的取樣液體積，mL；

m——試樣的稱樣量，g。

計算結果保留三位有效數字。

五、植物油脂檢驗——扦樣、分樣法（GB/T 5524—2008）

1.適用范圍

適用于液態油脂、固態油脂扦樣。

2.原理

扦樣和制備樣品的目的是從一批樣品中獲得便于處理的油脂量。樣品的特性應盡可能地接近其所代表的油脂的特性。

3.扦樣工具

（1）扦樣管

扦樣管是不銹鋼裝置，由兩個長度相同且緊密靠在一起的同心圓管組成，其中一個管可在另一個管中轉動。每個管上都有縱向開口。在某一位置，管開啟使油流入，通過轉動內管而使管封閉。內管直徑為20～40mm，整個長度上直徑相同。當排空扦樣管時，因兩管上都分布有小孔，所以當縱向開口關閉時，管中的油能夠從小孔排出。

該扦樣管適用于圓筒中不同深度的扦樣，扦樣時，可以按住管頂直到指定深度。

（2）帶底閥的扦樣筒

帶底閥的扦樣筒分為上下兩部分，上部頂端敞口，下部在筒體外側裝有較重的螺旋機構，其底端固定一輕型自重閥，以確保扦樣裝置自底部到頂部的穩固。當扦樣筒在液體油脂中下落時，油脂對閥的壓力使閥底一直處于打開狀態，以確保油脂均勻地流入筒體。當停止下落時，底閥關閉，油脂從扦樣筒所達的深度被抽出。

（3）扦樣鏟

扦樣鏟用于硬脂的扦樣，由不銹鋼制成，具有半圓形或C形的橫截面。將其扭轉插入油脂中，便取得一份油樣。

4.扦樣方法

從包裝的產品中（包括消費者購買的小包裝產品）扦樣，對于不同規格的包裝，采樣數可按表3-2的推薦值。

包裝液態油脂的扦樣步驟：轉動并翻轉裝滿液態油脂的桶或罐，采用手工或機械的方式，用槳葉或攪拌器將油脂攪勻，從桶的封塞孔或其他容器的方便開口插入適當的扦樣裝置，從被扦樣的每一容器中采集一份檢樣，從盡可能多的內容物部位采樣；按等同分量充分混合這些檢樣樣品形成原始樣品。

5.試樣制備

當需要進行污染物分析時，試樣要從每罐中采集。也可以按照有關各方的協議從原始樣品中制備試樣，具體方式如下：

①從原始樣品中制備稱量過的平均樣品。

②從每份原始樣品中制備。

無論采用①或是②，分割制備的原始樣品以獲得至少4份試樣，每份至少250g（當有特殊要求時，也可制備500g以上的試樣）。不斷地攪動以避免沉淀物的沉積。

六、植物油脂檢驗——水分及揮發物測定法（GB 5009.236—2016）

（一）沙浴（電熱板）法

1.適用范圍

本測定方法適用于所有的動植物油脂。

2.原理

在（103±2）℃的條件下，對測試樣品進行加熱至水分及揮發物完全散盡，測定樣品損失的質量。

3.儀器和設備

①分析天平：感量0.001g。

②碟子：陶瓷或玻璃的平底碟，直徑80～90mm，深約30mm。

③溫度計：刻度范圍至少為80～110℃，長約100mm，水銀球加固，上端具有膨脹室。

④沙浴或電熱板（室溫約150℃）。

⑤干燥器：內含有效的干燥劑。

4.分析步驟

（1）試樣制備

在預先干燥并與溫度計一起稱量的碟子中，稱取試樣約20g，精確至0.001g。

液體樣品：對于澄清無沉淀物的液體樣品，在密閉的容器中搖動，使其均勻；對于有渾濁或有沉淀物的液體樣品，在密閉的容器中搖動，直至沉淀物完全與容器壁分離，并均勻地分布在油體中。檢查是否有沉淀物吸附在容器壁上，如有吸附，應完全清除（必要時打開容器），使它們完全與油混合。

