1　微生物生長與調節

1.1　微生物的生長

活細胞的最基本的生命特征是生長和繁殖。對生長的定義不同學科的學者有不同的見解。細胞生物學家關注單細胞的形態變化，特別是細胞的分裂方式；而生化學者對成千個與生長有關的酶反應、動力學及代謝途徑感興趣，認為生長是所有化學成分有秩序地相互作用的結果。生物物理學者則認為，細胞是熱力學不平衡的開放系統，與其周圍環境進行物質與能量的交流，特別表現在熵的溢流上。生化工程師把生長看作是生物催化劑數量的增長，通常以質量和細胞數目的增長來表達細胞的生長。分化（differentiation）則是生物的細胞形態和功能向不同的方向發展，由一般變為特殊的現象。

為了控制菌體的生長，需要了解生長的方式，細胞分裂和調節的規律，測量微生物生長的各種辦法，微生物生長繁殖的形式與工業生產的關系，環境變化對微生物生長的影響。在此基礎上設計合理的培養基配方和工藝條件。有許多跡象表明，微生物的分化和產孢子的過程與次級代謝產物的合成有某種聯系。因此，研究微生物的生長分化規律無疑是發酵調控原理的一個重要組成部分。

1.1.1　生長的形式

為了測量微生物的生長，需研究不同類別微生物的生長性質，確立其生長測定的若干原理。研究的對象將主要放在工業生產菌種上，著重研究其遺傳背景、復制的機制和生長的形式。

1.1.1.1　細菌的生長

細菌屬于原核生物。其代謝方式盡管各式各樣，但都有相似的細胞結構和繁殖機制。根據革蘭氏染色的不同，可分為革蘭氏陽性和陰性細菌，前者的細胞壁的主要組成是含有30分子層的多糖胞壁質；后者的細胞壁主要是由單層的多糖胞壁質，以及脂多糖和脂蛋白組成。原核生物沒有核膜和細胞器。

細菌是通過一分為二的裂殖過程繁殖的。新生的兩個細胞具有相同的形態和組成，其細胞組分、蛋白質、RNA和基因組是一樣的。細胞的分裂，如圖1-1所示，是由細胞壁的向內生長啟動的，最終形成一橫斷間隔，繼而間隔分裂，形成兩個相同的子細胞。每個子細胞均保留親代細胞壁的一半。這兩種菌的細胞壁合成方式不同，陽性菌是沿著中緯帶，而陰性菌是沿著整個細胞壁，以居間并生方式合成的。

細菌的菌齡一般以培養時間表示，但實際上其真實菌齡應以繁殖的代數表示。細菌的個體很小，一般為1μm左右。它們以單個、成雙、呈鏈或簇狀存在，有些帶鞭毛，能運動，有些能形成芽孢。典型細菌的濕重為1.05～1.1g/cm3，單個細胞的干重約為10-12g，其密度為1.25g/cm3。有些細菌（如大腸桿菌）的倍增時間在最佳生長條件下為15～20min，在一般情況下為45～60min。細菌的大小隨生長速率而異（見1.2.4節）。細菌在雙碟上的菌落形態具有種的特異性。

1.1.1.2　酵母的生長

酵母屬于真核生物，它不形成分生孢子或氣生菌絲。在其生長周期中部分時間以單細胞形式存在。其常見的生長方式是出芽繁殖，酵母細胞的體積起初逐漸增大，到一定程度便開始出芽。在芽成長期間母細胞加上子芽的體積幾乎維持不變，芽長大的同時母細胞縮小，如圖1-2所示。

在子細胞與母細胞間形成橫隔后，子細胞脫離。新生的子細胞比其母細胞小些，生長速率快些，最終長成跟母細胞一樣。子細胞脫離后在母細胞表面留下一個芽痕。按其出現的位置可將酵母芽殖方式分為兩類：一類是兩極性，母細胞輪番在其兩端同一位置上萌芽；另一類是多極性的，母細胞萌芽每次出現在不同的位置上，如釀酒酵母。從芽痕的數目有可能確定酵母的菌齡。如子細胞不與母細胞脫離，便形成鏈狀，稱為假菌絲，見圖1-3。酵母細胞大小取決于其生長速率，其倍增時間愈短，細胞愈大。

Yoda等對酵母的泡囊運輸與高爾基體作過一篇較全面的綜述［1］。酵母細胞構建了一種復雜的胞內膜系統，把細胞分隔成幾個能就地進行高效生化反應的間室。它們也建立了輸送適當材料到各間室中去的系統。泡囊運輸是一種連接細胞中大多數主要細胞器的投遞系統。高爾基體占據了內質網與核內體（endosome）/液泡、質膜之間的交通中心位置。投遞是通過材料的成熟與分揀過程。他們通過研究高爾基體，鑒別了泡囊運輸的每一種特性。現已能充分地從分子水平解釋如何借材料的分揀，給體萌芽，拴接，入塢與融合到目標處來進行運輸。泡囊的生成、消耗的循環過程見圖1-4。

待分泌的蛋白質從內質網被集中于罩上外衣的COPⅡ泡囊，然后輸送到早期高爾基體間室，在那里被修飾，分類和輸送到其最終目的地。可溶性蛋白與膜蛋白通過其固有的固位機制維持其適當的定位作用。這類固位機制部分涉及蛋白質-蛋白質的相互作用與逆行輸送到罩上外衣的COPⅠ泡囊處。

1.1.1.3　菌絲的生長

霉菌和放線菌均為絲狀微生物。其生長方式是孢子發芽，長出芽管，形成菌絲（hyphae），末梢伸長、分枝（圖1-5）和交錯成網（圖1-6），稱為菌絲體（mycelium）。早期的生長靠孢子固有的養分，長成一定長度其橫切面有間隔膜的菌絲后，靠吸收培養基中的養分生長。真菌屬真核生物，為多細胞，且每個細胞含有多個細胞核和各種細胞器。細胞一旦形成后便保持其完整性，且其菌齡與相鄰細胞的不同，越靠近末梢的菌絲越年輕。放線菌、鏈霉菌和諾卡氏菌屬均屬于放線菌，為原核生物，革蘭氏染色呈陽性。它們無核膜和細胞器，其菌絲直徑（約1μm）比霉菌（2～10μm）細，易折斷。許多真菌能形成孢子，稱為分生孢子。

圖1-6顯示產黃青霉菌絲團形成與解體過程的形態變化。菌絲團（球）生長的密實程度受培養條件（如攪拌、供氧和溫度）的影響，特別與碳源的性質有關。已知使產黃青霉生長過程中菌絲團變得密實的條件有：過程添加易利用的碳源，如葡萄糖；攪拌加快；供氧改善。反之，用乳糖、攪拌緩慢或供氧跟不上，則菌絲團變得疏松。如溶氧低于某一臨界值，菌絲則不成菌絲團，結果發酵液的黏度增加，攪拌效果差，溶氧更低，導致菌的生長和產物的合成受到嚴重的影響。因此，控制球狀產黃青霉的生長狀況成為青霉素高產的關鍵之一。

