第二部分 微生物發酵產酶實驗
實驗六 產淀粉酶菌株的快速篩選
一、實驗目的
學習和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和篩選方法。
二、實驗原理
產淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周圍的培養基中，從而水解培養基中的淀粉，加入碘酒后，淀粉遇碘變紫色，但是菌株周圍的淀粉因為被水解，從而在菌落周圍形成顏色較淺的透明圈（圖6-1）。透明圈直徑與菌落直徑之比則可反映菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、簡單易行等優點。
圖6-1 產淀粉酶菌落形成的透明圈示意圖
三、材料、試劑與器材
1.菌株來源
取校園不同地點的表層土壤。
2.試劑
（1）淀粉培養基：可溶性淀粉12g，NaNO3 2g，K2HPO4 2g，KCl 1g，MgSO4·7H2O 1g，瓊脂20g，1000mL蒸餾水，pH7.0，121℃滅菌20min。
（2）2mol/L NaOH溶液。
3.器材
高壓滅菌鍋、恒溫振蕩培養箱、離心機、電子天平、錐形瓶、培養皿、涂布棒、移液槍、槍頭、牙簽、1.5mL離心管、試管、滴管、取樣器和塑料直尺。
四、實驗步驟
1.器皿的消毒
培養皿、槍頭、牙簽、離心管、試管、滴管等用四層報紙包好，在121℃下滅菌20min，取出備用。
2.培養基的配制與滅菌
配制淀粉培養基，121℃滅菌20min，將滅菌后的培養基倒入培養皿，每皿大約15mL，靜置凝固備用。
3.土樣的采集及稀釋
于校園不同地點采集土壤樣品；取樣時，用取樣器向下打取1cm左右深度的土樣，將從各個地點取得的土樣混合；取樣點最好選擇有機質豐富的地方。
4.富集
稱取5.0g混合土樣和0.5g淀粉混合，并加入適量的蒸餾水使其濕潤，置于培養皿中富集培養24h。
5.菌種的初篩
稱取1.0g步驟4所得的土樣加入無菌試管中進行梯度稀釋，即加入9mL無菌生理鹽水，振蕩后靜置，待土壤顆粒沉降后，取上層液1mL轉移至另一無菌試管，加入9mL無菌生理鹽水，搖勻；從第二支試管中取出1mL轉移至第三支無菌試管，加入9mL無菌生理鹽水，搖勻；再從第三支試管中取出1mL轉移至第四支無菌試管，加入9mL無菌生理鹽水，搖勻。如此即得到稀釋倍數分別為10倍、100倍、1000倍的土壤稀釋液［圖6-2（a）］。
用移液槍分別吸取稀釋100倍和1000倍的樣品液100μL，加入至已凝固的培養基表面，用涂布棒涂布均勻。將涂過樣的培養皿倒置放置，于30℃培養箱里培養24h，觀察菌落透明圈的出現情況。
6.菌株的純化
用接種環挑取長勢良好且透明圈直徑與菌落直徑的比值較大的菌落于平板上劃線分離，培養一定時間，進一步分離能形成透明圈的單菌落，并在斜面培養基中保存［圖6-2（b）］。
圖6-2 菌株的初篩與純化
五、注意事項
1.倒平板之前務必將培養基搖晃均勻。
2.無菌操作要規范，菌株的分離和純化要在超凈工作臺中完成，亦可使用酒精燈，直接在實驗臺上完成。
六、作業及思考題
1.菌落產生透明水解圈的觀察
用直尺分別于不同方向測量菌落和水解圈的直徑大小，求平均值，并計算透明水解圈直徑與菌落直徑的比值，填入表6-1。
表6-1 不同菌落產淀粉酶能力的比較
2.菌落的形態觀察
觀察并描述分離所得菌株的菌落形態，以大致了解產酶菌株屬于哪一類菌。
3.所用的涂布平板法或劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請分析原因。