固體樣品：將樣品加熱至剛變為液體，按液體試樣操作，使其充分混勻。

（2）試樣測定

將裝有測試樣品的碟子在沙浴或電熱板上加熱至90℃，升溫速率控制在10℃/min左右，邊加熱邊用溫度計攪拌。

降低加熱速率觀察碟子底部氣泡的上升，控制溫度升高至（103±2）℃，確保不超過105℃。繼續攪拌至碟子底部無氣泡放出。

為確保水分完全散盡，重復數次加熱至（103±2）℃、冷卻至90℃的步驟，將碟子和溫度計置于干燥器中，冷卻至室溫，稱量，精確至0.001g。重復上述操作，直至連續兩次結果不超過2mg。

5.結果計算

水分及揮發物含量（X）以質量分數表示，按式（3-6）計算：

　　（3-6）

式中　X——水分及揮發物含量，%；

m1——加熱前碟子、溫度計和測試樣品的質量，g；

m2——加熱后碟子、溫度計和測試樣品的質量，g；

m0——碟子和溫度計的質量，g；

100——單位換算。

計算結果保留小數點后兩位。

（二）電熱干燥箱法

1.適用范圍

本測定方法適用于酸價低于4mg/g的非干性油脂，不適用于月桂酸型的油（棕櫚仁油和椰子油）。

2.原理

在（103±2）℃的條件下，對測試樣品進行加熱至水分及揮發物完全散盡，測定樣品損失的質量。

3.儀器和設備

①分析天平：感量0.001g。

②玻璃容器：平底，直徑約50m，高約30mm。

③電熱干燥箱：主控溫度（103±2）℃。

④干燥器：內含有效的干燥劑。

4.分析步驟

（1）試樣準備

在預先干燥并稱量的玻璃容器中，根據試樣預計水分及揮發物含量，稱取5g或10g試樣，精確至0.001g。

（2）試樣測定

將含有試樣的玻璃容器置于（103±2）℃的電熱干燥箱中1h，再移入干燥器中，冷卻至室溫，稱量，準確至0.001g。重復加熱、冷卻及稱量的步驟，每次復烘時間為30min，直到連續兩次稱量的差值根據測試樣品質量的不同，分別不超過2mg（5g樣品時）或4mg（10g樣品時）。

注：重復加熱多次后，若油脂樣品發生自動氧化導致質量增加，可取前幾次測定的最小值計算結果。

5.結果計算

同沙浴法。

七、大豆油脂中磷脂的測定（GB/T 5537—2008）

1.適用范圍

磷脂是由甘油、脂肪酸、磷酸、氨基醇和環醇等構成的化合物。本測定方法適用于植物原油、脫膠油及成品油。

2.原理

植物油中的磷脂經灼燒成為五氧化二磷，被熱鹽酸變成磷酸，遇鉬酸鈉生成磷鉬酸鈉，用硫酸聯氨還原成鉬藍，用分光光度計在波長650nm測定鉬藍的吸光度，與標準曲線比較，計算其含量。

3.儀器和用具

①分光光度計：具1cm比色皿。

②分析天平：分度值0.0001g。

③馬弗爐：可控制溫度，主要使用溫度在550～600℃。

④封閉電爐：可調溫。

⑤沸水浴。

⑥瓷坩堝或石英坩堝：50mL、100mL能承受的最低溫度為600℃。

⑦容量瓶：100mL、500mL、1000mL。

⑧移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

⑨比色管：50mL。

4.試劑和溶液

①鹽酸：1.19g/mL。

②氧化鋅。

③氫氧化鉀。

④濃硫酸：1.84g/mL。

⑤鉬酸鈉。

⑥硫酸聯氨。

⑦磷酸二氫鉀：使用前在101℃下干燥2h。

⑧2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液：量取140mL濃硫酸，注入300mL水中，冷卻至室溫，加人12.5g鉬酸鈉，溶解后用水定容至500mL，充分搖勻，靜置24h備用。

⑨0.015%硫酸聯氨溶液：將0.15g硫酸聯氨溶解在1L水中。

⑩50%氫氧化鉀溶液：將50g氫氧化鉀溶解在50mL水中。

1∶1鹽酸溶液：將鹽酸溶解在等體積的水中。

磷酸鹽標準儲備液：稱取干燥的磷酸二氫鉀0.4387g，用水溶解并稀釋定容至1000mL，此溶液含磷0.1mg/mL。

標準曲線用磷酸鹽標準溶液：用移液管吸取磷酸鹽標準儲備液10mL至100mL容量瓶中，加水稀釋并定容，此溶液含磷0.01mg/mL。

5.操作步驟

（1）扦樣

按GB/T 5524—2008中的規定執行。

（2）試樣的制備

將裝有實驗室樣品的容器置于50℃的干燥箱內，當樣品溫度達到50℃后，振搖使樣品盡可能均勻。如果加熱混合后樣品沒有完全澄清，可在50℃恒溫干燥箱內將油脂過濾或用熱過濾漏斗過濾。為避免脂肪物質因氧化或聚合而發生變化，樣品在干燥箱內放置的時間不宜太長。過濾后的樣品應完全澄清。