菌絲長度受遺傳控制并與生長環境有關。在沉沒培養時以分散的菌絲體或菌絲團（球）形式存在。環境對菌絲生長的形式有很大影響，如在深層培養時易受攪拌器的剪切作用，反過來，菌絲生長的形式亦會影響菌絲團內部的理化環境。菌絲團內細胞所處的環境與菌絲團外部或分散生長的細胞所處的不同，如圖1-7所示，菌絲團內部的營養物質與代謝產物的分布是不均勻的。由于分解代謝和擴散阻力，越靠近菌絲團中心，養分濃度越低。菌絲團大而緊會因內部缺氧和養分而自溶。此外，菌絲團內部代謝產物的積累會使菌的生長處于不利的環境中。

1.1.1.4　細胞群體的生長

細菌借二等分分裂繁殖，但兩個子細胞可能以不同的生長速率生長，其分裂也不一定同步。因此，在一正在生長的群體中存在范圍廣的不同世代時間（generation time），故群體的“倍增時間”（doubling time）這一術語通常是指測量的時間，而不是平均世代時間。盡管個體世代時間有不同，一般，只要外界環境無太大變化，細胞群體以相對恒定的倍增時間增殖。因此，細胞群體（數目N）經培養一代時間（td），便產生2N個子細胞，再過一代便得22N個子細胞。這一進程可用指數系列表示：

20N0→21N0→22N0→23N0→24N0→2nN0

式中，N0為初始群體數目；n是經時間（t）的培養物倍增的次數。

由此可得：n=t/td。

因此，在n次倍增后細胞的數目（Nt）與初始細胞數目的關系可用式（1-1）表達：

　　 （1-1） 　　

以對數方式表示，得：

故以細胞數目的對數與培養時間作曲線可得一直線，其斜率為0.693/td。

另一種表示生長速率的方法是，假定在任何時間（t）與細胞數目的增長速率（dN/dt）正比于已經存在的總細胞數目，則得：

　　 （1-2） 　　

式中，μ是一常數，一般稱為比生長速率，h-1。

式（1-2）經積分得：

由此，可確立比生長速率與倍增時間之間的關系。對應倍增時間t=td，Nt=2N0的培養物：

　　 （1-3） 　　

由于生物量（biomass）的測定一般比細胞數目的測量要準確，基本的生長方程式通常用質量而不是數量來表達。常規表示菌濃和比生長速率分別用x和μ表示（）。

比生長速率μ受環境條件的影響很大。在自然界生態系統中微生物的比生長速率的變化很大，而在實驗室，可以控制培養物的比生長速率長時間不變。

1.1.1.5　細菌群體的生長周期

將少量細菌接種到適當的培養基中，一般不會立即開始生長，存在一可變的停滯期（lagphase）。一旦生長開始，便很快（常少于10次倍增時間）進入對數或指數生長期（logarithmic or exponential phase）。然后，生長中止或達到一種動態的平衡，于是培養物便進入所謂靜止期（stationary phase），這以后細胞逐漸死亡和自溶。故細菌的生長周期一般可分為停滯期、指數生長期和靜止期。

（1）停滯期　剛接種后的培養物，如原來已進入靜止期，便需要有一段較長的適應時間生長才能恢復，因在靜止期細胞的化學成分曾發生顯著的變化（后面還會詳細介紹）。如接種的種子仍處在指數生長期，停滯期一般會短許多，甚至無。若細胞接種到和原來的成分大不相同的培養基中，即使原來生長旺盛的細胞，其停滯期也會延長。有許多因素是通過阻礙細胞的適應和（或）生長過程來使停滯期延長的。尤其是小接種量的培養物比大接種量的培養物對這些因素更為敏感。例如，某些固氮菌在固定氮時對氧非常敏感。接種量小的培養物在新鮮氧飽和的培養基中無法固定氮而不能生長，而接種量大的培養物很快將培養基中的氧消耗到不至于阻礙氮的固定，故生長可以繼續。同樣，即使是異養菌，對CO2也有一定的需求，一般分解代謝生成的CO2完全能滿足其自身的需求。然而，接種量過小而前期又劇烈通氣攪拌和pH小于7的情況下，需CO2的反應受阻，從而影響生長。在這種情況下添加低濃度的TCA循環中間體，如延胡索酸、琥珀酸或蘋果酸可能會“點燃”生長。

通常，從不太能滿足需求的培養基移種到較能滿足需求的培養基，其停滯期縮短；相反，如培養物從豐富培養基移種到貧乏培養基，停滯期一般會延長。這是由于受豐富培養基組分阻遏的生物合成必須重新啟動后生長才能恢復。但這種情況對自養菌不適用，因復合有機養分的存在會抑制其生長。

（2）指數（對數）生長期　停滯期可看作是代謝調整階段，不久便會進入細胞高分子組分的平衡合成（即生長）和繁殖階段。如前所述，比生長速率受環境條件，特別是培養基的豐富程度（主要是碳源）的影響。一般異養菌在含有復合有機成分，如氨基酸、嘌呤、嘧啶和維生素等的培養基中的生長比在簡單的礦物鹽培養基中要快。通常，在補充有碳源，特別是含葡萄糖的礦物鹽培養基中的生長比其他碳源快些。

對兼性厭氧菌來說，有氧下的生長通常比無氧快些。這反映出在有氧條件下微生物合成ATP的效率更高。此外，生長在需要花費更多的能量來同化的基質，如硝酸鹽，比花費能量少的，如氨，通常要慢些。溫度、pH、滲透壓等對生長的影響，請參閱1.1.3節。

（3）靜止期　一些必需養分隨生長不斷消失，終產物卻以指數方式增長。待主要養分耗竭，生長也就中止。在含有有限的碳源的合成培養基中從指數生長期轉到靜止期是突然的，但對生長在復合培養基的培養物，其過渡時間較長，一些輔助的碳基質（主要是氨基酸）先后耗竭。“靜止”并不是指所有的生化活動都停止。進入靜止期確實常出現很大的代謝變化。對產芽孢的細菌，如枯草桿菌，某些養分的耗竭啟動相繼的形態變化，隨后在母細胞內形成高度穩定的休眠芽孢。細胞在形成芽孢的過程中在代謝方面不是靜止的，而是順序合成許多酶和新化合物。

靜止期的出現也不總是必需養分缺乏的緣故。生長通常伴隨pH的改變，有時這一改變也會抑制細胞的進一步合成。即使生長在中性糖中和產生唯一的分解代謝終產物CO2，也可能引起pH的顯著移動。這可能是由于陽離子（、K+和Mg2+）與陰離子（、）的吸收比例失調。例如，枯草桿菌可能含有占干物質12％的氮和5％的鉀，而細胞的磷和硫含量分別為3.5％和0.5％ DCW（細胞干重）。因此，被同化的、K+與、的分子比為7，其電荷比為2.5。在革蘭氏陰性細菌中也存在類似的不平衡，盡管細胞鉀和磷的需求低許多。細胞生長在葡萄糖為唯一的碳源中會使培養液的pH不斷下降，除非初始培養基加有強緩沖劑。相反，生長在乙酸鹽、乳酸鹽或琥珀酸鹽中會使pH升高。這是由于陰離子的消耗比陽離子多所致，生長常由于pH的升高而停止。

