第2部分　熊蜂生理方面的研究進展

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表達分析

秦加敏1，2，羅術東1，廖秀麗1，黃家興1，和紹禹2，吳杰11

（1　中國農業科學院蜜蜂研究所/農業部授粉昆蟲生物學重點實驗室，北京　100093；

2　云南農業大學東方蜜蜂研究所，昆明　650201）

摘要：【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase， Tre-1）全長cDNA序列，預測該基因及其編碼蛋白的理化性質，明確該基因在小峰熊蜂不同組織及不同發育時期的表達特性，為研究該基因在小峰熊蜂生長發育中的生物學功能奠定基礎。【方法】根據地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1編碼蛋白的保守區序列，利用Primer Premier 5.0設計簡并引物擴增得到小峰熊蜂保守區片段；隨后根據該片段設計基因特異性引物，用RACE方法獲得5’端和3’端片段。在此基礎上，根據RACE擴增所得片段和保守序列，預測開放閱讀框（ORF）序列，分別在起始密碼子近5'端和終止密碼子的近3’端設計ORF區特異性引物擴增得到ORF，最后采用BioEdit軟件比對、拼接獲得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全長序列。運用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等軟件對該基因進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR技術，采用2-ΔΔCt方法檢測不同組織及不同發育時期可溶型海藻糖酶基因的相對表達量。【結果】克隆所得基因cDNA全長為3129bp，命名為BhTre-1（GenBank登錄號：KJ025078），其中包含5’端441bp非編碼區和3’端945bp非編碼區，ORF為1743bp，共編碼580個氨基酸。其編碼的蛋白預測分子質量為67.16kD，等電點為5.95；有1個信號肽結構（1-21位），1個甘氨酸富集區（GGGGEY），2個特色“標簽序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP），6個Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，無跨膜區。序列分析發現BhTre-1氨基酸序列與地熊蜂BtTre-1和B.impatiens BiTre-1的一致性很高，分別為99％和98％，與西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A.florea）的Tre-1一致性也達到78％；系統發育分析也表明BhTre-1與BtTre-1、BiTre-1的親緣關系最近，與AmTre-1、AfTre-1之間的親緣關系次之。基因定量分析結果顯示BhTre-1在成蟲被檢測的各組織中均有表達，在中腸的表達量最高，其次是馬氏管，其他各組織表達量較低。成年工蜂的BhTre-1表達量高于幼蟲和蛹，工蜂出房后隨著齡期的增加表達量呈現先升高后降低的規律，在第15天表達量最高。【結論】克隆得到了BhTre-1全長cDNA序列，其分子生物學特性與其他昆蟲Tre-1相似，該基因在小峰熊蜂中腸表達量最高，此外，幼蟲和蛹的表達量低于成年工蜂，工蜂出房后表達量呈現先升高后降低的趨勢，為進一步研究該基因在小峰熊蜂體內的生物學功能奠定了基礎。

收稿日期：2014-06-26；接受日期：2014-08-18

基金項目：國家自然科學基金（31201858）、國家蜂產業技術體系（CARS-45）

聯系方式：秦加敏，Tel：010-62596843；E-mail：qjm20122@163.com。通信作者羅術東，Tel：010-62591749；E-mail：luoshudong@caas.cn；通信作者吳杰，Tel：010-62591543；E-mail：apis@vip.sina.com

關鍵詞：小峰熊蜂；可溶型海藻糖酶基因；克隆；序列分析；基因表達

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Soluble Trehalase Gene Tre-1 in Bombus hypocrita

QIN Jia-min1，2，LUO Shu-dong1，LIAO Xiu-li1，HUANG Jia-xing1，HE Shao-yu2，WU Jie1

（1. Institute of Apiculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Biology of Insect-Pollinator，Ministry of Agriculture，Beijing 100093；2. Institute of Eastern Bee，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

