第五節　毛細管固相微萃取技術

固相微萃取技術經過十幾年的發展，已經十分成熟，特別是與GC的聯用，可以使用商品化的自動進樣器完成萃取和進樣等步驟，但對于液相色譜，卻一直沒有適用的自動進樣設備，只能使用手動進樣器與HPLC接口完成直接進樣。作為一種樣品前處理技術，如果不能實現自動化進樣，就很難用于常規分析，因此，Pawliszyn又于1997年首次提出毛細管固相微萃?。╥n-tube SPME）方法［177］，將涂有固定相的GC毛細管柱用于樣品萃取，并與商品化HPLC自動進樣器相連，無需使用特殊的接口進行解析，使固相微萃取與液相色譜的聯用實現了自動化。同時還克服了纖維SPME的涂層經溶劑浸泡洗脫容易造成溶脹脫落的問題。也有人將此技術稱為涂層毛細管微萃?。╟oated capillary microextraction，CCME）［178］。

由于任何GC開管毛細管柱都可以用于in-tube SPME，也大大拓寬了SPME-HPLC技術的應用范圍。目前可供使用的GC毛細管柱多種多樣，強極性的固定相種類更遠遠多于商品化的SPME纖維，使之更適合于強極性化合物的測定。

一、毛細管SPME的裝置與操作過程

將一段GC開管毛細管柱安裝在HPLC自動進樣針和進樣管之間，為避免計量泵的污染，進樣管應一直置于流路中。毛細管的連接使用的是一小段聚醚醚酮（Polyether Ether Ketone，PEEK）材質的微管，再用一不銹鋼箍與流路相連。萃取之前，需用流動相如甲醇等沖洗毛細管，并使流動相停留在毛細管中。萃取開始后，將六通閥扳到“Load”位置，進樣針在微機的控制下，反復將樣品瓶中的樣品吸入、排出毛細管若干次。當樣品被吸入毛細管時，分析物就被富集在管壁的固定相中，而當樣品被排出毛細管，回到樣品瓶中時，流動相又再次進入毛細管，固定相上萃取的分析物就有可能解析下來，因此流動相造成的影響需通過優化試驗加以解決。萃取結束后，進樣針會從溶劑瓶中吸入流動相或其他溶劑洗脫固定相中富集的分析物，帶入后面的進樣管（Loop）中，待分析物解吸完全之后，將六通閥搬到“Injection”的位置，使流動相將進樣管中的分析物帶入液相色譜柱分離測定。整個裝置和操作過程如圖3-13所示。

應用自動進樣器可以使萃取、解吸和進樣過程不間斷進行，也提高了分析的準確度和精密度，多次測定的相對標準偏差小于6％。當樣品中含有分配系數較高的分析物時，所需的平衡時間較長，但樣品被反復吸入和排出毛細管，可以起到攪動樣品的作用，縮短到達吸附平衡的時間。由于分析物在每次流動相排出毛細管時都會有部分解吸，所以in-tube SPME不能完全萃取樣品中的分析物。通常萃取的化合物量取決于涂層的極性、樣品被吸入排出毛細管的次數和體積，以及樣品的pH值。

毛細管內的涂層選擇與纖維SPME方法相同，也遵循“相似相溶”的原則，針對極性的化合物，應選擇極性的涂層。用于萃取的毛細管長度在50～60cm范圍內是最好的。毛細管太短，萃取效率較低，毛細管太長，萃取的分析物在解析時過于分散，就會出現峰展寬的現象。樣品總的吸排體積可以用進樣針和毛細管的總體積來計算，增加吸排的次數和體積也能提高萃取效率，但經常使色譜峰展寬。樣品吸排的流速會同時影響萃取率和方法的精密度，即較高的吸排速度一方面可以良好地攪動樣品，使分析物的質量傳遞加快，增加萃取效率；另一方面，又會使流動相中產生氣泡，降低萃取的效率和精密度。因此最優的吸排流速范圍是50～100μL·min-1。低于此流速范圍，萃取時間較長，不利于快速分析的進行。

平衡時間對in-tube SPME也十分重要。不同于纖維SPME，其萃取時間的優化需要通過萃取量對吸排樣品的次數作優化曲線來進行選擇。而其他的萃取條件如樣品的pH值、鹽度等，調節方式則與纖維SPME方法相同。

進樣的體積就是完全解吸分析物所需的流動相體積。Gou等用60cm長的毛細管萃取分析物，之后再用不同體積的流動相洗脫，根據得到的色譜峰分析，發現洗脫曲線并非線性的。開始的20μL流動相使62％的分析物解吸，接下來的20μL又解吸了24％的分析物，若使分析物達到100％解吸共需要60μL的流動相［179］。