1.1.2　生長的測量

微生物的數量是微生物和其他生物過程的很重要的過程狀態變量。要了解生物反應系統中生物催化劑的效率就離不開此狀態參數。生物的代謝活動與菌的生長直接相關，為此，需要獲得單位細胞量的養分消耗與產物形成的信息。菌量是可利用的生物催化劑的一種簡單度量，它在生長速率與產物合成、得率系數以及比速率和物料衡算方面是一關鍵的參數。菌量的測定對次級代謝物的生產尤為重要，如所需產物為菌的代謝產物，便存在菌的生長、菌體濃度的優化控制問題。如生產菌的濃度（X）低，合成產物的數量P（=QX）不會多；菌生長過于旺盛，如X?XC（臨界菌濃），則菌的比生產速率Q（表征菌的生產能力）降低，產量P也不會高。故優化菌濃是工藝控制的一重要環節。那么，菌濃可用什么方法表示和測量？通常單細胞生物以細胞的個數或重量表示，菌絲體則以重量表示；也有用細胞的某一代表性組分（如核酸含量）或代謝活動（如呼吸的強弱）來表示。在含有非細胞性固體的培養液中難以用直接方法測量細胞的數目和干重。據此，有不少研究者在尋找一種能用于這種情況的準確有效的方法。這方面的進展，將使發酵工藝控制技術躍上一個臺階。無論用什么方法，在解釋結果時應謹慎從事。在實際生產過程中可將菌濃的測量分為在線和離線兩種。優化取樣的時間很重要，可節省精力，以及獲得更多的與生長有關的信息。Singh等對生物量測定作了較系統和全面的綜述［2］。

1.1.2.1　細胞數目的測量

細胞數目的測量可采用以下幾種方法，表1-1列舉了它們依據的原理、優缺點和適用范圍。

（1）庫爾特計數器　此裝置的原理如圖1-8所示，經稀釋的培養物被置于含有電解質的容器內，里面放有一根管子，在管內與容器內各安上一電極，以形成一電位差。抽真空使預先定量的液體穿過小孔進入管內，每一個細胞通過小孔時電阻增加，電流下降。電流下降的幅度與細胞體積成正比。采用一種脈沖強度分析儀，便可測出細胞的總數和細胞大小分布狀況。有各種孔徑的庫爾特計數器，孔徑為30μm的一種適用于測量細菌，但小孔易被灰塵堵塞。該儀器可計數到每秒500個細胞，測量一個樣品僅需幾秒鐘，每小時可自動處理40個樣品，效率是人工的50倍。

（2）流動式細胞光度計　這是一種把細胞分析與分揀結合在一起的儀器，如圖1-9所示。

培養物在液流中被稀釋，細胞被軸向地分開，當流動的細胞遇到激光光束時反射回的散射光可用于計數。如激光波長選擇在會使細胞發出熒光的波段中，這種熒光能反映出細胞的若干特性，從而可以分析細胞中的核酸、染色蛋白質或熒光抗體等物質的含量。此儀器還具有收集特殊細胞群體的功能。細胞分揀是讓含有所需細胞的液滴帶上電荷進行的。通過細胞的熒光信號可辨別所需的細胞。當液滴經過帶有電荷的偏轉板裝置時，所需的細胞液滴因帶電荷而偏轉向一收集器。用此裝置可計數、分析和收集大量特殊細胞，每秒可達3000個。此技術的關鍵在于能否使所需細胞帶上能檢出熒光或光散射標記，在篩選大量基因工程菌和產生單克隆抗體的雜交瘤細胞方面日益顯示其重要性。

Katsuragi等對流動式細胞光度計的應用作了一篇較全面的綜述［3］，特別是在細胞分揀方面可用于測量細胞的組分、肽和核苷酸的序列、細胞功能與酶的活性。

1.1.2.2　細胞量的測量

以細胞量來表征生長情況雖然有不足之處，但在工藝控制和工程上仍不失為一種切實可行的手段。在工藝控制上菌（體）濃（度）是一個重要的狀態參數，菌濃的失控將嚴重影響產物的合成。然而，工業發酵多數用含大量難溶的固體復合培養基，給菌量的測定帶來很大的困難。由于菌濃對工藝控制的重要性，各國研究人員想了許多辦法，尤其希望能在線獲得有關生長方面的信息，便于加強工藝控制。在工程方面如不能確定研究對象在過程中的數量變化，就難以有針對性地設計更為先進高效的反應器。一些間接參數，如呼吸強度、比生長速率、生產強度（比生產速率）和比基質消耗速率均需知道菌濃才能求得。

菌濃的測量先要將菌體從發酵液中分離出來。一般采用離心或過濾方法。前者的缺點是洗滌不方便，操作時間較長，離心過程中菌仍在活動，使菌量變化，細胞干燥后誤差較大；后者所需的樣品量少，易洗滌，時間短，但需防止細胞的流失，不適用于黏稠的樣品。其他一些方法的優缺點以及適用范圍見表1-2。

①如離心后細胞與非細胞固形物有明顯界限，可測量細胞所占體積，取一定量的濕細胞，烘干，稱重，計算其含水量，便可求得較準確菌濃。例如，將5.0mL濕細胞烘干后，細胞干物質占濕菌的20％，密度約為1.0g/mL，則菌濃=壓縮細胞體積/5（g/L）。

成像分析（image analysis）法對于微生物的分類和菌量的估算是一種有用的手段。發酵液的樣品用顯微鏡放大約10倍，圖像通過一成像分析軟件，用計算機處理，以求得菌的分類與計量。但這種方法仍需若干試探性調整，以調節其臨界值和排除干擾。

Krairak等采用成像分析來精確測量生產黃色色素的單孢菌屬菌團的重量［4］。其分析方法扼要介紹如下：稀釋培養液樣品，借沉降作用分成菌絲體與菌團兩個部分。將含菌團的雙碟置于日光反射鏡下。經校準后用CCD照相機（Teleris2-KAF1400-3）攝下整個樣品的反射鏡映象，照相機配有Nikon鏡頭（AF Micro Nikkor 60mm，1:2.8）。影像用一計算機的共享圖像加工與分析程序NIH成像進行分析。用一圖形分辨率為1024×1024像素和12位的灰度值來記錄圖像。經遮蔽和校準目標與背景分離后，通過應用一閾值可以獲得一種二進制映象。經二進制映象分析后記錄目標區域及最大灰度值與平均灰度值。按下式計算生物量與菌團部分的生物量。據報道［5］，目標的灰度值代表其密度，可以回溯到一三維的形態結構。用Lambert與Beer定律模擬，計算生物量（M），如下：