（3）繪制標準曲線

取六支比色管，按順序分別注入磷酸鹽標準溶液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL，再按順序分別加水10mL、9mL、8mL、6mL、4mL、2mL。接著向六支比色管中分別加入0.015%硫酸聯氨溶液8mL，2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液2mL。加塞，振搖3～4次，去塞，將比色管放入沸水浴中加熱10min，取出，冷卻至室溫。用水稀釋至刻度，充分搖勻，靜置10min。移取該溶液至干燥、潔凈的比色皿中，用分光光度計在650nm處，用試劑空白調整零點，分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標，含磷量（0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg）為橫坐標繪制標準曲線。

（4）制備試液

根據試樣的磷脂含量，用坩堝稱取制備好的試樣，成品油試樣稱量10g，原油及脫膠油稱量3.0～3.2g（精確至0.001g）。加氧化鋅0.5g，先在電爐上緩慢加熱至樣品變稠，逐漸加熱至全部炭化，將坩堝送至550～600℃的馬弗爐中灼燒至完全灰化（白色），時間約2h。取出坩堝冷卻至室溫，用10mL 1∶1鹽酸溶液溶解灰分并加熱至微沸，5min后停止加熱，待溶解液溫度降至室溫，將溶解液過濾注入100mL容量瓶中，每次用大約5mL熱水沖洗坩堝和濾紙共3～4次，待濾液冷卻到室溫后，用50%氫氧化鉀溶液中和至出現混濁，緩慢滴加1∶1鹽酸溶液使氧化鋅沉淀全部溶解，加2滴。最后用水稀釋定容至刻度，搖勻。制備被測液時同時制備一份樣品空白。

（5）比色

用移液管吸取上述制備的被測液10mL，注入50mL比色管中。加入0.015%硫酸聯氨溶液8mL，2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液2mL。加塞，振搖3～4次，去塞，將比色管放入沸水浴中加熱10min，取出，冷卻至室溫。用水稀釋至刻度，充分搖勻，靜置10min。移取該溶液至干燥、潔凈的比色皿中，用分光光度計在650nm下，用試樣空白調整零點，測定其吸光度。

6.結果計算

試樣中磷脂含量按式（3-7）計算：

　　（3-7）

式中　X——磷脂含量，mg/g：

P——標準曲線查得的被測液的含磷量，mg；

m——試樣質量，g；

V1——樣品灰化后稀釋的體積，mL；

V2——比色時所取的被測液的體積，mL；

26.31——每毫克磷相當于磷脂的毫克數。

當被測液的吸光度值大于0.8時，需適當減少吸取被測液的體積，以保證被測液的吸光度值在0.8以下。

每份樣品應平行測試兩次，平行試樣測定的結果符合精密度要求時，取其平均值作為結果，計算結果保留小數點后三位。

八、植物油脂肪酸含量的測定（GB 5009.168—2016）

1.適用范圍

本測定方法適用于毛細管柱氣相色譜內標法測定食品中總脂肪、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸。

水解-提取法適用于食品中脂肪酸含量的測定；酯交換法適用于游離脂肪酸含量不大2%的油脂樣品的脂肪酸含量測定。

2.原理

（1）水解-提取法

加入內標物的試樣經水解，乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，經毛細管柱氣相色譜分析，內標法定量測定脂肪酸甲酯含量。依據各種脂肪酸甲酯含量和轉換系數計算出總脂肪、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量。動植物油脂試樣不經脂肪提取，加入內標物后直接進行皂化和脂肪酸甲酯化。

（2）酯交換法

將油脂溶解在異辛烷中，加入內標物后，加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應完全后，用硫酸氫鈉中和剩余的氫氧化鉀，以避免甲酯皂化。