Abstract　【Objective】The objective of this study is to clone full-length cDNA sequence of the soluble trehalase gene（Tre-1）in Bombus hypocrita，predict the physicochemical properties，clarify its expression in different tissues and developmental stages，and to understand the function of this gene in the development of B. hypocrita. 【Method】 Degenerate primers were designed by using Primer Premier 5.0 software according to the conservative sequences of Tre-1 in B. terrestris and B. impatiens to get the corresponding conservative fragment in B. hypocrita. Gene-specific primers were designed according to the conserved fragment. The rapid-amplification of cDNA ends（RACE）method was used to clone B. hypocrita 5′ and 3′ sequences，then the open reading frame（ORF）was amplified by the specific primers based on the initiation codon and termination codon near 5′ and 3′，respectively. Different fragments were spliced by BioEdit to obtain the full-length cDNA. The full-length cDNA was analyzed by a variety of bioinformatics softwares such as ExPASy，SignalP 4.1，NetOGlyc 1.0 sever，ClustalW and MEGA 5.0. Finally，the relative expression of Tre-1 in different tissues and developmental stages in B. hypocrita were analyzed by real-time PCR and 2-ΔΔCtmethod. 【Result】 The full-length cDNA of B. hypocrita Tre-1 is 3 129bp，and designated as BhTre-1（GenBank number：KJ025078）. The bioinformatics analysis suggested that BhTre-1 has an ORF of 1 743bp，a 5′（untranslated region）UTR of 441bp and a 3′UTR of 945bp. The ORF of BhTre-1 encodes a polypeptide of 580 amino acids with a predicted molecular weight of 67.16kD，and an isoeletric point value of 5.95. The deduced amino acid sequence has six predicted sequences of Asn-Xaa-Ser/Thr，a signature peptide，a highly conserved glycine-rich region（GGGGEY），and two conserved signature motifs（PGGRFKEFYYWDSY and QWDFPN AWPP），but no transmembrane domain. Homology comparison found that BhTre-1 has the greatest similarity to B. terrestris BtTre-1（99％）and B. impatiens BiTre-1（98％），it also has greater similarity to Tre-1 of Apis mellifera and A. florea which have 78％ sequence homology. The phylogenetic tree analysis showed that BhTre-1 was first clustered with BtTre-1，BiTre-1，AmTre-1 and AfTre-1. The results agreed with the sequence homology analysis. Tissue-specific expression results indicated that BhTre-1 was expressed in all the major tissues，it had the highest expression in midgut，then Malpighian tubules，and lower expression in other tissues. The expression of BhTre-1 in adult worker was higher than at larva and pupa stages，and it increased from the 1st day after emergence，and had the maximum expression in the 15-day-old adults，then，it decreased with the age.【Conclusion】The cDNA sequence of BhTre-1 was successfully cloned from B. hypocrita，and the properties were similar with Tre-1 of other insects. BhTre-1 has the highest expression in midgut. In addition，the expression of BhTre-1 of adult worker was higher than at larva and pupa stages，and the expression of BhTre-1 increased first and then decreased. This study indicated that the expression patterns in different tissues and developmental stages of B. hypocrita，which will lay a foundation for biological functional research of BhTre-1.

Key words　Bombus hypocrita；soluble trehalase gene；clone；sequence analysis；gene expression