　　 （1-5） 　　

式中，A、c、d、G0、G與k分別為目標面積（cm2）、濃度（mg/L）、三維擴展（cm）、最大灰度值、平均灰度值及比例因子［（L/mg）/cm］。

菌濃也可以間接測量，其準確度受多方面的影響，已少用。有興趣的讀者可參閱本書第二版的第9～12頁。

1.1.2.3　生物量的在線測量

近年來，在實驗室與工業規模的生物過程中優化控制方法有了長足的進步［6］，見表1-3。在使用現代技術來優化生物過程方面雖然遇到一些困難，但這些方法在實時分析、提高現有的工藝水平上具有明顯的優勢。

在許多測量菌量的方法中理想的辦法是直接監測生物反應器內的生物催化劑，這是控制工業發酵的現有重要參數之一。電子傳感器能傳送代謝速率或生物量的低阻抗模擬或數字信號，但在使用這些現代技術時會遇到一些困難。

（1）微量熱法　發酵產生的熱量同生長與產物形成有化學計量關系，可利用來間接估算生物量。在發酵過程中熱的輸入與輸出具有式（1-6）的關系：

Qacc=Qf+Qag-Qe-Qs-Qcond-Qcool　　（1-6）

式中，Qacc為熱的積累；熱的輸入項Qf、Qag分別為發酵熱和攪拌熱；輸出項Qe、Qs分別為蒸發損失和空氣中顯熱損失；Qcond為導熱損失［=（T0-Tf）uA］；Qcool為冷卻系統的熱損失（=WCpΔT）。

有兩種方法可以從式（1-6）求得發酵熱：

第一種是穩態熱平衡法，在熱的累積Qacc=0時：

Qf=Qcond+Qcool+Qe+Qs-Qag　　（1-7）

代入各項的熱等式得：

Qf=WCpΔT+（T0-Tf）uA+FCp，airΔTair+FHλ-KNn　　（1-8）

式中，W是冷卻水流速；Cp是冷卻水比熱容；ΔT是冷卻水的溫差；u是總的傳熱系數；A是發酵罐的導熱面積；T0和Tf為罐內與罐外溫度；F是氣體流速；Cp，air是空氣熱容量；ΔTair是氣體流經發酵罐的溫差；H是在溫度Tf下空氣中飽和水蒸氣的含量；λ是蒸發汽化熱；K是把攪拌熱與N（攪拌轉速）的n次關聯起來的比例常數。

顯熱損失通常比Qf小得多，可忽略。如用水將輸入空氣在Tf下飽和，則蒸發熱也可忽略。也可用干濕球溫度計測量進出口空氣，求得Qe。攪拌熱可用KNn估算，其中K與n宜從經驗中求得，n值一般為2～3。

第二種測量發酵熱的方法是動態法。在式（1-6）的Qcool=0時：

Qf=Qacc+Qcond+Qe+Qs-Qag　　（1-9）

Qf=MCpΔT/Δt+（T0-Tf）uA+FCp，airΔTair+FHλ-KNn　　（1-10）

將冷卻水關閉后，測量隨時間而變化的溫度（ΔT/Δt），按式（1-10）便可求得Qf。以釀酒酵母為例，產熱的速度與比生長速率成正比。每克細胞所產生的熱量K=4.4kcal。其熱得率（每克細胞產生的熱）取決于基質利用效率（g細胞/g基質），細胞得率隨時間變化，熱得率K也在變。從圖1-10可見，當細胞得率處于同一值時（如0.5），基質的氧化狀態越低，熱得率就越高，即甲烷>十六烷>乙醇>甲醇>葡萄糖。

新生霉素發酵前期（0～38h）熱量的產生與菌的生長關系對應得很好。但在生產期熱量繼續以0.095（kcal/g）/h的速率產生，而此時生物量的增長中止。這相當于葡萄糖的比消耗速率為0.025（g/g）/h。這是細菌和霉菌用于維持除生長以外的各種活動所需的能量消耗。熱量的產生和葡萄糖的消耗均與抗生素的產生有關，每克葡萄糖的消耗相當于產生20mg新生霉素。因此，產生的熱量對監測整個發酵的生長與生產有參考價值。

熱量的產生與氧耗速率也相對應。用大腸桿菌（葡萄糖為碳源）、假絲酵母、枯草桿菌、黑曲霉（葡萄糖或糖蜜為碳源）進行試驗，所得關系式為：

　　 （1-11） 　　

故只要知道與產熱Qf［（kcal/L）/h］的相關系數，便可以從氧吸收數值求得發酵熱。用CO2生成速率也可推出類似的關系式：

　　 （1-12） 　　

式中的相關系數。有人用Ciba-Geigy熱流-量熱計監測生物過程。當Kluyveromyces fragilis在好氧氣條件下生長在乳糖合成培養基中時，熱的產生與生物量成正比。生長條件的改變并不影響熱與生物量的比值保持恒定，為10.59kJ/g DCW。量熱計也適用于測量緩慢生長的細胞，如雜交瘤細胞。

（2）培養物熒光法　測量培養物的熒光可以實時估算菌濃。熒光主要來自胞內NADH和NADPH。有人曾用熒光傳感器，如熒光檢測系統（Biochem Technology，Malbern）來測量生物量［7］。這種方法的主要限制是NADH隨生理狀態而變。

（3）電容、電導和阻抗法　監測培養基電導率的變化可以獲得有關生長的信息。培養基的離子濃度因微生物的代謝物而改變。電導率用于表征溶液的離子濃度，因而可以作為細胞群體的可靠度量。此法快捷，更為準確，靈敏，即使只有一個活的微生物也能測出來［8］。用一種數字電導儀PW09527（Philips Co.，England）測量的電導率與植物細胞量在10g/L范圍內呈線性關系。

在補料分批培養的色素生產中很難利用光密度準確測量細胞濃度，Krairak等采用一種電容探頭（膠體電介體探頭HPE5050A型，Hewlett-Packard公司）［9］來在線監測發酵液的電容率值，使用頻率為184kHz，100周波數（cycle），總取樣時間為7min。

測量生長培養基中的阻抗變化可以得知微生物的生長活動。酵母的生長引起阻抗的增加，而細菌使之降低。這種差異可作為啤酒釀造的質量控制，有一種阻抗計可用于監測啤酒是否受到雜菌的污染。有人曾在FIA系統中使用電化學方法在線監測大腸桿菌，發現此法快捷，且與經典的菌落形成單位測定方法有很好的對應關系［10］。

Xiong Z Q等［61］在50L發酵罐內安裝了一種電容探頭，實時在線監測釀酒酵母谷胱甘肽補料-分批發酵過程中活菌濃度，并同時離線測定細胞干重（DCW）、離心壓縮細胞體積（PMV）、菌落形成數（CFU）。結果顯示，CFU與電容量的相關系數R=0.995。在谷胱甘肽發酵期間用此法估算比生長速率，比用OUR和CER法更可靠。因此，電容探頭可用于復合培養基中實時監測補料-分批高密度培養過程的活菌濃度。

