第五節(jié)　固相萃取的理論及方法開發(fā)

一、固相萃取的理論

（一）穿透體積及其理論預(yù)測

固相萃取的過程可以看作一個簡單的色譜過程，萃取吸附劑就是固定相。在反相固相萃取中的上樣過程中，流動相就是樣品溶液中的水；而在洗脫過程中，流動相就是洗脫劑（大多數(shù)情況是有機(jī)溶劑）。因此進(jìn)行反相固相萃取時，可用有關(guān)色譜理論預(yù)測指導(dǎo)萃取實踐以減少盲目性。反相固相萃取的萃取對象一般為水樣中的有機(jī)化合物，按有關(guān)色譜理論，反相萃取過程中，由于水是一個極弱的溶劑，此時水樣中的有機(jī)化合物的保留因子k極大，因此被測物被強(qiáng)烈保留在反相吸附劑上而與大量的水樣基體分離；洗脫時則使用了溶劑強(qiáng)度大的有機(jī)溶劑，此時被測物的保留因子k極小，因此被吸附劑吸附的被測物被定量洗脫，通過此吸附-洗脫的循環(huán)過程，達(dá)到對分析物的富集及純化的目的。因此，為了取得好的萃取效果，在萃取過程中，我們希望保留因子k越大越好；而在洗脫過程中，我們希望保留因子k越小越好。

在色譜過程中，注射樣品后，即在流動相的推動下連續(xù)不斷地向柱末端流動并最終流出色譜柱，如果在此過程中在色譜柱末端接一對被測物有響應(yīng)的檢測器，則檢測器對分析物的響應(yīng)輪廓線必為一呈正態(tài)分布的峰型曲線。該曲線的拐點(diǎn)即為分析物的保留體積VR，其與分析物的保留因子k之間的關(guān)系為：

VR=V0（1+k）

式中，V0為色譜柱及檢測器的死體積。

而固相萃取過程則與色譜過程稍有不同，樣品溶液本身就是流動相，其流出曲線的輪廓線在達(dá)到最大后并不像色譜流出線那樣逐漸下降，而是維持最大不變，這是由于樣品溶液在不斷地流入固相萃取柱。圖2-21是一個典型的固相萃取流出曲線即穿透曲線示意圖。圖中VB即為該萃取柱的理論穿透體積，其含義是漏出的分析物濃度是原溶液中分析物濃度的1％時樣品溶液的總流出體積；VM的含義是漏出的分析物濃度是原溶液分析物濃度的99％時樣品溶液的總流出體積，此時流出液在組成上基本與原溶液一樣。V0含義與色譜中一樣，其與分析物保留因子的關(guān)系仍然是：

VR=V0（1+k）　　（2-1）

式中的V0項即固相萃取柱或盤的死體積，其值可由吸附劑的空隙率（ε）和固定相的床體積Vc進(jìn)行估算。它們之間的關(guān)系是：

V0=Vcε　　（2-2）

而在固相萃取的萃取階段，我們希望被分析物得到定量吸附，即在萃取階段被分析物不要發(fā)生穿透，也就是用固相萃取處理的最大樣品體積應(yīng)不超過穿透體積VB。因此在固相萃取中，我們更感興趣的是穿透體積VB，其與保留體積VR之間的關(guān)系是：

VB=VR-2.3σ　　（2-3）

式中，σ是標(biāo)準(zhǔn)偏差，其值取決于溶質(zhì)在萃取柱中的軸向擴(kuò)散，屬動力學(xué)因素。因此穿透體積VB由熱力學(xué)因素和動力學(xué)因素共同決定。標(biāo)準(zhǔn)偏差σ與柱的理論塔板數(shù)之間存在如下關(guān)系：

σ=（V0/N1/2）（1+k）　　（2-4）

結(jié)合以上各公式可得：

VB=（1+k）（1-2.3/N 1/2）V0　　（2-5）

由式（2-5）可知，一個化合物的保留因子越大，穿透體積越大；使用的固相萃取柱的理論塔板數(shù)越大，柱效越高，穿透體積越大。式（2-5）中k和V0易于查到或計算得到，N不易得到，一般通過估計得到一個大約值，一般典型的商品固相萃取柱的理論塔板數(shù)為20左右，通過公式（2-5），從理論上即可估算穿透體積。例如，現(xiàn)有一C18填充固相萃取柱的柱床體積為0.75cm3，大多數(shù)反相填料的空隙率（ε）值在0.65～0.70之間，若以0.70計算，則此固相萃取柱的死體積V0為0.75×0.70=0.525cm3，若一化合物的保留因子為3000，假設(shè)該萃取柱的理論塔板數(shù)為20，則可由式（2-5）計算得該體系的穿透體積為765mL。

