中國明亮熊蜂復合種的分子鑒定及分布特性

劉蘋1，2，黃家興2，*，安建東2，和紹禹1，吳杰2，*

（1.云南農業大學東方蜜蜂研究所，昆明650201；

2.中國農業科學院蜜蜂研究所，農業部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室，北京100093）

摘要：【目的】為了探明中國境內明亮熊蜂復合種Bombus lucorum complex的物種組成及其分布特性。【方法】利用DNA條形碼技術對來源于中國境內的明亮熊蜂復合種的223個標本進行了鑒定，并根據鑒定結果分析了各物種的分布特性。【結果】中國境內明亮熊蜂復合種包括地熊蜂B. terrestris、隱熊蜂B. cryptarum、明亮熊蜂B. lucorum和長翅熊蜂B. longipennis。4種熊蜂共獲得160條DNA條形碼序列，包含36個單倍型，其中B. longipennis單倍型最多，為14個；B.terrestris最少，為3個。B. terrestris和B. lucorum親緣關系最遠，其遺傳距離為0.077；B.lucorum和B.longipennis親緣關系最近，其遺傳距離為0.034。系統進化分析（貝葉斯法和最大似然法）表明，4種熊蜂的分化先后順序為B. terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B.cryptarum。4種熊蜂的分布格局不同，平均分布海拔高度由高到低的順序依次為B. longipennis，B. cryptarum，B. lucorum和B. terrestris。B. longipennis發現于高海拔的青藏高原東部及南部地區，而B. terrestris僅發現于低海拔的新疆西北部邊界地帶。【結論】本研究探明了中國境內明亮熊蜂復合種的分類地位及其分布特性，為深入研究該類群的資源保護和農業授粉利用奠定了基礎。

關鍵詞：明亮熊蜂復合種；隱存種；DNA條形碼；遺傳多樣性；系統進化；分布格局

中圖分類號：Q969　　文獻標識碼：A　　文章編號：0454-6296（2014）02-0235-09

Molecular identification and distribution characteristics of the bumblebee Bombus lucorum complex in China

LIU Ping1，2，HUANG Jia-Xing2，*，AN Jian-Dong2，HE Shao-Yu1，WU Jie2，*

（1. Eastern Bee Research Institute，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2. Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology of the Ministry of Agriculture，Institute of Apiculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093，China）

基金項目：國家自然科學基金國際合作與交流項目（31211130110）；國家蜜蜂產業技術體系建設專項經費項目（CARS-45）；

公益性行業（農業）科研專項課題（201203080-4）；農業國際交流與合作項目（A6950）

作者簡介：劉蘋，女，1988年生，天津人，碩士研究生，研究方向為傳粉昆蟲資源學，E-mail：liuping0609@163.com

*通訊作者Corresponding authors，E-mail：huangjiaxing@caas.cn；apis@vip.sina.com

收稿日期Received：2013-12-08；接受日期Accepted：2014-02-07

Abstract　【Aim】To explore the species composition and distribution characteristics of the bumblebee Bombus lucorum complex in China. 【Methods】DNA（COI）barcodes were used to identify larger new samples of B.lucorum complex from China and then the distribution patterns of these species were plotted using these samples. 【Results】B. lucorum complex in China includes four cryptic species， i. e.， B. terrestris， B. cryptarum， B. lucorum and B. longipennis. From a total of 160 COI barcode sequences from the four species，36 unique haplotypes were identified，with the highest diversity occurring within B. longipennis （14 haplotypes）and the lowest within B.terrestris（3 haplotypes）.The longest genetic distance（0.077）was found between B. terrestris and B. lucorum，and the shortest（0.034）was found between B. lucorum and B. longipennis.Phylogenetic analysis of Bayesian and Maximum-likelihood methods showed that the divergence of the four species occurred in the order of B.terrestris，B.longipennis，B.lucorum，and B.cryptarum.Distribution patterns differed among the four species.The mean elevation of the four species ranks from high to low in the order of B.longipennis，B.cryptarum，B.lucorum，and B. terrestris. B. longipennis was found only at high elevation in the eastern and the southern Qinghai-Tibetan plateau，while B. terrestris was found only at low elevation in northwestern Xinjiang.【Conclusion】 This study clarifies the species composition and distribution patterns of the bumblebee B.lucorum complex in China，which will be useful for further studies on resource conservation of these valuable bumblebee taxa and their use in agricultural pollination

Key words　Bombus lucorum complex；cryptic species；DNA barcoding；genetic diversity；phylogenetic relationship；distribution pattern