（4）就地顯微法　Bittner等報道了一種能就地在線測定生物量的顯微法。在發酵期間反應器中可在線顯微觀察微生物的傳感器［11］。此傳感器是一種在線顯微鏡（ISM），在其測量室內含有一直接的光源，整合于一25mm不銹鋼管中，有2臺CCD攝像機和兩個幀捕獲器。所得數據由一自動成像分析系統處理。

ISM通過生物反應器的標準開口插入罐內，浸入培養基中。顯微觀察是在測量室中進行的，測量室位于傳感器頭的前沿。觀察室定期開啟和關閉。在開啟狀態下，反應器中的液體不受限制地流入室內；關閉后，室內便裝有2.2×10-3mL的液體。在室內細胞的流動停止后的幾秒內便被顯微鏡檢測。

（5）在線監測尾氣中CO2與氧含量　發酵過程中CO2的生成是另一種生長指標，特別適用于早期生長階段。在對數生長期CO2的釋放在一定條件下與細胞量成正比。但培養條件的變化有時會影響菌量的測定，因pH即使是很小的變化也可能明顯影響CO2的釋放量。監測CO2的生成是跟蹤生長活動的有效方法。最常用的是紅外分析儀和質譜儀。這兩種儀器均可接通多個發酵罐。計算CO2釋放速率需借助于式（1-13），同時需要知道氧的吸收與氣流速率。

　　 （1-13） 　　

式中，CER為CO2釋放速率，（mol/L）/min；Fn為N2流速，mol/min；V為液體體積，L；p為總壓力（與分壓相同），Pa；pc［out］為排氣CO2分壓，Pa；pw［out］為排氣水蒸氣分壓，Pa；po［out］為排氣O2分壓，Pa；pc［in］為進氣CO2分壓，Pa；pw［in］為進氣水蒸氣分壓，Pa；po［in］為進氣O2分壓，Pa。

用CO2生成速率監測生長，無需無菌取樣便能精確測定排氣中的CO2含量。單位細胞量生成的CO2取決于分解代謝途徑及產能分解代謝與耗能合成代謝偶合的效率。對于許多好氧或厭氧發酵，上述因素幾乎不變。在產黃青霉生長期間，CO2生成速率是細胞生長的指標。CO2是分解代謝的最終產物，它與ATP的生成有關。若每摩爾ATP所產生的細胞量是恒定的，且ATP以恒定速率合成，則CO2的生成速率與細胞的生長成正比關系。確切的比例取決于ATP的產生途徑，如在好氧條件下則取決于末端氧化的電子傳遞效率。若生長與分解代謝未偶合（如靜息細胞代謝），則這種相關性便不成立。

氧吸收的測量也可以作為細胞活性的度量。活菌的氧吸收速率相當穩定，所以氧的吸收可與生物量關聯，條件是未出現主要的生理變化，如對新能源的適應。有人發現，在不同碳源上生長的一些酵母，其氧吸收速率可作為代謝活動的指示。在好氧培養中熱的釋放速率與氧細胞得率（形成單位細胞量的氧的吸收）的關聯較好。

1.1.3　環境對生長的影響

環境因素會影響菌的生長和產物的合成，故有必要了解微生物代謝調節與環境之間的關系。微生物與環境是相互影響的。微生物在生長和適應環境過程中會改變其所在的環境，有時是為了提高其競爭優勢。了解環境對微生物的生長是為了控制其生長，為提高產品的質和量服務的。微生物生長的好壞，菌量的多寡直接影響生產。控制生長可從物理或化學因素著手。

1.1.3.1　物理環境

一些物理因素，如溫度、攪拌、空氣流量、超聲波和膜過濾等對生長均有不同程度的影響。

（1）溫度　不同的微生物，其最適生長溫度和耐受溫度范圍各異。嗜冷菌、嗜溫菌、嗜熱菌和嗜高溫菌的最適生長溫度分別為18℃、37℃、55℃和85℃左右，其共同特點是菌在低于最適生長溫度的溫度范圍內比在高溫度范圍內有更強的適應力；其生長溫度的跨度為30℃左右。

微生物的生長速率可用式（1-14）表示：

dx/dt=μx-αx　　（1-14）

式中，μ為比生長速率；α為比死亡速率。

一般，溫度對比生長速率與比死亡速率的影響可用Arrennius方程表示：

　　 （1-15a） 　　

　　 （1-16a） 　　

式中，A和Ea分別為Arrennius常數和活化能；R和T分別為通用氣體常數和熱力學溫度。

將生長速率對熱力學溫度的對數作曲線得：

　　 （1-15b） 　　

　　 （1-16b） 　　

從圖1-11（b）可以看出，在高溫或低溫下溫度與生長速率的關系偏離線性。在高溫下會引起蛋白質的變性，并伴隨酶的失活。不是所有細胞蛋白質都是熱不穩定的，但只要一個關鍵酶被鈍化，便會導致生長的停止。一種對生長必需的酶的改變會使生長對熱變性比野生型更為敏感。因此，要想通過一次突變來降低微生物的最高生長溫度是可能的；但要提高最高生長溫度卻絕非易事。

微生物典型活化能值在50～70kJ/mol。當溫度超過最適的生長溫度，比生長速率開始迅速下降，見式（1-14）。這是由于微生物的死亡速率增大。微生物死亡的活化能為300～380kJ/mol。高的死亡活化能說明，隨著溫度的升高，死亡速率的增加遠大于低活化能的生長速率的增加。

溫度影響細胞的各種代謝過程，生物大分子的組分，如RNA隨溫度上升比生長速率增大，細胞中的RNA和蛋白質的比例也隨著增長。這說明為了支持高的生長速率，細胞需要增加RNA和蛋白質的合成。對于重組蛋白的生產，曾將溫度從30℃提高到42℃來誘導產物蛋白質的形成。

幾乎所有微生物的脂質成分均隨生長溫度而變化。溫度降低時細胞脂質的不飽和脂肪酸含量增加。如表1-4所示，細菌的脂肪酸成分隨溫度而變化的特性是細菌對環境變化的響應。脂質的熔點與其脂肪酸的含量成正比。因膜的功能取決于膜中脂質組分的流動性，而后者又取決于脂肪酸的飽和程度，故微生物在低溫下生長時必然會伴隨脂肪酸不飽和程度的增加。

在過程優化中應了解溫度對生長和生產的影響是不同的。如黃原膠的發酵前期的生長溫度控制低一些（27℃），中后期控制在32℃，可加速前期的生長和明顯提高產膠量約20％（見表1-5）。故此兩目標函數必須兼顧優化［12］。