（二）穿透體積的實驗測定

根據(jù)式（2-5）計算得到的穿透體積只是一個大約值，在具體工作中，穿透體積大多是通過實驗的方法來進(jìn)行測定的。穿透體積的實驗測定可按下述幾種方法進(jìn)行：

①最簡單的測定穿透體積的方法是直接法，即以合適的恒定流速使一樣品溶液流過固相萃取柱，在固相萃取柱的出口處安裝一檢測器，使其連續(xù)檢測出口處被分析物的濃度，根據(jù)測定數(shù)據(jù)作出穿透曲線，從該曲線直接得到穿透體積，這就是直接法。該測定方法要求檢測器必須有高的靈敏度，否則固相萃取柱流出液中的被分析物濃度很難測定準(zhǔn)確；另外，測定時溶液濃度必須合適，濃度過大會造成萃取柱的過載。穿透體積的大小還與溶液的流速有關(guān)，測定穿透體積時一般要求流速盡可能與實際測定樣品時的流速一致。直接法的另一個缺點(diǎn)是測定過程很長費(fèi)時間。

②為了提高測定的速度，人們又提出了另一種測定穿透體積的方法，該方法既可按在線方式進(jìn)行，又可按離線方式進(jìn)行。該方法首先用固相萃取柱濃縮一系列體積不斷增大但含有相同質(zhì)量被分析物的溶液，然后洗脫被吸附的分析物，再用色譜儀測定洗脫液的峰高及峰面積。隨著溶液體積的不斷增大，分析物濃度逐漸降低，但只要固相萃取柱不發(fā)生穿透，則被固相萃取柱保留的溶質(zhì)總量及隨后的洗脫液的濃度就保持不變，這樣上述一系列不同體積的溶液在色譜測定中得到的色譜圖及峰面積均應(yīng)相同。當(dāng)穿透發(fā)生后，隨著溶液體積的不斷增大，被固相萃取柱萃取的被分析物的質(zhì)量不斷減少，則隨后的色譜測定中的峰高及峰面積不斷降低，最后作峰面積-樣品體積圖，從該圖就可得到穿透體積。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時測定幾種化合物的穿透體積，并且該測定是在與未知樣品相同的實驗條件下完成的。

二、固相萃取的方法開發(fā)

（一）固相萃取的類型

固相萃取在基本原理上與液相色譜類似，因而按萃取原理固相萃取也可分為反相固相萃取（Reversed phase SPE）、正相固相萃取（Normal phase SPE）、離子交換固相萃取（Ion exchange SPE）等。

反相固相萃取是目前最為常用的一種固相萃取方法，其基本含義是使用非極性的疏水性固定相如C18鍵合硅膠、C8鍵合硅膠、聚苯乙烯-聚二乙烯苯共聚物固定相、碳分子篩、石墨化炭黑等從極性的樣品溶液如水樣中萃取非極性或弱極性的分析物，定量萃取分析物后，再用少量有機(jī)溶劑將分析物從固定相上洗脫下來進(jìn)行測定。

與反相固相萃取相反，正相固相萃取的目的是從非極性的樣品溶液中萃取相對極性的分析物，在該萃取體系中一般使用極性較大的固定相如硅膠、氧化鋁、氧化鎂及硅鎂型吸附劑等。分析物被定量吸附后再用少量極性較大的有機(jī)溶劑將分析物從固定相上洗脫下來進(jìn)行檢測。該類固相萃取很少用于直接萃取非極性溶液中的極性成分，絕大部分使用在水溶液等樣品中有機(jī)提取物的去雜凈化。例如，測定植物樣品或動物樣品中多環(huán)芳烴或多氯聯(lián)苯時，一般是先將樣品用環(huán)己烷充分浸提，分析物被萃取進(jìn)入環(huán)己烷相，而在此過程中原樣品中的植物油及動物脂肪也有相當(dāng)比例進(jìn)入環(huán)己烷相，植物油及動物脂肪的存在會干擾后續(xù)的氣相色譜測定。因此，在進(jìn)行氣相色譜測定前必須對該環(huán)己烷提取物進(jìn)行純化，其方法是將此環(huán)己烷提取物溶液通過填充有硅鎂型吸附劑的固相萃取柱，則分析物及溶液將流過該柱，而植物油及動物脂肪將被吸附在固相萃取柱上，這樣可達(dá)到純化提取物的目的。又例如測定貝殼等軟體動物組織中有機(jī)錫時，首先將動物組織勻漿，用少量鹽酸-四氫呋喃酸化樣品后，加入適量艸卓酚酮-正己烷，在振蕩儀上充分振蕩以浸提樣品中的有機(jī)錫，離心分離，取上層清液并轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸發(fā)至1～2mL，加入格氏試劑，充分振蕩使樣品中的離子型有機(jī)錫定量轉(zhuǎn)化為非離子型的疏水性衍生物，此時該正己烷溶液中除含有有機(jī)錫的衍生物外，還含有較大量的動物脂肪，脂肪的存在會干擾有機(jī)錫的色譜測定，測定前應(yīng)采用正相固相萃取法可除去該溶液中的脂肪，其做法是：將該溶液通過填充有硅鎂型吸附劑的固相萃取柱，溶液中的脂肪將被吸附在吸附劑上，而分析物有機(jī)錫的衍生物將通過該柱，收集過柱液后用氣相色譜法測定即可。

