1.2　細胞周期

細胞周期（cell cycle）是指細胞的一系列可鑒別的周而復始的生長活動。這些活動的順序不變，完成一個活動后才能進行下一個活動。典型的真核生物細胞周期如圖1-19（a）所示：S、M和G1、G2分別代表DNA合成、有絲分裂期和兩次間隙。若生長速率因養分多寡而改變，S、G2和M幾乎不變，只有G1改變。原核生物在低生長速率下的細胞周期與真核生物相似［見圖1-19（b）］，其染色體復制期C相當于S；細胞分裂期D相當于G2+M；C和D不隨生長速率變化，只有G1可變動。有證據表明，C和D也略有變化，假設其不變，考察細胞周期的各項活動如何去適應生長速率變化的需要。

1.2.1　染色體復制與細胞分裂的調節

大腸桿菌和枯草桿菌只有一個環狀染色體，其復制是從原點向兩個方向進行。單一染色體復制所需時間相當恒定，大腸桿菌在37℃一般需40min。染色體的復制需精確控制，分裂時每個子細胞所得的遺傳物質是完全一樣的。細胞分裂緊隨DNA合成之后。凡能抑制DNA合成的因素也會抑制細胞的分裂，結果形成很長的細胞。

在高速生長下，如細胞周期為30min，染色體復制不能在一個周期內完成。為此，前一輪復制還未結束，后一輪復制又在原點上啟動，如圖1-20所示。可以把C期的啟動和終止，以及細胞分裂看作是不可更改的活動順序，稱為C+D周期。若增代時間少于C+D時間，C+D周期重疊，其重要特征是分配到子細胞的染色體已開始新的一輪復制，這類染色體稱為二叉染色體（dichotomous）。染色體復制和細胞分裂的調節規律如下；①染色體復制未完成，細胞就不會分裂。不管生長速率如何，大腸桿菌的細胞分裂總是出現在染色體復制完成之后。②不管生長速率如何，C和D所需時間大致不變。③C和D可以依次或同時（指上一輪的D和下一輪的C）進行。

1.2.2　染色體復制的啟動

染色體復制的啟動受啟動因子（origin，一種特異調節性蛋白）的正向控制。當啟動因子增加到某一臨界水平，啟動便開始。在這以后啟動因子被毀或稀釋。合成啟動因子達到有效濃度所需的時間恰好等于培養物增代時間。大腸桿菌在啟動時的啟動因子數量與細胞質量之比在各種生長速率下是一定的，這一比例實際上是染色體啟動因子的濃度。細胞似乎能檢出啟動因子的濃度，當它達到一臨界值時便啟動新一輪的復制。啟動的直接后果是啟動因子的濃度提高一倍。啟動不會重新發生直到其濃度因生長而降到臨界值。這種控制機制構成一種生物鐘，它是以細胞體積或其他有關參數為依據。據此，染色體復制的啟動頻率是DNA合成速率的控制步驟。

啟動總是在染色體上的專一位置上進行，此位點稱為復制或染色體原點。啟動和復制是性質截然不同的兩種過程。證據有三：曾檢出其產物負責啟動而不負責隨后復制的基因；加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白質合成，除去營養缺陷型所需的氨基酸都能阻止啟動，但允許復制繼續完成；培養物進入穩定生長期后，中止生長的細胞含有完整的染色體。細胞分裂是與染色體的完成復制同步的，這樣，在隔膜形成前每個子細胞會獲得其DNA。顯然，當DNA復制完成時合成了一種“中止蛋白”，也正是這種蛋白啟動隔膜的形成與分裂。

1.2.3　細胞周期的研究方法

1.2.3.1　鏡檢法

用電子顯微鏡觀察單個細胞的生長并定時拍照，由此發現大腸桿菌在分裂時細胞大小的變化不大。這說明似乎存在一種控制細胞大小的因子，即啟動細胞質量。

1.2.3.2　同步培養法

同步培養法（synchrony）有密度梯度離心沉降法和過濾洗脫法。

（1）密度梯度離心沉降法　這是按細胞的大小/年齡把在對數生長期的培養物分級。近來，采用H2O/D2O密度梯度沉降法。其優點是能應用于任何品種，不會施加滲透壓強的影響。從某一密度帶便可分離出同質的細胞群體并加以培養。圖1-21顯示細胞大小的分布頻率與蛋白質合成速率的關系。

（2）過濾洗脫法　將細胞黏附在固體支持物，如硝化纖維膜上，然后將其倒置，讓生長培養基從上到下通過，新生的細胞便被洗脫到培養基中，呈一種特征性的振蕩模式，見圖1-22。

在初始沖洗（wash-off）期后從濾膜上洗脫下來的主要是新分裂的細胞。在洗脫曲線高峰處從膜上洗下的細胞是沉積在膜上的新生細胞后代，在低峰處洗下的是其沉積時正要分裂細胞后代。

1.2.3.3　同位素示蹤法

如親本培養物沉積在濾膜上之前用氚標記胸苷使細胞帶上標記，則結合到洗脫細胞的標記量與結合到親本培養物那一年齡細胞的標記量成正比。圖1-23（a）顯示實驗結果的理論曲線。此培養物的增代時間為65min，C和D分別等于40min和20min。圖1-23（b）顯示的實驗結果和那些預測的幾乎完全一致。此方法的缺點在于洗脫分布有噪聲，經幾個細胞周期后很快便偏離洗脫曲線的理論值。在低生長速率下洗脫曲線的噪聲使數據的定量解釋變得很困難和主觀。