從表1-5可見，≤24℃黃原膠的形成顯著滯后于生長，呈典型的次級代謝模式；≥27℃黃原膠的合成緊跟生長，從對數生長開始直到靜止期。在35℃細胞生長受阻，μ=0；27～31℃下，μmax=0.26h-1；在22℃和33℃的細胞得率分別為0.53g/g和2.8g/g；在22℃和33℃的黃原膠得率分別為54％和90％。黃原膠比生產速率隨溫度升高而增加。黃原膠中的丙酮酸含量隨溫度變化在1.9％～4.5％之間，最高出現在27～30℃。這說明黃單胞菌的最適生長溫度在24～27℃間，最適黃原膠形成溫度在30～33℃間。培養20～25h進行變溫發酵對前期生長和中后期產膠有利。

（2）機械的影響　在攪拌罐中靠近攪拌葉尖的地方是高能輸入區。這里存在剪切應力的問題，特別對絲狀菌，情況更為嚴重。

（3）滲透壓對生長的影響　各種微生物對環境中滲透壓變化的耐受能力是不同的。絕大多數的微生物在稀溶液中能生長，而有一種嗜高滲菌稱為耐鹽菌，能在NaCl飽和溶液中生長。按其耐鹽程度可將微生物分成四類（表1-6）：非嗜鹽菌、海洋細菌、中等嗜鹽菌和極端嗜鹽菌。

耐滲透性是指微生物在其內部和外界滲透壓差別很大的情況下能調節其內部滲透壓。K+的積累在這種調節中起主要作用。耐滲透壓越強的細菌，胞內的K+強度越大。腐胺在確保胞內離子強度的大致恒定起重要作用。胞內腐胺濃度與培養基的滲透壓成反比，培養基的滲透壓增加，胞內的滲透壓也隨K+的吸收而增加。于是排出腐胺可維持大致恒定的胞內離子強度。

（4）水的活度　水對細胞的生長是非常重要的。細胞質中約80％的重量都是水，而且許多反應都需在水中進行。水又可作為反應物，參與水解反應，在電子運輸鏈中它也是O2被還原的產物。水對細胞的影響常用水的活度Aw表示：

Aw=Ps/Pw　　（1-17）

式中，Ps和Pw分別為溶液和純水在同一溫度下的蒸汽壓；Aw相當于相對濕度。

在同一溫度下純水的Aw=1。在低溶質強度的溶液中同滲重摩Os（osmolality，mol可溶物/kg溶質），純水中的Os=0。海水含3.5％鹽分，其Aw=0.98，Os=1.0；果醬含大量糖，其水活度低，Aw=0.9，Os=6.0；在蜜餞和鹽湖中Aw=0.7，Os=20。各種微生物對水活度的反應是不一樣的，見圖1-12。細菌比霉菌對水活度更敏感。這是防止細菌污染食物的重要途徑。要阻止細菌和霉菌的生長，水活度需分別低于0.9和0.7才行。革蘭氏陽性細菌和酵母通常比陰性細菌更能耐受低水活度。

隨Aw降低，克雷伯氏肺炎球菌的生長適應期延長，呼吸商（RQ）增加，非生長基質消耗的百分比增加，當Aw<0.983時，變化更顯著，見表1-7。

Hallsworth等曾在不同溫度（25℃，40℃和42.5℃）下用6種試劑（乙醇、KCl、甘油、葡萄糖、山梨醇與聚乙二醇400）改變水活度（1～0.75），比較其對米曲霉生長的影響［13］。一般來說，隨溫度的升高，水的活度Aw降低。含KCl、甘油、葡萄糖、山梨醇或聚乙二醇400培養基的極限水活度大約為0.85，不隨溫度變化。但生長在含乙醇培養基的極限Aw卻隨溫度在0.97～0.99間變化。由乙醇誘導的水應力所致的生長抑制作用在25℃、40℃和42.5℃下分別為31％、18％和6％。對于含乙醇的培養基，每單位Aw的降低所引起的生長速率的減小隨溫度的升高而加大。乙醇的副作用實際上是由乙醇降低水活度和乙醇本身的毒性所致。乙醇濃度對水活度的影響見圖1-13。隨溫度的降低，乙醇對生長的抑制作用（歸咎于水應力的）的比例減小。但總的生長抑制作用相應增加，即乙醇的毒性增加。實際上，由乙醇誘導的水應力不隨溫度變化，換句話說，乙醇的非水應力的破壞作用在高溫下變得更嚴重。

由乙醇引起的水活度的降低對維持細胞、酶與膜的功能和結構不利。對高濃度（>10％）乙醇的耐受量是與細胞對水活度相應降低的忍耐力有關。酵母細胞對中、高濃度乙醇的代謝響應與對水應力的響應相似。況且，受乙醇影響的胞內主要部位與受水活度影響的部位相同。乙醇會松弛DNA的超螺旋和影響調節性蛋白的結構，從而直接控制基因表達。

1.1.3.2　化學環境

化學環境是指培養基中的各種化學因素，如pH、溶氧、養分和代謝物等。養分被吸收，用于生長；也可誘導和啟動代謝系統，有些化合物并不直接參與代謝。在許多生物過程中，生長不僅取決于可利用的養分的濃度，還受有害代謝物和抑制劑的影響。尤其在厭氧發酵過程中生長受發酵代謝產物的抑制，其產率和得率因而受影響。這可能是由于一些關鍵酶受到調節，干擾了代謝調控（特別是能量代謝以及膜的運輸），最終導致生長的下降，轉化率和產率降低。

（1）pH的影響　pH是微生物生長和產物合成的重要的狀態參數。大多數微生物生長適應的pH跨度為3～4個pH單位，其最佳生長pH跨度在0.5～1個pH單位范圍。不同微生物的生長最適pH范圍不一樣，細菌在pH6.5～7.5，酵母在pH4～5，霉菌在pH5～7。其所能忍受的上下限分別為：pH5～8.5、pH3.5～7.5、pH3～8.5。因pH影響跨膜pH梯度，從而影響膜的通透性。微生物的最適pH和溫度之間似乎也有一定的規律：生長在最適溫度高的菌種，其最適pH也相應高一些。這一規律對設計微生物生長的環境有實際意義，如控制不需要的微生物的生長。

在發酵過程中pH是變化的，這與微生物的活動有關。NH3在溶液中以的形式存在。它被轉化為后，在培養基內生成H+；如以為氮源，H+被消耗，還原為；如以氨基酸作為氮源，被利用后產生的H+，使pH下降。pH改變的另一個原因是過程中產生的有機酸，如乳酸、丙酮酸或乙酸的積累。

在培養液的緩沖能力不強的情況下，pH可反映菌的生理狀況。如pH上升超過最適值，意味著菌處在饑餓狀態，可加糖調節。糖的過量又會使pH下降。用氨水中和有機酸需謹慎，過量的NH3會使微生物中毒，導致呼吸強度急速下降。故在通氨過程中監測溶氧濃度的變化可防止菌的中毒。常用NaOH或Ca（OH）2調節pH，但也需注意培養基的離子強度和產物的可溶性。故在工業發酵中維持生長和產物的所需最適pH是生產成敗的關鍵之一。