0　引言

【研究意義】熊蜂隸屬于蜜蜂總科（Apoidea）蜜蜂科（Apidae）熊蜂屬（Bombus），是一些高寒地區瀕危植物的主要傳粉者，對于維持生態系統的多樣性具有重要意義[1]，同時，其不發達的信息交流系統和趨光性弱等特點使其比蜜蜂更適合為設施農業授粉[2-3]。海藻糖被譽為昆蟲的“血糖”，幾乎存在于昆蟲所有的組織和器官中，是昆蟲血淋巴中最主要的糖類[4-5]。海藻糖酶是昆蟲體內唯一能夠水解海藻糖的酶，能特異性地將一分子海藻糖分解成兩分子葡萄糖，為昆蟲各組織的活動提供能量支持。因此，加強對授粉昆蟲海藻糖酶的研究，明確其在昆蟲體內的重要作用及其生物學特性對于保護和利用授粉昆蟲具有重要的意義。【前人研究進展】海藻糖在昆蟲的生長發育、能量代謝、取食行為[6-7]、蛻皮過程幾丁質合成[8]、抗逆[9]和滯育[10]等重要生理活動具有重要的作用，而海藻糖酶也是昆蟲各種生理活動中物質和能量代謝的一個關鍵性酶[11]，該酶由海藻糖酶基因編碼，其氨基酸序列具有2個特色“標簽序列”（PGGRFEFYYWDSY和QWDYPNAWPP）及1個甘氨酸富集區（GGGGEY）[12-14]。在昆蟲體內，海藻糖酶基因以2種不同的形式存在：一種是可溶型海藻糖酶基因（Tre-1），最先在黃粉蟲（Tenebrio molitor）中被克隆出來，游離于細胞內，主要存在于消化系統和循環系統中[15]，在能量代謝[16]、昆蟲長距離飛行、生殖[17]和幾丁質合成[18]中均具有重要的作用。另一種為膜結合型海藻糖酶基因（Tre-2），于2005年在家蠶（Bombyx mori）中獲得，主要存在于肌肉中，與線粒體膜結合[19]，其最鮮明的特征是存在跨膜結構或潛在跨膜結構，在昆蟲的蛻皮變態[20-21]、生長發育[22]、肌肉運動及中腸幾丁質的合成[18]中發揮重要作用。此外，海藻糖酶基因是一種非組織特異性表達基因，可以在多種組織中表達，它能誘導蠶卵滯育，提高抗寒性[23]。【本研究切入點】近年來對昆蟲海藻糖酶基因的研究主要集中在綠盲蝽（Apolygus lucorum）[24-25]、大豆蚜（Aphis glycines）[26]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[18]、玉米螟（Ostrinia furnacalis）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[27]和煙粉虱（Bemisia tabaci）[28]等昆蟲中，而對傳粉類昆蟲海藻糖酶基因的研究并不多，現有的研究也僅局限于蜜蜂屬[29]，對熊蜂海藻糖酶研究尚無相關報道。【擬解決的關鍵問題】以中國廣泛分布且具有重要商業化前景的小峰熊蜂（B. hypocrita）為材料，采用同源序列克隆和RACE技術克隆得到小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因（BhTre-1），分析其基因序列特征以及與其他昆蟲Tre-1的親緣關系；利用實時熒光定量PCR分析該基因在工蜂不同組織和不同發育階段的表達特性，為進一步研究其在授粉昆蟲體內的生物學功能奠定基礎。

1　材料與方法

試驗于2013年12月至2014年5月在中國農業科學院蜜蜂研究所昆蟲授粉與生態研究室完成。

1.1　材料

供試小峰熊蜂采自中國農業科學院蜜蜂研究所熊蜂繁育室，飼養溫度為（29± 1）℃，相對濕度為（60±5）％，以糖水和花粉進行飼喂，飼養過程中保持全暗環境并避免接觸任何化學試劑。

1.2　RNA提取及cDNA第一鏈的合成

采用Trizol法提取小峰熊蜂工蜂總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的純度，利用反轉錄試劑盒（康為世紀）合成cDNA第一鏈，然后根據SURPERSWITCHTMPCR cDNA試劑盒（寶盈同匯）合成5′-RACE和3′-RACE cDNA第一鏈。

1.3　保守區片段擴增

根據NCBI數據庫中已公布的地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens Tre-1保守區序列，利用Primer Premier 5.0設計1對簡并引物Tre-1-F和Tre-1-R（表1），以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，反應體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 1μL，模板1μL，上下游引物各2μL，rTaq 1μL，滅菌ddH2O補足50μL。擴增程序：94℃預變性5min，94℃變性40s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環后，72℃保溫7min。將擴增產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按瓊脂糖凝膠回收試劑盒（中科瑞泰）說明書進行回收、純化；連接、轉化后，挑斑驗證正確后送北京寶盈同匯測序。

1.4　cDNA末端快速擴增（RACE）

根據已獲得保守區序列，利用Primer Premier 5.0設計4條特異性引物：3′-GSP1、3′-GSP2、5′-GSP1和5′-GSP2（表1）。3′-RACE擴增以3′-RACE cDNA第一鏈作為模板進行第一輪PCR擴增，引物為3′-GSP1和3AP；第二輪擴增以第一輪PCR產物稀釋1倍為模板，引物為3′-GSP2和3AP（表1）。反應體系為：10×SURPERSWITCHTMHot Start Buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5mmol·L-1）2.5μL，模板0.5μL，SURPERSWITCHTMHot Start DNA polymerase 0.5μL，3′-GSP和3AP各0.2μL，滅菌ddH2O補足至25μL。擴增程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，38個循環后，72℃保溫10min，第二輪PCR退火溫度為59℃。5′-RACE擴增方法和反應體系同上，擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，37個循環后，72℃保溫10min，第二輪PCR退火溫度為58℃。產物切膠回收、連接、轉化和驗證方法同上。

