1.6　降低酶糖化過程成本的策略

1.6.1　提高纖維素酶的產量

纖維素生物利用商業化的主要障礙是纖維素酶的水解效率低、用量大，酶制備的成本高，導致纖維素酶糖化過程的成本較高。各國科學研究者通過優化產酶條件、選育高酶活的纖維素酶生產菌株及通過基因工程和蛋白質工程對酶蛋白分子進行改造等來提高纖維素酶的產量。利用物理、化學誘變劑單獨或復合處理微生物孢子或細胞是選育纖維素酶高產菌種的有效方法。纖維素酶產生菌一般有細胞生長和酶分泌兩個階段，通過優化菌齡、接種量、pH和溫度等因素，在分批發酵和分批補料發酵中實現第一階段菌物的大量生長和第二階段酶的最大合成。在纖維素酶的成本中培養基和碳源占很大的部分，這樣研究廉價的碳源和高效的培養基是非常必要的。可溶性碳水化合物，如乳糖、木糖和纖維二糖因為可以導致細胞的快速生長和誘導纖維素酶的分泌被廣泛研究，但高昂的價格是其工業化利用的障礙。木質纖維素價格低廉，可以被大量利用。纖維素是很好的碳源和誘導物，但只有把纖維素降解成單糖才可以被吸收利用而使菌種生長速度放慢。通過在纖維素中加入可溶性碳水化合物可以提高菌物的生長。優化木質纖維素的預處理技術，使預處理后的原料可以較容易地被菌種利用。培養基中的氮源、磷、鎂、鈣和微量元素對于纖維素酶合成的影響也很大。

基因工程技術的局限性在于無法實現菌株纖維素酶的全部表達，所得酶不能徹底降解纖維素。由于缺乏纖維素結合域，基因工程纖維素酶不能水解結晶狀態的纖維素。另外，基因工程纖維素酶也不能克服木質素、木聚糖的障礙。因此，利用基因工程技術生產有效降解纖維素的纖維素酶還需要做大量的研究工作。

1.6.2　改進纖維素酶的特異活性

纖維素酶的特異活性可通過增加纖維素酶的耐熱性、減少纖維素酶的非特異吸附、降低終產物抑制和優化纖維素酶各組分的比例來實現。纖維素酶的耐熱溫度增加10℃，將導致酶解得率增加2～3倍[109]。纖維素是固體物質，酶首先要吸附到纖維素分子上才能對它進行作用。非特異吸附是指酶水解過程中，纖維素酶吸附在木質素或纖維二糖上，使酶解得率下降。減少非特異吸附可從改進纖維素酶分子的疏水性和通過基因工程構建弱的木質素吸附酶上著手，以減少酶解過程中纖維素酶與木質素的非特異性吸附。改善和平衡纖維素酶中內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的比例，可以更有效和最大化降解纖維素成葡萄糖。

木質纖維生物質原料的高效酶水解不僅需要高活力的酶產品，同時還需要配比合理的酶系組成，研究各酶組分的功能和優化酶系組成可以顯著地提高酶解得率和效率。Zhou[110]通過響應面分析方法優化了纖維素酶的組分，構建了一個新的纖維素酶體系（Cel7A 19.8%，Cel6A 37.5%，Cel6B 4.7%，Cel7B 17.7%，Cel12A 15.2%，Cel61A 2.3%和β-葡萄糖苷酶2.8%），此新酶體系對蒸汽爆破玉米秸稈顯示了高的水解得率，且葡萄糖轉化率是原酶制劑的2.1倍。Jing[111]構建的新纖維素酶體系，當濾紙酶活∶內切葡聚糖酶酶活∶纖維裂解酶酶活∶β-葡萄糖苷酶酶活∶果膠酶酶活為0.6∶1∶0.3∶1∶2.6時，水解豌豆桿的得率提高了10.90%。木霉纖維素酶存在β-葡萄糖苷酶先天不足的特點，最簡單的解決方法是適當的添加一定數量的β-葡萄糖苷酶。

1.6.3　酶糖化促進劑

在酶水解過程中加入糖化促進劑（如表面活性劑、蛋白質和氨基酸），能極大地提高水解效率，酶解促進劑能夠阻斷纖維素酶與木質素的不可逆吸附[112～114]。在蒸汽爆破云杉酶糖化過程中加入聚乙二醇（PEG），水解16h，酶解得率從42%提高到78%；且Cel7A的吸附從81%降低至59%；木質素中的疏水基團與PEG中的—CH2—發生作用，苯環上的氫與PEG中的O形成氫鍵，使木質素對PEG的親和性高于纖維素酶，且由于PEG吸附在木質素上，PEG的長鏈結構從木質素表面伸出，阻止了酶的靠近[113]。Zheng[114]研究了Tween-20、Tween-80和牛血清蛋白（BSA）的添加對纖維素酶水解稀酸處理的黑麥草的影響。結果表明每克絕干底物添加0.1g的Tween-20，酶解得率提高了14%。添加酶促進劑增加水解效率的主要原因為外源蛋白或者表面活性劑首先與木質素結合，從而減少木質素與纖維素酶的無效吸附；而對于表面陽離子聚電解質，主要是通過電荷補丁或橋接的作用，增加內、外切葡聚糖酶在纖維素表面的吸附量，進而提高酶水解效率。但是，這些外源蛋白價格昂貴，增加了酶水解工藝過程的總成本，并且部分表面活性劑在攪拌的情況下容易起泡，給實驗操作帶來不便。