不同的菌種對培養基的初始pH的敏感程度不一樣，有的很敏感。如出芽短梗孢糖（EPS-pullulan）發酵［14］中，出芽短梗霉生長在初始pH為6或7的培養基中，對生長與生產的影響明顯不同。前者雖然有利于生長，卻不利于EPS的生產，見圖1-14。由此可見，初始pH不同，會影響生長的模式，在初始pH6或5均會使發酵過程的pH維持在3.5～3.9的范圍，最終的菌濃達到92g/L（DCW）；而初始pH在7.0時，其pH在發酵過程中開始緩慢下降，到第4天才跌到pH6，以后直到發酵結束，維持在pH6左右，對EPS的生產卻十分有利，其發酵10d的產量為13g/L，是初始pH6.0發酵的3倍。

（2）溶氧的影響　溶氧（dissolved oxygen，簡稱DO，有關DO的詳細介紹請參閱5.2.6節）是需氧微生物生長所必需。在生物工程中溶氧往往是需氧發酵的限制因素。DO水平低于臨界氧值時比生長速率下降。各種微生物的臨界氧值以空氣氧飽和度表示：細菌和酵母為3％～10％，放線菌為5％～30％，霉菌為10％～15％。氧的供需關系可用式（1-18）表示：

　　 （1-18） 　　

式中，dx/dt為菌的生長速率，（g/L）/h；為以氧為基準的得率，g DCW/mol O2；KLa為體積氧傳質系數，h-1；c*為氧的飽和濃度，mol/L；cL為發酵液中的氧濃度，mol/L。

在生長過程中從培養液的DO變化可以反映菌的生長生理狀況。隨菌種的活力和接種量以及培養基的不同，DO在培養初期開始明顯下降的時間不同，一般在接種后1～5h內（這也取決于供氧狀況）。通常，在對數生長期DO明顯下降，從其下降的速率可估計菌的生長情況。利用靈敏度高的DO電極（其響應95％所需時間<30s），可在短時間停氣和罐頂部充N2的條件下從DO下跌的速率求得菌的攝氧率［（mgO2/L）/h］。

值得注意的是在培養過程中并不是維持DO越高越好。即使是專性好氧菌，過高的DO對生長也可能不利。過高的氧的有害作用是通過形成新生O、超氧化物基和過氧化物基或羥基自由基OH-對許多細胞組分的破壞作用實現的。有些帶巰基的酶對高濃度的氧敏感。好氧微生物曾發展一些機制，如形成觸酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶（SOD），使其免遭氧的摧毀。在次級代謝產物為目標函數時控制生長免于過量是必要的。

（3）二氧化碳的影響　二氧化碳是生物呼吸和發酵的大量終產物，也可作為養分。光養細菌，如紫細菌、綠細菌和深藍細菌全都需要光作為能源，而化學營養菌能利用CO2作為其唯一的碳源。異養菌在其組成代謝中也需要固定CO2。故環境中的CO2濃度對其生長和產物合成有影響。大多數微生物適應低CO2濃度（0.02％～0.04％）。通常，靠細胞自身的代謝活動可以滿足其對CO2的需求，但在發酵前期，特別是大量通氣的情況下也可能出現CO2成為限制因素，導致適應期的延長。在發酵后期生產旺盛，發酵液中會積累CO2，影響菌的發酵生理。

（4）碳源的影響　提供適當碳源是優化生長和生產的關鍵。生長速率，如同任何其他化學反應速率，取決于化學反應物（養分）的濃度，常用Monod關系式來描述生長速率與基質濃度S之間的關系。

μ=μmaxS/（kS+S）　　（1-19）

式中，μ和μmax分別為比生長速率和最大比生長速率，h-1；S是基質濃度，g/L；kS是時的基質濃度。

表1-8列舉了不同微生物利用各種基質的最大比生長速率、得率和限制常數等。如碳源濃度大于10kS，細胞將以接近μmax的速率生長。kS值在多數情況下能反映基質的吸收機制，kS值處在100～300mg/L情況下其運輸屬于被動擴散，甚至是易化擴散；而kS=1～10mg/L為載體介入或主動運輸。

所有養分濃度均有最高的限制，超過此限制會使生長速率下降。一般稱這種現象為基質抑制作用。對糖來說，濃度大于50g/L，可能會發生基質抑制作用，多數在100～150g/L才出現。通常，抑制是由于滲透壓所致。溶質濃度增加到一定程度會引起細胞脫水，進而降低生長速率，見1.1.3.1（3）小節。基質的抑制作用可用式（1-20）表達。

μ=μmaxS/（S+kS+kiSS）　　（1-20）

式中，kiS為基質抑制常數；其余符號說明見式（1-19）。

（5）氮源的影響　氨是大多數微生物的最普通的氮源。許多細菌能利用硝酸鹽作為細胞的氮源，用于合成氨基酸。硝酸鹽的利用需先還原為亞硝酸鹽和氨。在厭氧呼吸中硝酸鹽被用作終端電子受體。許多微生物偏好氨，它們也能利用復合培養基中的有機氮。

氨和氨基酸的典型kS值分別為0.1～1.0mg/L和0.003～0.2mg/L。其低kS值說明細胞對這些物質的輸送采用主動運輸系統。一般在環境中氮化合物濃度較低，因此，能在低濃度氮源快速生長的微生物具有重要的競爭優勢。滿足微生物對氮源的需求并不難，難的是氮源的過量供應會導致競爭性抑制問題。氨濃度超過3～5g/L，往往會引起抑制作用。如培養基缺少碳源，菌會利用氨基酸的碳架，從而導致氨的積累。如以硝酸鹽作為氮源，它可能會部分還原成對細胞有害的。故氮源的影響不僅來自NH3，也可以來自能最終降解成NH3的代謝物。

（6）烷醇　在大多數厭氧和若干需氧生物過程中常生成代謝產物或副產物的烷醇，如乙醇、丙醇、異丙醇、丙二醇、丁醇或2，3-丁二醇。酵母、細菌（發酵單胞菌屬和梭狀芽孢桿菌屬）。可利用各種碳源，但一般更喜歡葡萄糖。乙醇是生物過程的最為重要產物之一。除了傳統的酵母發酵，對運動發酵單胞菌的乙醇發酵也很重視，其體積產率和產物濃度受到乙醇或其他烷醇的限制。大多數細菌的生長對乙醇的敏感濃度在1～100g/L的范圍。據報道，乙醇通過影響電中性載體介入運輸系統抑制葡萄糖的吸收，和通過干擾跨膜電位而影響氨的吸收。其主要作用在于乙醇與細胞膜的相互作用，增加膜的流動性，由此干擾了位于膜上的酶的脂質環境。最后便出現離子與代謝物的膜滲漏，尤其是質子被動流入的增強，導致跨膜電位及其關聯的離子運輸和能量轉換過程的失控，見圖1-15。隨著乙醇濃度的增加，其他環境參數，如溫度和pH對膜運輸過程的影響加深［16］。酵母和若干細菌能通過改變其膜脂質組分以適應乙醇對膜的干擾作用。