當(dāng)分析物為離子狀態(tài)時，則可考慮選擇含有陽離子或陰離子官能團(tuán)的固定相來萃取此類分析物。進(jìn)行此類萃取時，應(yīng)注意選擇合適的pH值以使分析物在上樣萃取階段以離子狀態(tài)存在，從而達(dá)到定量吸附；在洗脫時則應(yīng)選擇合適的有機(jī)溶劑并調(diào)節(jié)其pH為合適數(shù)值，以使分析物轉(zhuǎn)化為中性的分子狀態(tài)，從而被該有機(jī)溶劑定量洗脫。除此之外，還可采用另外一種較高濃度或與固定相親和能力更大的離子溶液來將分析物置換洗脫下來。

了解了固相萃取的幾種類型，在具體工作中，就可根據(jù)樣品的類型、分析物及主要基體的性質(zhì)，選擇合適的固相萃取類型，確定了固相萃取類型后，再選擇合適的固定相、上樣溶劑、淋洗溶劑和洗脫溶劑。溶劑選擇最重要的因素是溶劑強(qiáng)度，它是保證固相萃取成功的關(guān)鍵。表2-6列出了正、反相固相萃取中常見溶劑強(qiáng)度的大小關(guān)系。

（二）吸附劑的選擇

選擇固相萃取固定相時，考慮的因素主要是：需要萃取的分析物的性質(zhì)和樣品溶液的基體，即溶劑。

被分析物的極性與固定相的極性越相似，兩者之間的作用力越強(qiáng)，分析物在該固定相上的保留越完全，因此在進(jìn)行固相萃取時，應(yīng)盡可能選擇與被分析物極性相似的固定相。例如，萃取低極性的碳?xì)浠衔铩⒍喹h(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等物質(zhì)時，應(yīng)選用低極性的反相固定相如C18鍵合硅膠、乙烯-苯乙烯共聚物、碳分子篩等。而萃取中等極性的物質(zhì)時，正、反相固定相都可使用。

另外，選擇固定相時還應(yīng)考慮樣品溶液的溶劑強(qiáng)度。樣品溶液的溶劑強(qiáng)度相對于固定相應(yīng)該較弱，溶劑強(qiáng)度較弱時，被分析物的保留因子較大，則被分析物在固定相上必有強(qiáng)的吸附保留。如果溶劑強(qiáng)度太大，分析物的保留必然很弱或不被保留。例如，樣品為水溶液時，應(yīng)用反相固相萃取法，不應(yīng)使用正相固相萃取法，此時應(yīng)選用C18鍵合硅膠等反相填料，而不能用極性大的正相填料，原因是在反相固相萃取法中，水是一個溶劑強(qiáng)度極弱的溶劑，使用它不會影響分析物的保留。樣品溶劑是正己烷時，則應(yīng)選用正相填料；此時選用反相填料就很不合適，原因是對反相固相萃取來說，正己烷是一個溶劑強(qiáng)度很大的溶劑，如果此時使用C18鍵合硅膠等反相填料作為固定相，則分析物不會保留或保留極少。

選擇固定相時還應(yīng)注意的其他事項包括：分析物是否能離子化，能否使用離子交換固定相；分析物在各種溶劑中的溶解度；干擾組分是否與分析物競爭固定相上的結(jié)合位點(diǎn)等。

（三）洗脫劑的選擇

固相萃取的過程實際是一個簡單的液固色譜過程，它包括四個基本過程：固定相的活化、上樣富集、淋洗雜質(zhì)、分析物洗脫均涉及溶劑的選擇問題。既然固相萃取過程是一個色譜過程，那么在選擇溶劑時，可借用有關(guān)的色譜理論來進(jìn)行指導(dǎo)。

1.固定相活化時溶劑的選擇

固定相的活化要達(dá)到的目的有兩個：去除固定相上的雜質(zhì)；使填料被溶劑潤濕并溶劑化，從而提高分析物的回收率及測定的重現(xiàn)性。所以活化固定相時一般使用兩個溶劑，第一個溶劑（初溶劑）用于凈化固定相；第二個溶劑（終溶劑）主要作用是使固定相溶劑化，即用于建立一個合適的固定相環(huán)境以便使樣品中的分析物得以保留。每一個活化溶劑的用量一般為每100mg固定相1～2mL活化溶劑。