1.5　開放閱讀框（ORF）擴增

根據所得保守區和RACE片段，預測ORF序列，在其起始密碼子近5′端設計特異性上游引物ORF-F1和ORF-F2（表1），在終止密碼子的近3′端設計特異性下游引物ORF-R1和ORF-R2（表1），二次PCR擴增BhTre-1的整個ORF區。第一輪PCR以5′-RACE cDNA第一鏈作為模板，引物為ORF-F1和ORF-R1；第二輪擴增以第一輪PCR產物稀釋1倍為模板，引物為ORF-F2和ORF-R2。反應體系同1.4，擴增程序：94℃預變性5min，94℃變性40s，61℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環，72℃延伸10min；第二輪PCR退火溫度為59℃。產物切膠回收、連接、轉化和驗證方法同1.3。

1.6　序列分析

采用BioEdit等軟件進行序列分析；分子質量、等電點、信號肽、糖基化位點分析分別采用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever軟件在線分析；氨基酸序列比對、同源性分析及系統樹構建采用ClustalW和MEGA 5.0分析。

1.7　不同組織和不同發育時期BhTre-1的表達

選擇個體大小基本一致的成年工蜂的觸角、頭、肌肉、足、翅、體壁、中腸、馬氏管、脂肪體和卵巢等10個組織部位研究BhTre-1的表達情況；選取幼蟲、蛹及0（0日齡為工蜂出房后24h以內的幼蜂）、5、10、15、20、25和30日齡成蟲提取總RNA，并制備cDNA模板備用，研究不同發育時期BhTre-1的表達。每個組織部位及發育時期做3個生物學重復。

以Actin-88作為內參基因[30]，采用實時熒光定量PCR方法測定基因的相對表達量。實時熒光定量PCR反應體系為：SYBR?Premix Ex TaqTMII 10μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，模板2μL，加水補足至25μL，以2μL ddH2O代替模板作為空白對照。PCR擴增反應在Mx 3000P上進行，擴增程序為：94℃預變性30s，94℃ 5s，60℃ 30s，40個循環。每個處理組做3次重復。

1.8　數據處理與分析

采用2-ΔΔCt方法分析海藻糖酶基因的相對表達量，分別將不同組織部位及發育時期中最低表達的數值視為1，其他組織部位或發育時期的表達量以相對于最低表達量的倍數進行分析，結果采用SPSS 13.0單因素方差分析中的最小顯著差數法（LSD法）進行分析。

2　結果

2.1　BhTre-1克隆及序列分析

通過中間片段擴增得到750bp左右的片段（圖1-A），測序結果為754bp，經過比對初步判斷該片段為BhTre-1的部分片段。根據該片段設計特異性引物，RACE擴增后在5′端和3′端均顯示1000bp左右的片段（圖1-B），測序結果顯示5′端939bp，3′端900bp；ORF擴增得到一段約2000bp左右的片段（圖1-C），測序結果顯示該片段長度為2118bp。該片段與5′端和3′端拼接后得到cDNA全長序列，通過NCBI-BLAST分析發現該序列與地熊蜂BtTre-1的同源性最高，一致性為99％，與其他蜂種的一致性也高達70％以上。

該基因全長3129bp，包含5′端441bp非編碼區和3′端945bp非編碼區，ORF長1743bp，共編碼580個氨基酸；還包含1個mRNA末端不穩定信號（ATTTA）和poly（A）尾巴，但不含有經典的ploy（A）加尾信號序列（AATAAA），有2個特色“標簽序列”PGGRFKEFYYWDSY（170—183位）和QWDFPNAWPP（471—480位）及1個甘氨酸富集區GGGGEY（535—540位）；預測的蛋白分子質量為67.16kD，理論等電點為5.95；有1個信號肽結構（1—21位），6個Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，其中有5處潛在的天冬酰胺N-糖基化位點，分別位于第108、286、338、345和466位；在21—22位有1個切割位點（TDA-AS），綜合Wolfpsort和TMHMM軟件在線分析，沒有發現跨膜區（圖2），這與其他昆蟲Tre-1性質極為相似，由此確定該基因為小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因，命名為BhTre-1，GenBank登錄號為KJ025078。