（7）有機酸　微生物對碳源的不完全氧化會產生各種有機酸。盡管這些酸是厭氧發酵的代謝產物，在需氧發酵的條件下，特別是氧的供應受到限制或在高生長速率的情況下也會產生乙酸。已知有機酸，特別在低pH下會抑制微生物的生長。對一些細菌和酵母來說，未解離形式的有機酸是毒性的根源。這種抑制生長的作用是非競爭性的。有機酸干擾膜的功能，其毒性與膜脂質的溶解度有關。未離解有機酸使膜中毒的臨界濃度在0.4～0.5g/L。未離解的有機酸可以自由出入微生物的質膜，降低胞內pH，酸化細胞質。它們干擾能量偶合過程，降低能量生成的效率，增加細胞對能量的需求。抑制作用的最終結果是代謝途徑的改變，從而降低細胞生長和產物形成的速率。

1.1.4　生長的變量和約束

如同微生物對其環境的響應是多方面的，生長速率也受內在因素，包括形態組織、代謝模式（速率限制步驟、化學計量）、胞內控制以及物理約束（物質與能量守恒定律）的影響。

1.1.4.1　細胞的大分子成分

生長可以看作是各種復雜化學反應的總和。各種微生物的倍增時間的分布見圖1-16。在一定的養分、生長因子和物理條件下細胞總是設法盡量利用所提供的條件，從而獲得高生長速率和得率。同時，許多微生物能改變其胞內組分以適應環境。如增殖細胞的所有成分與親代一致，便可認為獲得平衡的生長。在這些條件下細胞數目的增長與細胞質量的增長成正比，其細胞成分沒有什么變化。通常在生物反應器中只有連續培養在一種稀釋速率下才能獲得平衡生長。在不同的生長速率下細胞成分會發生顯著的變化，見圖1-17。尤其是，隨生長速率的增加RNA的含量也在增長。

1.1.4.2　限制步驟

基質消耗與生長之間存在線性關聯。

rS=μ/YX/S+m　　（1-21）

式中，rS為基質消耗，（g/g）/h；μ/YX/S代表基質用于生長，（g/g）/h；m為基質用于維持，（g/g）/h。

式（1-21）與Monod模型構成動力學模型的核心。實際上基質消耗受基質濃度和膜運輸酶步驟的控制，可用米氏動力學模型描述：

rS=rS，maxS/（kS+S）　　（1-22）

生長速率本身則受這種基質消耗速率的控制：

μ=YX/S-Ym　　（1-23）

式（1-22）和式（1-23）同樣構成動力學模型的核心。大多數異養菌用碳源作為能源。其中一部分結合到細胞中，其余被氧化，用于能量的產生和最終被分泌出去，隨基質的不同，其得率也不同，見表1-8。對許多需氧和厭氧生物過程來說，有機基質的消耗與能量產生是快速生長或高生長得率的限制因素（見1.1.4.3節）。受有限基質消耗控制的生長一般稱為能量限制式生長。

同樣，其他養分，如氨也常與生長呈線性關系。對能量受限制的生長，即使氨在培養基中是過量存在的，氨的吸收只是根據生長的需求。反過來，如氨濃度較低，氨的消耗便控制生長，這種情況稱為氨限制式生長，而細胞則按化學計量調節其他養分的消耗速率。因此，在養分消耗或胞內代謝方面只有少數有限步驟能決定總生長速率和整個發酵模式。在酵母的生產中應避免氧的限制，在發酵后期補料的減少導致生長速率的下降和細胞對氧的需求減少。

1.1.4.3　生長對能量的需求

在理論上對需氧呼吸每消耗0.5mmol O2，形成2～3mol ATP（P/O）。基質的能量得率取決于其還原程度。對于葡萄糖，在呼吸中每分解代謝1mol葡萄糖，要形成38mol ATP。對于厭氧發酵過程，氧不作為電子受體，從有機基質來的電子被轉移給分解代謝物，最終作為產物分泌出去。此過程的能量得率可以從基質能提供的電子求得，每消耗1mol葡萄糖形成1～3mol ATP（取決于產物和所用的生化途經）。這只代表約2％的葡萄糖燃燒能量。

能量分配機制更為復雜。Pirt引入與生長無關的能量需求，能量用于維持的概念。這種維持能量需求主要用于細胞成分的周轉、胞內控制、膜電位和細胞運動的維持。沒有能量的消費，細胞將瓦解和死亡。

對于許多不同微生物的生長，由分解代謝產生的ATP得率YATP約為10.5g細胞/mol ATP。從單體或葡萄糖合成細胞化合物計算理論得率，約得32g細胞/mol ATP。有關生物量得率的化學計量限制問題請參閱1.3生長效率。

1.1.4.4　微生物熱的釋放

發酵過程中從工業發酵罐除去大量生物熱并不容易，特別在表面積與體積之比較小和熱天冷卻水與發酵液的溫差較小的情況下更難做到。然而，生物熱的釋放可用于間接估算微生物生長，參閱1.1.2.3（1）節。

在每一個代謝步驟中，如同任何化學反應那樣，都包含一種熵的變化。在活細胞中這種變化在正常情況下總是伴隨著熱的釋放。在生長期間細胞以ATP高能鍵方式捕集有用的能，提供各種生化反應所需的能源。在ATP的形成中只有40％～75％的反應能被以ATP的方式保留下來，其余以熱的形式釋放。利用ATP時又產生附加的熱。圖1-18顯示在鏈霉菌發酵期間熱的釋放與能量保留在合成的細胞之間的差異。顯然，在生長停止后熱的釋放繼續進行。這是由于細胞將能量用于與生長無關的代謝所致。

Cooney等指出許多不同需氧微生物的氧耗與產熱之間的關系為每消耗1mol氧約產生440kJ熱量。對厭氧過程產生的發酵熱取決于發酵產物，一般比需氧過程低，每消耗1mol葡萄糖產生2mol乙醇、2molATP和約20kJ的熱。若基質與產物能完全定量，借熱力學循環可以計算生物過程的熱。由于幾乎所有化學化合物的燃燒熱都是已知的，反應熱可以用式（1-24）求得：

ΔH（反應）=∑ΔHcom（產物）-∑ΔHcom（基質）　　（1-24）

實際應用中存在一些困難。因整個生長過程是在溶液中進行的，溶液溫度必須考慮在內。另外，元素的成分和生物量的燃燒熱難于估算；文獻提供的數據往往不怎么精確，在大多數情況下磷、硫和微量元素的含量是不確切的；基質、產物和生物量的測量也不夠準確，因此憑這些信息還難于準確預測培養的溫度。盡管如此，這種熱力學計算還是有助于估算單一因素對熱釋放的影響。在許多情況下，量熱法對在線跟蹤生物過程的化學計量變化很有用。