3.試劑和材料

（1）試劑

①鹽酸（HCl）。

②氨水（NH3·H2O）。

③焦性沒食子酸（C6H6O3）。

④乙醚（C4H10O）。

⑤石油醚：沸程3.0～60℃。

⑥乙醇（C2H6O）（95%）。

⑦甲醇（CH3OH）：色譜純。

⑧氫氧化鈉（NaOH）。

⑨正庚烷［CH3（CH2）5CH3］：色譜純。

⑩三氟化硼甲醇溶液，濃度為15%。

無水硫酸鈉（Na2SO4）。

氯化鈉（NaCl）。

異辛烷［（CH3）2CHCH2C（CH3）3］：色譜純。

硫酸氫鈉（NaHSO4）。

氫氧化鉀（KOH）。

（2）試劑配制

①鹽酸溶液（8.3mol/L）：量取250mL鹽酸，用110mL水稀釋，混勻，室溫下可放置2個月。

②乙醚-石油醚混合液（1+1）：取等體積的乙醚和石油醚，混勻備用。

③氫氧化鈉甲醇溶液（2%）：取2g氫氧化鈉溶解在100mL甲醇中，混勻。

④飽和氯化鈉溶液：稱取360g氯化鈉溶解于1.0L水中，攪拌溶解，澄清備用。

⑤氫氧化鉀甲醇溶液（2mol/L）：將13.1g氫氧化鉀溶于100mL無水甲醇中，可輕微加熱，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，即得澄清溶液。

（3）標準品

①十一碳酸甘油三酯（C36H68O6；CAS號：13552-80-2）。

②混合脂肪酸甲酯標準品。

③單脂肪酸甲酯標準品。

（4）標準溶液配制

①十一碳酸甘油三酯內標溶液（5.00mg/mL）：準確稱取2.5g（精確至0.1mg）十一碳酸甘油三酯至燒杯中，加入甲醇溶解，移入500mL容量瓶后用甲醇定容，在冰箱中冷藏可保存1個月。

②混合脂肪酸甲酯標準溶液：取出適量脂肪酸甲酯混合標準移至到10mL容量瓶中，用正庚烷稀釋定容，儲存于-10℃以下冰箱，有效期3個月。

③單脂肪酸甲酯標準溶液：將單脂肪酸甲酯分別從安瓿瓶中取出轉移到10mL容量瓶中，用正庚烷沖洗安瓿瓶，再用正庚烷定容，分別得到不同脂肪酸甲酯的單標溶液，儲存于-10℃以下冰箱，有效期3個月。

4.儀器設備

①勻漿機或實驗室用組織粉碎機或研磨機。

②氣相色譜儀：具有氫火焰離子檢測器（FID）。

③毛細管色譜柱：聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相，柱長100m，內徑0.25mm，膜厚0.2μm。

④恒溫水浴：控溫范圍40～100℃，控溫±1℃。

⑤分析天平：感量0.1mg。

⑥旋轉蒸發儀。

5.分析步驟

（1）試樣的制備

在采樣和制備過程中，應避免試樣污染。固體或半固體試樣使用組織粉碎機或研磨機粉碎，液體試樣用勻漿機打成勻漿于-18℃以下冷凍保存，分析用時將其解凍后使用。

（2）試樣前處理

①水解-提取法。稱取均勻試樣0.1～10g（精確至0.1mg，約含脂肪100～200mg）移入到250mL平底燒瓶中，準確加入2.0mL十一碳酸甘油三酯內標溶液。加入約100mg焦性沒食子酸，加入幾粒沸石，再加入2mL 95%乙醇和4mL水，混勻。

在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8mL，連接回流冷凝器，（80±1）℃水浴上回流，直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7mL 15%三氟化硼甲醇溶液，在（80±1）℃水浴中繼續回流2min。用少量水沖洗回流冷凝器。停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。

準確加入10～30mL正庚烷，振搖2min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取液大約5mL，至25mL試管中，加入大約3～5g無水硫酸鈉，振搖1min，靜置5min，吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。

②酯交換法。適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品。

a.試樣稱取。稱取試樣60.0mg至具塞試管中，精確至0.1mg，準確加入2.0mL內標溶液。

b.甲酯制備。加入4mL異辛烷溶解試樣，必要時可以微熱，試樣溶解后加入200μL氫氧化鉀甲醇溶液，蓋上玻璃塞猛烈振搖30s后靜置至澄清。加入約1g硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后，將上層溶液移至上機瓶中，待測。