2.2　同源性及進化樹分析

利用ClustalW在線將BhTre-1與其他昆蟲Tre-1氨基酸序列比對，發現Tre-1家族具有很高的保守性，擁有許多保守的結構域（圖3）。分析結果顯示，該氨基酸序列與同為熊蜂屬的地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性最高，分別為99％和98％；與西方蜜蜂AmTre-1、云南小蜜蜂AfTre-1和大蜜蜂AdTre-1一致性次之，均為78％；與其他昆蟲如印度跳蟻HsTre-1（60％）、瘤姬蜂PhTre-1（54％）、豌豆蚜ApTre-1（50％）、褐飛虱NlTre-1（49％）、飛蝗LmTre-1（49％）、赤擬谷盜TcTre-1（49％）和黃粉蟲TmTre-1（47％）的序列一致性也較高。

選取有代表性的6種不同目昆蟲的Tre-1用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹（圖4），采用鄰接法進行聚類分析，每個分支進行1000次健壯性驗證，數值代表bootstrap估算值。進化樹分析顯示BhTre-1與BtTre-1、BiTre-1親緣關系最近，與AmTre-1、AfTre-1親緣關系次之；膜翅目、鞘翅目、鱗翅目、同翅目、直翅目和雙翅目昆蟲的Tre-1 bootstrap值大于65％，與同源性分析的結果一致。

2.3　BhTre-1在不同組織的表達分析

qRT-PCR結果顯示，在被檢測各組織中BhTre-1表達量明顯不同（圖5），在中腸中表達量最高，其次是馬氏管，在其他各組織中表達量較低。

2.4　BhTre-1在不同發育時期的表達分析

在不同的發育時期BhTre-1均有表達（圖6），且呈現一定的規律，即從幼蟲期到第15天成蟲期表達量逐漸升高，第15天時表達量達到最高，之后表達量明顯下降。

3　討論

海藻糖是昆蟲體內重要的糖類和能源物質，而海藻糖酶是昆蟲體內唯一能夠水解海藻糖的酶類，海藻糖及海藻糖酶在昆蟲的各種生理活動中具有重要的作用。目前的研究表明大多數昆蟲體內都存在Tre-1和Tre-2，有的昆蟲如赤擬谷盜（Tribolium castaneum）甚至存在4個Tre-1[31]，雖然這些海藻糖酶基因在不同昆蟲及同種昆蟲不同組織，不同時期表達特性并不一致，但均在不同程度上參與了昆蟲的生長發育及各種生理活動中能量代謝的調控。這使得研制以海藻糖酶為靶標的新型農藥來控制和防治某些害蟲成為可能，同時，也為根據有益昆蟲海藻糖酶的表達特性對其加以相應的保護與利用提供了參考依據。

本研究利用同源克隆及RACE技術，從小峰熊蜂中克隆獲得BhTre-1全長cDNA序列，分析得知BhTre-1與其他昆蟲Tre-1具有相似的特征，即1個信號肽、1個甘氨酸富集區和2個特色“標簽序列”，預測的蛋白分子質量和等電點與大部分昆蟲Tre-1相近，但與赤擬谷盜[31]TcTre-1-2的等電點卻相差較大。

對不同組織的表達研究結果表明，BhTre-1在中腸中表達量最高，這與大豆蚜[26]、草地貪夜蛾[32]等昆蟲Tre-1表達規律相同，其次是馬氏管。昆蟲中腸是昆蟲分泌消化酶、消化食物和吸收養分的主要部位，其生理行為耗能較大，由于海藻糖酶是昆蟲唯一能分解海藻糖的水解酶，因而血淋巴中的海藻糖進入腸道后，必須在Tre-1的作用下水解海藻糖，釋放能量物質，維持機體各種生理活動的正常運轉。而馬氏管是昆蟲的主要排泄器官，充分與血淋巴接觸，BhTre-1在小峰熊蜂馬氏管中的功能可能是水解海藻糖為馬氏管的扭動提供能量。但也有研究發現在飛蝗的體壁[16]、綠盲蝽的卵巢[33]和煙粉虱的唾液腺[28]中，Tre-1的表達量明顯高于其他組織，這可能與Tre-1在不同昆蟲、不同的組織中的功能不一樣有關。研究還發現BhTre-1在其他如觸角、肌肉、翅和脂肪體等需能較多的組織中同樣也有表達，但表達量卻相對較低，筆者認為這可能與昆蟲體內另一種類型的海藻糖酶—膜結合型海藻糖酶的分布有關，這些組織中是否主要由膜結合型海藻糖酶基因來協調昆蟲的各種生理活動有待進一步研究。