比較in-tube SPME方法與纖維SPME法，二者各有各的優缺點，但最大的差別就在于萃取的化合物一個是富集在纖維的表面，另一個是富集在毛細管的內壁。in-tube SPME使用細徑毛細管，為防止柱和流路的堵塞，必須在萃取前去除樣品中的顆粒物，因此in-tube SPME適合潔凈水樣的分析。而纖維SPME不用去除樣品中的顆粒物，因為可以用頂空萃取消除干擾，或在直接萃取后用水沖洗纖維清除其上的顆粒物，但纖維易于折斷，還會在進樣和攪動中遭到破壞。in-tube SPME和纖維SPME均可與HPLC聯用，但二者的進樣方式也存在差別。纖維SPME中，要將纖維暴露在進樣接口中，用流動相或其他溶劑沖洗纖維，待分析物完全解吸后，再進入色譜柱分離。由于某些分析物從纖維上洗脫速度較慢，常常造成色譜峰展寬的現象。而in-tube SPME中，用流動相或其他解吸溶劑通過毛細管柱，直接解吸并使分析物進入分離柱，實現了解吸、進樣的一體化，峰展寬的現象得以緩解。

二、毛細管SPME原理的數學模型

毛細管SPME萃取有兩種基本方式：①動態法——在樣品反復通過毛細管時萃取分析物；正如上文所描述的；②靜態法——即樣品處于靜止狀態，分析物通過擴散的方式遷移到毛細管固定相中，多應用于現場采樣。

1.動態毛細管SPME萃取

毛細管SPME應用毛細管柱萃取化合物，是一個動態的吸附-解吸過程。其理論與液相色譜理論相似。若以k表示樣品在毛細管中的分配比，則：

　　 （3-10） 　　

式中，Kfs是涂層與樣品之間的分配系數；Vf是毛細管萃取相的體積；Vv是萃取用毛細管的死體積；ds是固定相涂層厚度；dc是毛細管的管徑。

毛細管柱的理論塔板高度（以H表示）與萃取系統的幾何形狀有關，可由開管毛細管系統的Golay公式推導，得到下式，即

　　 （3-11） 　　

式中，u是溶劑在毛細管中的線性流速；Dm是溶質在流動相中的擴散系數；Ds是溶質在固定相中的擴散系數。上式中的最后一部分說明了溶質在固定相中的緩慢平衡過程，當用開管毛細管萃取水樣中的化合物時，可以忽略不計，于是上式可以簡化為下式：

　　 （3-12） 　　

當毛細管萃取樣品時，萃取相中分析物的濃度與其在管中的分配比和理論塔板高度都有關系，在整個富集過程中，任何時刻，萃取相中分析物的軸向濃度都是時間t的函數。擴散的平均方根可用σ表示

　　 （3-13） 　　

在引進樣品時，分析物遷移的前鋒通過毛細管的速度與樣品的線性流速成正比，與分配比成反比［180，181］。由于毛細管SPME萃取用毛細管都很短，樣品分散程度小，所以認為萃取所需的時間與樣品到達毛細管末端的時間相似，可用下面兩式表示：

　　 （3-14） 　　

　　 （3-15） 　　

式中，L是毛細管中固定相的涂層長度。從上式可以看到，萃取時間與毛細管長度成正比，與樣品的線性流速成反比，而且隨著涂層-樣品分配系數的增加而增加。萃取時間還與萃取相的體積以及柱的死體積有關，毛細管長度不同，其死體積和固定相體積都會不同。一般死體積大，會使萃取時間減少；固定相體積增加，雖然可以萃取更多的化合物，但所需的平衡時間也延長了。增加涂層-樣品間分配常數可以增加萃取的絕對數量。已經發現在多數情況下用甲醇或其他一些適當的溶劑，在萃取前預載毛細管，可以增加萃取的數量。因為在樣品吸入毛細管進行分配的階段，樣品一直跟隨由甲醇形成的溶劑帶，這與SPE中用來加強萃取效果的預載溶劑作用相似。

應該指出式（3-15）僅對直接萃取有效。如果樣品在管內的流速非常快，涂層-樣品間的分配系數又不是很高，那么樣品流動就可以達到一種良好的攪動狀態，此時的平衡時間可用式（3-16）表示：

　　 （3-16） 　　

用上式可以根據分析物在固定相中的擴散系數（Ds）和涂層的厚度（ds）估算實際體系能達到的最短平衡時間。

2.靜態毛細管SPME快速采樣

現場采樣時，必須考慮樣品濃度隨時間推移而發生的變化。使用內壁涂有固定相的毛細管采集樣品，樣品靜止在管內進行靜態萃取。當把毛細管帶離采樣地時，兩端具有保護的管結構對隨時間和地點變化而變化的分析物總濃度產生成比例的響應［182］。此時，分析物遷移到萃取相只是通過擴散作用。在這一過程中，管內建立起一個線性的濃度梯度。隨時間的增加，固定相萃取的化合物量（n）可用下式計算：