金屬離子（K＋，Mg2＋，Ca2＋，Al3＋，Mn2＋，Fe3＋，Cu2＋和Zn2＋）對酶水解也有不同程度的影響。Mg2＋和Ca2＋與木質素磺酸鹽形成一種金屬和木質素的配合物，可使木質纖維生物質表面的自由木質素發生沉淀，表面的結合木質素由于與金屬離子結合減少了纖維素酶與結合木質素的無效吸附，進而增加可發生有效糖化的纖維素酶的量，從而最終提高木質纖維素酶水解效率。然而，盡管Mg2＋和Ca2＋對酶水解有促進，兩者大量使用會對后續乙醇蒸發的結構產生較大影響。因此，金屬離子的使用在工藝上的可行性及其對木質纖維生物質酶水解的促進機制還有待進一步研究[115～117]。

1.6.4　有效的預處理方法

由于木質素、半纖維素對纖維素的保護作用以及纖維素自身的晶體結構，使得木質纖維生物質形成了致密的結構，酶制劑很難與纖維素接觸，直接影響后續的酶糖化過程。酶解未處理的和經蒸汽爆破（T＝220℃）處理的太陽花桿，酶解得率從18%提高到72%，葡萄糖得率從6.1g/100g底物提高至16.7g/100g底物[118]。先用稀酸浸泡，再用濕爆法（蒸汽爆破和濕氧化結合的一種預處理方法）預處理能源作物－Miscanthus（芒屬植物），結果表明稀酸浸泡能除去63.2%的木糖和損失5.2%的葡萄糖，直接酶解稀酸浸泡的Miscanthus，葡萄糖得率為24%～26%；酶解濕爆的Miscanthus，葡萄糖得率為37%；酶解先稀酸浸泡再濕爆的Miscanthus，葡萄糖得率達到63%[119]。主要是由于在稀酸浸泡和濕爆過程中，半纖維素很快解聚，導致纖維原料的孔隙率增大，增加了纖維素酶對底物的可及性。當然這種方法是否適用于將來燃料乙醇的工業化生產，還得進行進一步的經濟分析。總之，一個好的預處理方法應該是提高后續的酶解得率、產生盡量少的發酵抑制物和操作費用盡量低。

1.6.5　同步糖化發酵

在纖維素酶解的同時加入酵母，不斷的移走終產物對酶解的影響，乙醇得率將增加4倍左右。該法的主要優點有：①首先在纖維素酶的作用下，釋放的葡萄糖由微生物將其轉化為乙醇，消除了葡萄糖因濃度過高對纖維素酶的反饋抑制，提高了糖化效率；②提高水解速度，且酶的用量較小；③得到高的乙醇產量；④簡化了設備，降低了能源消耗，節約了總生產的時間。同步糖化發酵法存在的一個主要問題就是糖化和發酵的最適溫度不一致。一般來說，糖化的最適溫度高于50℃，而發酵的理想溫度低于40℃。為了解決這一矛盾，研究者們提出了非等溫同步糖化發酵法。但也有研究表明，非等溫同步糖化發酵法并不能提高乙醇產率。另外，選育耐熱酵母菌也是解決此矛盾的一條途徑。

1.6.6　纖維素酶的回收利用

酶水解結束后，纖維素酶存在于水解上清液和酶解殘渣中。上清液中的纖維素酶稱為游離酶，酶解殘渣中的纖維素酶稱為結合酶。早期的研究工作已經表明里氏木霉纖維素酶穩定性好，對纖維素有高的親和力，故在木質纖維生物質的轉化過程中回收纖維素酶是可行的[120]。自由酶可以再吸附到新鮮底物上，結合酶脫附后也可重新吸附到新鮮底物上。自由酶的回收可以通過超濾和補加新鮮底物的方法。通過調節pH值和添加表面活性劑使纖維素酶從底物上脫附，是回收結合酶的方法之一。纖維素酶的回收的首要難題是β-葡萄糖苷酶的回收。β-葡萄糖苷酶相對分子量為70～114kDa，作用底物為纖維二糖和纖維低聚糖，不吸附于纖維素底物，酶解過程中始終游離在上清液中。它不吸附的原因之一為酶蛋白上沒有纖維素的結合域（CBD），如果有CBD的存在，則對纖維素酶各組分的回收就可實現一步法，即酶解結束后補加新鮮底物讓纖維素酶重新吸附的方法同時回收纖維素酶的各組分。Ong把CBD基因轉入β-葡萄糖苷酶中取得了成功，且證明擁有CBD基因的β-葡萄糖苷酶對纖維素有很高的親和力[121]。

盡管各國科學研究者對纖維素酶的回收技術已取得很多進展，但這些技術還是很難應用于工業。主要是因為酶水解結束后，大約有60%的纖維素酶吸附在底物（木質素和纖維素）上，這些酶的回收主要通過添加新鮮底物的方法。但是隨著纖維素酶的循環使用，木質素也在不斷的累積。木質素含量的增加又會吸附大量新鮮的纖維素酶，從而又影響水解得率。對上清液中的酶，超濾回收纖維素酶和β-葡萄糖苷酶無疑是一種值得研究的技術。但是超濾膜費用昂貴，生產1加侖（1加侖＝3.785L）乙醇超濾膜的費用大約為12美分[122]，并且使用幾輪之后，纖維素酶蛋白和木質素對膜的損害較大。