對不同發育時期BhTre-1的相對表達量研究發現，成年工蜂BhTre-1的表達量高于幼蟲和蛹，不同日齡的成年工蜂表達量呈現明顯的規律，這與筆者實驗室之前研究的小峰熊蜂乙酰膽堿酯酶基因（AchE）[30]、蜂毒磷脂酶A2基因（PLA2）[34]表達規律基本相同，也與熊蜂的腸道微生物的相對表達規律[35]基本一致，BhTre-1與這2種基因的表達及腸道微生物的多樣性之間是否存在某種關聯，還有待進一步研究。筆者認為該基因可能與小峰熊蜂的生物學行為，尤其是蜂群內部的社會分工密切相關，小峰熊蜂幼蟲和蛹基本處于靜止狀態，各項生理活動并不活躍，因此表達量相對比較低；成年工蜂初期主要參與巢內工作，如幫助蜂王泌蠟、筑巢和哺育幼蟲等，隨著齡期的增長，各種活動逐漸變多，其表達量也逐漸增長；中期時，更多的壯年工蜂主要擔負著食物的采集與蜂群的守衛，耗能相對較大，因而BhTre-1表達量最大。而在工蜂生命后期，其社會分工再次轉向巢內，并逐漸衰老，各種生理活動相對減少，因此其表達量再次下降，但BhTre-1的表達情況與蜂群的社會分工是否存在協同發展的關系還有待進一步探討。

4　結論

克隆得到小峰熊蜂BhTre-1全長cDNA序列，其分子生物學特性與其他昆蟲Tre-1一致，該基因在小峰熊蜂中腸中表達量最高，此外，幼蟲和蛹的表達量低于成年工蜂，工蜂出房后表達量呈現先升高后降低的趨勢，研究結果為闡明BhTre-1在小蜂熊蜂整個發育階段的生物學功能奠定了基礎。

References

［1］Williams P H，An J D，Huang J X，Yao J. A new initiative to document Chinese bumble bees for pollination research. Journal of Apicultural Research and Bee World，2010，49：221-222.

［2］吳杰，安建東，姚建，黃家興，馮學全.河北省熊蜂屬區系調查（膜翅目，蜜蜂科）.動物分類學報，2009，34（1）：87-97. Wu J，An J D，Yao J，Huang J X，Feng X Q. Bombus fauna（Hymenoptera，Apidae）in Hebei，China. Acta Zootaxonomica Sinica，2009，34（1）：87-97.（in Chinese）

［3］安建東，黃家興，Williams P H，吳杰，周冰峰.河北地區熊蜂物種多樣性與蜂群繁育特性.應用生態學報，2010，21：1542-1550. An J D，Huang J X，Williams P H，Wu J，Zhou B F. Species diversity and colony characteristics of bumblebees in the Hebei region of North China. Chinese Journal of Applied Ecology，2010，21：1542-1550.（in Chinese）

［4］Thompson S N. Trehalose-the insect ‘blood' sugar. Advance in Insect Physiology，2003，31：205-285.

［5］于彩虹，盧丹，林榮華，王曉軍，姜輝，趙飛.海藻糖-昆蟲的血糖.昆蟲知識，2008，45（5）：832-837. Yu C H，Lu D，Lin R H，Wang X J，Jiang H，Zhao F. Trehalose-the blood sugar in insects. Chinese Bulletin of Entomology，2008，45（5）：832-837.（in Chinese）

［6］王軍娥，劉靜.海藻糖酶的研究進展.貴州農業科學，2009，37（4）：88-90.

Wang J E，Liu J. Research progress of insect trehalase. Guizhou Agricultural Sciences，2009，37（4）：88-90.（in Chinese）

［7］Tatun N，Singtripop T，Tungjitwitayakul J，Sakurai S. Regulation of soluble and membrane-bound trehalase activity and expression of the enzyme in the larval midgut of the bamboo borer Omphisa fuscidentalis. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38：788-795.

［8］張文慶，陳曉菲，唐斌，田宏剛，陳潔，姚瓊.昆蟲幾丁質合成及其調控研究前沿.應用昆蟲學報，2011，48（3）：475-479. Zhang W Q，Chen X F，Tang B，Tian H G，Chen J，Yao Q. Insect chitin biosynthesis and its regulation. Chinese Journal of Applied Entomology，2011，48（3）：475-479.（in Chinese）

［9］Mitsumasu K，Kanamori Y，Fujita M，Iwata K，Tanaka D，Kikuta S，Watanabe M，Cornette R，Okuda T，Kikawada T. Enzymatic control of anhydrobiosis-related accumulation of trehalose in the sleeping chironomid，Polypedilum vanderplanki. The FEBS Journal，2010，277：4215-4228.