另一種研究細胞周期的方法是通過蔗糖密度梯度離心，使一對數生長的培養物沉淀，收集最上層的細胞，在含有氚標記胸苷的生長培養基上生長，測量其DNA合成速率。從圖1-24可見，第一個細胞周期比初始的培養物的平均細胞周期要長，第二個細胞周期要短些。這可能是誕生時細胞個子分布在平均值上下。過后，效率更高的細胞比個體最小的那部分細胞更占優勢。

1.2.4　生長速率與細胞大小的關系

生長培養基越豐富，細菌生長速率加快，其細胞也越大。如在同一種培養基內改變溫度也會影響生長速率，但對細胞大小幾乎沒有多大影響。如一細胞的增代時間為60min，在細胞分裂結束時染色體復制便開始啟動。假設細胞這時具有質量為m（啟動細胞量=1/啟動因子濃度），從圖1-25可見，個體細胞的量呈指數增加，直到2m，細胞便開始分裂。如此時從培養液中檢出新生的細胞，置于較豐富的培養基（能使菌快速生長，增代時間為35min）中，并假定細胞迅速調整到新的生長速率。這樣，個體細胞量增長速率往上移動，如C+D規律還適用，下一個細胞分裂的時間不會變動，但細胞會增大。新一輪復制的啟動將在細胞分裂前便開始。換句話說，C+D周期開始重疊。快速生長經一個細胞周期后便達到新的平衡。生長速率越快，細胞大小的差異也越大。可用式（1-25）表示細胞周期t對指數培養物的細胞平均大小m的影響。

　　 （1-25） 　　

式（1-25）曲線的形狀將取決于C、D和K是否變化，只有在簡單情況下lgm與t作曲線才會得一直線。將生長穩定期的培養物移種到新鮮培養基中，經短暫停滯后細胞先變大，接著細胞中的DNA含量增加，細胞數目隨后也在增加，見圖1-26。當培養物進入生長穩定期后，細胞先漸漸變小（這是細胞量增長速率下降后細胞分裂繼續指數地進行的緣故）。這時細胞中的DNA含量也在逐漸減少。細胞數目的增長隨后下降，直到進入生長穩定期為止。

1.2.5　生長速率對細胞內DNA含量的影響

細胞中的DNA含量隨生長速率的增加而下降，可用式（1-26）表示：

G/m=［t/（KCln2）］（1-2-C/t）　　（1-26）

式中，G是基因組的當量，為每個細胞的DNA平均值。

圖1-27展示生長速率對DNA濃度和染色體構型的影響。這組曲線顯示以啟動細胞量為單位的生長隨時間的變化。一個啟動細胞量單位含有一個剛開始一輪復制的染色體。用一水平線C表示時間（min），它在縱軸上所處高度代表細胞量。假定細胞量的復制時間為70min，見圖1-27（a），將出現復制期的間隙。當細胞量增加到3倍時它將完成4個復制好的染色體。如在初始時把細胞置于增代時間為40min的培養基內，見圖1-27（b），則新復制期將緊跟在上一復制完成之后開始，它們之間不存在間隙。待細胞量增到3個單位時，下一復制期將不會完成。結果得到2條復制了一半的染色體，DNA濃度下降到3/3。如將細胞置于增代時間為20min的培養基內，在第一復制期還未完成前下一復制期已開始。當細胞量達到3時，只有一個帶三個復制叉的染色體，見圖1-27（c），DNA濃度進一步下降到2.25/3。

圖1-27說明了生長速率如何影響染色體上不同位置的相對基因拷貝數。在一隨機的指數培養物中，接近原點處的基因，其拷貝數總是居多，靠近兩端的較少。這種相對基因劑量的傾斜度隨生長速率的增加而提高。它也取決于復制時間C。一般認為二叉復制導致染色體原點附近的基因數目的增加。其實并非如此，DNA的濃度隨生長速率的增加而下降，從而不同程度地影響基因濃度。那些靠近染色體原點的基因濃度沒有變化；位于中間的基因平均濃度則只有原點周圍的一半左右；處在染色體復制近末端的基因濃度最低。據此，對生長速率有限制作用的基因應位于靠近染色體原點處。其實，這是為什么大腸桿菌中有6個拷貝編碼核糖體RNA的基因都聚集在原點附近的緣故。

1.2.6　生長速率對細胞組分的影響

一般來說，細菌生長越快，其個子越大，含RNA越多，其中大部分是核糖體。生長速率隨核糖體含量線性地增加。這是由于核糖體是蛋白質合成的速率限制步驟。實際上，每個細胞RNA隨生長速率的變化可以達10倍之多。在快速生長的細胞中RNA的含量可以達到細胞重量的30％。每個細胞的DNA也隨生長速率的提高而增加，但程度低一些。因此，以細胞重量衡量，DNA含量是減少的。細胞外殼的厚度通常不變，胞壁和質膜在整個細胞中的比例隨細胞個子的增大而減小。