不管是商品固相萃取柱還是自制的固相萃取柱，或多或少都含有雜質(zhì)，因此都必須用一種合適的溶劑（初溶劑）去除這些雜質(zhì)，雜質(zhì)去除不徹底將會導(dǎo)致對分析物測定的嚴(yán)重干擾，從而造成分析誤差。例如對最常使用的C18鍵合硅膠，一般使用的初溶劑為甲醇，甲醇可有效地去除該固定相上所含有的雜質(zhì)。

選擇終溶劑時最重要的一點(diǎn)是其溶劑強(qiáng)度應(yīng)與樣品溶液的溶劑強(qiáng)度一致，若使用太強(qiáng)的溶劑，會導(dǎo)致分析物回收率的下降。如用C18鍵合硅膠萃取水樣中疏水性有機(jī)物時，理想的終溶劑應(yīng)是蒸餾水，而且還應(yīng)將此蒸餾水的pH及其他成分調(diào)節(jié)至與實際水樣盡可能一致。

固定相在活化過程和活化結(jié)束后，都不能將活化溶劑抽干。否則將會使填料干裂和進(jìn)入氣泡，這將導(dǎo)致柱效的降低，將造成回收率低和重現(xiàn)性差的結(jié)果。

2.上樣萃取時溶劑的選擇

為了使分析物得到好的保留，上樣萃取時應(yīng)采用盡可能弱的溶劑。如果上樣溶劑強(qiáng)度太大，分析物將不被保留或保留很弱，這樣測定時分析物的穿透體積將很小，回收率將很低。如果上樣時溶劑選擇合適，分析物必然得到好的保留，這樣一方面可保證測定有高的回收率，另一方面可得到大的穿透體積，從而可采用大的上樣量，獲得高的富集倍數(shù)。

3.淋洗去雜質(zhì)溶劑的選擇

分析物得到保留后，常需使用合適的溶劑淋洗固定相，其目的是洗掉吸附于固定相上的不需要的干擾組分。經(jīng)過淋洗可得到更純凈的樣品，這樣可得到更簡單理想的色譜圖，有利于得到更正確的分析結(jié)果，也可以更好的保護(hù)色譜柱，從而延長色譜柱的使用壽命。因此淋洗溶劑強(qiáng)度的選擇非常重要，其強(qiáng)度不能太高，也不能太低，即應(yīng)大于或等于上樣溶劑，小于洗脫溶劑，其最高目標(biāo)應(yīng)是：盡可能將干擾組分從固定相上洗脫完全，但又不會洗脫任何分析物。

4.洗脫溶劑的選擇

選擇理想的洗脫溶劑主要應(yīng)該考慮以下兩點(diǎn)。

（1）溶劑強(qiáng)度應(yīng)足夠大，即使用該溶劑時分析物的保留因子k應(yīng)該盡可能小，這樣可保證將吸附在固定相上的分析物定量洗脫下來。洗脫劑的用量一般為0.5～0.8mL/100mg固定相。對大多數(shù)化合物來說，乙腈是比甲醇及乙醇更好的洗脫溶劑。另外，對大多數(shù)化合物來說，它們在C18鍵合硅膠-有機(jī)溶劑體系中的保留行為與其在苯乙烯-二乙烯苯共聚物固定相-有機(jī)溶劑體系中的保留行為基本一致，但其在C18鍵合硅膠-有機(jī)溶劑體系中的保留因子比在苯乙烯-二乙烯苯共聚物固定相-有機(jī)溶劑體系中的保留因子要小一些。

（2）選擇的洗脫溶劑應(yīng)與后續(xù)的測定相適應(yīng)，即要么該溶劑易于揮發(fā)，這樣可在定量洗脫分析物后用氮?dú)獾榷栊詺怏w將該溶劑吹干，再用合適的另一種溶劑溶解分析物后，直接進(jìn)樣進(jìn)行色譜測定；要么該溶劑適合于色譜分析，這樣直接進(jìn)樣就可進(jìn)行分析測定，蒸發(fā)及溶劑置換這一步驟就可省略。

另外還應(yīng)注意所選溶劑的黏度、純度、毒性、反應(yīng)性及與檢測器是否匹配（如液相色譜中紫外檢測器的截止波長等）。在其他條件相同時，應(yīng)該選擇黏度低、純度高、毒性小并與分析物及固定相不反應(yīng)的溶劑。選用的溶劑的截止波長應(yīng)小于分析物的檢測波長，即溶劑不對分析物的檢測產(chǎn)生干擾。選用單一溶劑洗脫效果不理想時，可考慮使用混合溶劑進(jìn)行洗脫。