［10］Ponnuvel K M，Murthy G N，Awasthi A K，Rao G，Vijayaprakash N B. Differential gene expression during early embryonic development in diapause and non-diapause eggs of multivoltine silkworm Bombyx mori. Indian Journal of Experimental Biology，2010，48：1143-1151.

［11］Clegg J，Evans D. Blood trehalose and flight metabolism in the blowfly. Science，1961，134：54-55.

［12］Tang B，Chen X F，Liu Y，Tian H G，Liu J，Hu J，Xu W H，Zhang WQ. Characterization and expression patterns of a membrane-bound trehalase from Spodoptera exigua. BMC Molecular Biology，2008，9：51.

［13］Gu J H，Shao Y，Zhang C W，Liu Z W，Zhang Y J. Characterization of putative soluble and membrane-bound trehalases in a hemipteran insect，Nilaparvata lugens. Journal of Insect Physiology，2009，55：997-1002.

［14］Forcella M，Cardona F，Goti A，Parmeggiani C，Cipolla L，Gregori M，Schirone R，Fusi P，Parenti P. A membrane-bound trehalase from Chironomus riparius larvae：purification and sensitivity to inhibition. Glycobiology，2010，20（9）：1186-1195.

［15］Takiguchi M，Niini T，Su Z H，Yaginuma T. Trehalase from male accessory gland of an insect，Tenebrio molitor cDNA sequencing and developmental profile of the gene expression. Biochemistry Journal，1992，288：19-22.

［16］劉曉健，張歡歡，李大琪，崔淼，馬恩波，張建珍.飛蝗可溶型海藻糖酶基因的序列分析及mRNA表達特性.昆蟲學報，2012，55（11）：1264-1271.

Liu X J，Zhang H H，Li D Q，Cui M，Ma E B，Zhang J Z. Sequence characterization and mRNA expression profiling of a soluble trehalase gene in Locusta migratoria（Orthoptera：Acrididae）. Acta Entomologica Sinica，2012，55（11）：1264-1271.（in Chinese）

［17］Ge L Q，Zhao K F，Huang L J，Wu J C. The effects of triazophos on the trehalose content，trehalase activity and their gene expression in the brown planthopper Nilaparvata lugens（St?l）（Hemiptera：Delphacidae）. Pesticide Biochemistry and Physiology，2011，100：172-181.

［18］Chen J，Tang B，Chen H X，Yao Q，Huang X F，Chen J，Zhang D W，Zhang W Q. Different functions of the insect soluble and membrane-bound trehalase genes in chitin biosynthesis revealed by RNA interference. PLoS One，2010，5（4）：e10133.

［19］Mitsumasu K，Azuma M，Niimi T，Yamashita O，Yaginuma T. Membrane-penetrating trehalase from silkworm Bombyx mori. Molecular cloning and localization in larval midgut. Insect Molecular Biology，2005，14（5）：501-508.

［20］唐斌，魏蘋，陳潔，王世貴，張文慶.昆蟲海藻糖酶的基因特性及功能研究進展.昆蟲學報，2012，55（11）：1315-1321.

Tang B，Wei P，Chen J，Wang S G，Zhang W Q. Progress in gene features and functions of insect trehalases. Acta Entomologica Sinica，2012，55（11）：1315-1321.（in Chinese）

［21］陳靜，張文慶.褐飛虱膜結合型海藻糖酶基因的RNAi研究.http：//www.paper.edu.cn.2010.

Chen J，Zhang W Q. Functional analysis of membrane-bound trehalase gene of Nilaparvata lugens by RNA interference. http：//www.paper.edu.cn. 2010.（in Chinese）

［22］張倩，魯鼎浩，蒲建，吳敏，韓召軍.灰飛虱海藻糖酶基因的克隆及RNA干擾效應，昆蟲學報，2012，55（8）：911-920. Zhang Q，Lu D H，Pu J，Wu M，Han Z J. Cloning and RNA interference effects of trehalase genes in Laodelphax striatellus（Homoptera：Delphacidae）. Acta Entomologica Sinica，2012，55（8）：911-920.（in Chinese）.