（3）測定

①色譜參考條件。取單脂肪酸甲酯標準溶液和脂肪酸甲酯混合標準溶液分別注入氣相色譜儀，對色譜峰進行定性。

a.毛細管色譜柱：聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相，柱長100m，內徑0.25mm，膜厚0.2μm。

b.進樣器溫度：270℃。

c.檢測器溫度：280℃。

d.程序升溫：初始溫度100℃，持續13min；100～180℃，升溫速率10℃/min，保持6min；180～200℃，升溫速率1℃/min，保持20min；200～230℃，升溫速率4℃/min，保持10.5min。

e.載氣：氮氣。

f.分流比：100∶1。

g.進樣體積：1.0μL。

h.檢測條件應滿足理論塔板數（n）至少2000/m，分離度（R）至少1.25。

②試樣測定。在上述色譜條件下將脂肪酸標準測定液及試樣測定液分別注入氣相色譜儀，以色譜峰峰面積定量。

6.結果計算

（1）試樣中單脂肪酸甲酯含量

試樣中單脂肪酸甲酯含量按式（3-8）計算：

　　（3-8）

式中　Xi——試樣中脂肪酸甲酯i含量，g/100g；

Fi——脂肪酸甲酯i的響應因子；

Ai——試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積；

——試樣中加入的內標物十一碳酸甲酯峰面積；

——十一碳酸甘油三酯濃度，mg/mL；

——試樣中加入十一碳酸甘油三酯體積，mL；

1.0067——十一碳酸甘油三酯轉化成十一碳酸甲酯的轉換系數；

m——試樣的質量，mg；

100——將含量轉換為每100g試樣中含量的系數。

脂肪酸甲酯i的響應因子Fi按式（3-9）計算：

　　（3-9）

式中　Fi——脂肪酸甲酯i的響應因子；

ρsi——混標中各脂肪酸甲酯i的濃度，mg/mL；

A11——十一碳酸甲酯峰面積；

Asi——脂肪酸甲酯i的峰面積；

ρ11——混標中十一碳酸甲酯濃度，mg/mL。

（2）試樣中飽和脂肪酸含量

試樣中飽和脂肪酸含量按式（3-10）計算，試樣中單飽和脂肪酸含量按式（3-11）計算：

　　（3-10）

　　（3-11）

式中　XSaturated Fat——飽和脂肪酸含量，g/100g；

XSFAi——單飽和脂肪酸含量，g/100g；

XFAME i——單飽和脂肪酸甲酯含量，g/100g；

FFAMEi-FAi——脂肪酸甲酯轉化成脂肪酸的系數。

（3）試樣中單不飽和脂肪酸含量

試樣中單不飽和脂肪酸含量（XMono-UnsaturatedFat）按式（3-12）計算，試樣中每種單不飽和脂肪酸甲酯含量按式（3-13）計算：

　　（3-12）

　　（3-13）

式中　XMono-UnsaturatedFat——試樣中單不飽和脂肪酸含量，g/100g；

XMUFAi——試樣中每種單不飽和脂肪酸含量，g/100g；

XFAMEi——每種單不飽和脂肪酸甲酯含量，g/100g；

FFAMEi-FAi——脂肪酸甲酯i轉化成脂肪酸的系數。

（4）試樣中多不飽和脂肪酸含量

試樣中多不飽和脂肪酸含量（XPoly-UnsaturatedFat）按式（3-14）計算，每種多不飽和脂肪酸含量按式（3-15）計算：

　　（3-14）

　　（3-15）

式中　XPoly-UnsaturatedFat——試樣中多不飽和脂肪酸含量，g/100g；

XPUFAi——試樣中每種多不飽和脂肪酸含量，g/100g；

XFAMEi——每種多不飽和脂肪酸甲酯含量，g/100g；

FFAMEi-FAi——脂肪酸甲酯轉化成脂肪酸的系數。

（5）試樣中總脂肪含量

試樣中總脂肪含量按式（3-16）計算：

　　（3-16）

式中　XTotalFat——試樣中總脂肪含量，g/100g；

Xi——試樣中每種脂肪酸甲酯i含量，g/100g；

FFAMEi-TGi——脂肪酸甲酯i轉化成甘油三酯的系數。

結果保留三位有效數字。