　　 （3-17） 　　

式中，A為管的截面積；Z為管進樣口與萃取相所在位置間的距離；c（t）為樣品接近管開口處的分析物的濃度，與時間相關；Dg為分析物在氣相中的擴散系數。

萃取分析物的數量與樣品濃度和分析物的擴散系數成正比，而與涂層相對于管開口處的位置成反比。要強調的是式（3-17）僅在固定相萃取樣品中很少量的分析物的情況下成立。

三、毛細管SPME的應用

毛細管SPME與HPLC聯用在強極性化合物和熱不穩定性化合物的測定方面顯示出極大的優越性。Pawliszyn小組將其用于環境樣品中氨基甲酸鹽殺蟲劑的測定［183，184］，由于使用梯度洗脫法，所以在進樣量加大的情況下，不會造成峰形變寬。六種氨基甲酸鹽可達到基線分離，最低檢出限為0.3μg·L-1，萃取率達到15％～34％。用少量甲醇（4μL）預載萃取毛細管，可以成倍提高萃取效率。

苯基脲類除草劑也是一類強極性化合物，用毛細管SPME-HPLC能夠定量萃取和測定，線性范圍可達到3個數量級，線性相關系數大于0.99。每次測定后用250μL甲醇沖洗，毛細管中就不會有殘留影響下一次測定。研究人員還發現，在分析系統中使用細徑的HPLC柱，可以改善峰形，提高靈敏度［177］。Hartmann用類似的方法分離測定了11種除草劑，整個分析時間只需11min。不同的樣品基體如溪流、河水、污水等對分析沒有影響，而且毛細管表現出良好的穩定性，每根毛細管可重復萃取樣品100次以上［178］。

應用毛細管SPME技術可以進行藥物檢測［185］。β-阻斷藥能夠刺激中樞神經系統，具有類交感神經的特點，是國際奧林匹克委員會和國際體育聯盟禁止使用的一類興奮劑，因此它的檢測在臨床、法醫學和毒理學等許多方面都很重要。應用毛細管SPME自動化進樣系統，與液相色譜-電噴霧離子化質譜聯用完成定量測定，為興奮劑的常規快速靈敏檢測提供了美好的前景。用極性涂層的毛細管萃取、分離血清和尿樣中的9種β-阻斷藥，由于樣品基體的復雜程度不同，所以血樣的回收率范圍為71％～112％，尿樣的回收率范圍在84％～113％之間［186］，從上述結果可見，方法的準確性可以得到保證，而且血、尿等生物樣品也無需復雜的處理，只要經過水或緩沖溶液的稀釋和過濾處理即可，十分簡便。

有機金屬化合物也可嘗試用該技術測定。以涂有多孔的二乙烯基苯聚合固定相的Supel-Q Plot GC毛細管柱直接萃取三甲基鉛、三乙基鉛［187］的氯化物，無需衍生反應，即可使兩種烷基鉛化合物得以形態分離，并用電噴霧質譜（ESMS）檢測器測定，得到這兩種鉛化合物的質譜圖。對環境中的三丁基錫［188］化合物，毛細管SPME富集后以質譜測定，方法檢出限為0.05ng·mL-1。

Saito等將毛細管SPME技術與纖維SPME技術結合起來，建立了管內纖維SPME技術（Fiber in-tube SPME）［189］。他們將280根直徑為11.5μm的帶雜環的聚合物——賽璐珞剛性纖維插入0.25mm的PEEK細管中，作為萃取的介質，與HPLC-UV聯用富集分離廢水中的內分泌干擾物鄰苯二甲酸鹽（或酯），取得了很好的結果。相對于開管式毛細管SPME技術，管內插入的纖維，具有很強的富集能力，同時極大地增加了樣品與萃取相接觸的面積，萃取率可達到50％，而多次測定的相對標準偏差小于1％。

還有人嘗試將毛細管SPME與GC聯用測定水樣中的酚和多環芳烴［190］。分析物經毛細管富集后，解吸方式可以是熱解吸，即將萃取毛細管中的樣品吹出、吹干，通過石英壓封接頭將富集柱與分析柱相連，再整個置于GC柱箱內加熱解吸。也可以是溶劑解吸，即樣品富集后吹干毛細管，再注入適當的有機溶劑（約100μL），待分析物解吸以后，采用柱內進樣方式用輔助載氣將溶劑以一定的流速引入GC。由于進樣體積較大，還要使用保留間隙柱。此聯用方式沒有自動進樣裝置可用，不適于日常工作，較纖維SPME而言，還增加了操作步驟，靈敏度也比較低。利用增加富集柱的長度來提高萃取靈敏度，在進樣時無論采用哪種方式，都容易造成色譜峰的拖尾現象，不利于化合物的形態分析。