［23］Kamei Y，Hasegawa Y，Niimi T，Yamashita O，Yaginuma T. Trehalase-2 protein contributes to trehalase activity enhanced by diapause hormone in developing ovaries of the silkworm，Bombyx mori. Journal of Insect Physiology，2011，57（5）：608-613.

［24］譚永安，肖留斌，孫洋，柏立新.綠盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表達純化與酶學特性.中國農業科學，2013，46（17）：3587-3593.

Tan Y A，Xiao L B，Sun Y，Bai L X. Prokaryotic expression，purification and functional activity assay in vitro of soluble trehalse from Apolygus lucorum. Scientia Agricultura Sinica，2013，46（17）：3587-3593.（in Chinese）

［25］譚永安，肖留斌，柏立新，孫洋.綠盲蝽膜結合型海藻糖酶ALTre-2基因表達、純化及酶學特性.棉花學報，2013，25（5）：396-402.

Tan Y A，Xiao L B，Bai L X，Sun Y. Expression，purification and enzymatic activity of a membrane-bound trehalse gene from Apolygus lucorum. Cotton Science，2013，25（5）：396-402.（in Chinese）

［26］Bansal R，Main M A R，Mittapalli O，Michel A P. Molecular characterization and expression analysis of soluble trehalase gene in Aphis glycines，a migratory pest of soybean. Bulletin of Entomological Research，2013，103：286-295.

［27］于彩虹，黃瑩，林榮華，姜輝，王文濤，裴力.五種昆蟲可溶性海藻糖酶活性比較.植物保護，2013，39（4）：5-9.

Yu C H，Huang Y，Lin R H，Jiang H，Wang W T，Pei L. Comparative tests of soluble trehalase activitives of five insects. Plant Protection，2013，39（4）：5-9.（in Chinese）

［28］Wang J，He W B，Su Y L，Bing X L，Liu S S. Molecular characterization of soluble and membrane-bound trehalases of the whitefly，Bemisia tabaci. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2014，85（4）：216-233.

［29］Lee J H，Saito S，Mori H，Nishimoto M，Okuyama M，Kim D，Wongchawalit J，Kimura A，Chiba S. Molecular cloning of cDNA for trehalase from the European honeybee，Apis mellifera L.，and its heterologous expression in Pichia pastoris. Bioscience，Biotechnology，Biochemistry，2007，71（9）：2256-2265.

［30］廖秀麗.小峰熊蜂的乙酰膽堿酯酶時空表達特性研究[D].北京：中國農業科學院，2012.

Liao X L. Temporal and spatial expression of acetylcholinesterase in the bumblebee Bombus hypocrite（Hymenoptera：Apidae）[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2012.（in Chinese）

［31］魏蘋.赤擬谷盜海藻糖酶基因調控后幾丁質合成及能量代謝的功能研究[D].杭州：杭州師范大學，2013.

Wei P. Regulation functions of trehalase in the pathway of energy metabolism and chitin biosynthesis in Tribolium castaneum revealed by RNA interference[D]. Hangzhou：Hangzhou Normal University，2013.（in Chinese）

［32］Silva M C P，Ribeiro A F，Terra W R，Ferreira C. Sequencing of Spodoptera frugiperda midgut trehalases and demonstration of secretion of soluble trehalase by midgut columnar cells. Insect Molecular Biology，2009，18（6）：769-784.

［33］Tan Y A，Xiao L B，Sun Y，Zhao J，Bai L X. Molecular characterization of soluble and membrane-bound trehalases in the cotton mirid bug，Apolygus lucorum. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2014，86（2）：107-121.

［34］高麗嬌，黃家興，吳杰.小峰熊蜂蜂毒磷脂酶A2基因的克隆及表達分析.昆蟲學報，2013，56（9）：974-981.

Gao L J，Huang J X，Wu J. Cloning and expression analysis of a gene encoding phospholipase A2 from the venom of Bombus hypocrite（Hymenoptera：Apidae）. Acta Entomologica Sinica，2013，56（9）：974-981.（in Chinese）

［35］徐龍龍，吳杰，郭軍，李繼蓮.共生菌群在熊蜂生長發育過程中的動態變化.中國農業科學，2014，47（10）：2030-2037. Xu L L，Wu J，Guo J，Li J L. Dynamic variation of symbionts in bumblebees during hosts growth and development. Scientia Agricultura Sinica，2014，47（10）：2030-2037.（in Chinese）

［發表于：中國農業科學， 2015，48（2）：370-380］