熊蜂Bombus spp.是一類重要的傳粉昆蟲，在維持自然生態系統平衡和農業生產中發揮著十分重要的作用（Goulson et al.，2008；Vergara and Fonseca-Buendía，2012）。目前，全世界已知熊蜂種類約250種，其中中國超過110種，為世界上熊蜂資源最豐富的國家（Cameron et al.，2007；Williams et al.，2010；An et al.，2011）。近年來，由于氣候變化、農業集約化、城鎮化發展和食物源變化等因素，導致世界不同地區熊蜂種群數量明顯下降，甚至部分地方出現種群滅絕現象（Williams，1982，2005；Rasmont et al.，2005；Fitzpatrick et al.，2007；Goulson et al.，2008）。因此，如何有效地保護熊蜂資源，探明熊蜂種群下降的原因成為當務之急。準確鑒定熊蜂種類、了解其分布特性及觀測種群動態變化是挖掘可利用熊蜂資源的前提，也是保護和利用我國豐富熊蜂資源的重要舉措。

熊蜂為農作物授粉每年所產生的經濟價值高達數十億美元（Velthuis and van Doorn，2006；Carolan et al.，2012；Williams et al.，2012a），應用前景十分廣闊。目前，大部分商業化飼養的熊蜂種屬于真熊蜂亞屬Bombus s. str.，該亞屬內有許多種類的形態特征非常相似，利用傳統的形態學方法很難鑒定。這些形態特征很難區分的種類，通常被稱為隱存種（cryptic species）或復合種（species complex）。例如，歐洲的明亮熊蜂B.lucorum、隱熊蜂B.cryptarum和B. magnus無可靠的形態學鑒定特征，多年來一直被稱為明亮熊蜂復合種Bombus lucorum complex（Pamilo et al.，1984；Carolan et al.，2012）。東亞地區地形、植被與氣候類型多樣，熊蜂復合種更為豐富，僅靠形態特征難以區分（An et al.，2011；Williams et al.，2012b），應用分子生物學手段使得熊蜂復合種的鑒定變得更為準確。Bertsch等（2009）利用COI序列成功鑒定了歐洲地區明亮熊蜂復合種，包括B. terrestris，B.lucorum，B. cryptarum和B.magnus。Carolan等（2012）認為B.lucorum，B.cryptarum和B.magnus3種熊蜂的體色型（color pattern）變異非常大，無法利用唯一的體色型加以區分，DNA條形碼序列卻可以有效地對其進行鑒定。Williams等（2012b）對整個真熊蜂亞屬的種類進行修訂時發現，僅依靠形態學特征鑒定熊蜂種是不可靠的，且常常會造成錯誤鑒定，而利用DNA條形碼數據可有效揭示種間差異。Vesterlund等（2014）利用PCR-RFLP技術對真熊蜂亞屬內4種復合蜂種進行了鑒定，并證明該技術可以有效地鑒定基因組DNA降解的標本。綜上所述，相對于傳統的形態學方法，分子生物學技術可以更加有效地鑒定熊蜂復合種，尤其是DNA條形碼技術不失為一種重要的研究手段。

20世紀90年代，線粒體COI基因序列已被應用于熊蜂系統進化研究中，并被證明是一種有效的方法（Pedersen，1996），但并未形成標準的方法。Hebert等（2003）研究發現線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因（cytochrome coxidaseⅠ，COI）中的一段648bp片段，可在DNA水平上區分不同物種，該方法逐步發展并成為物種鑒定的重要依據之一，即DNA條形碼技術。目前，DNA條形碼作為一種成熟的技術已被廣泛應用于昆蟲的種類鑒定和系統進化研究當中（St?hls et al.，2009；Wang and Qiao，2009；Boehme et al.，2010）。

我們利用DNA條形碼技術，研究了近年來采自中國境內的真熊蜂亞屬明亮熊蜂復合種B.lucorum complex的大量標本，旨在探明該復合種在中國的物種組成及其分布特性，為深入研究該類群的資源保護及開發利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

采集標本時，利用全球定位系統GPS（Garmin 60CS）記錄每個采集點的海拔高度、經度和緯度等信息。針插標本保存于中國農業科學院蜜蜂研究所熊蜂標本室。基于2005-2013年的調查數據，根據明亮熊蜂復合種在中國境內的分布特點，選擇51個主要分布點的223個標本作為本研究材料。實驗用標本由英國自然歷史博物館生命科學系Paul Williams博士依據真熊蜂亞屬的形態特征（Williams et al.，2008）鑒定為明亮熊蜂復合種（圖1）。除中國境內該復合種的序列外，其余用于構建系統進化關系的序列均由Paul Williams博士提供。

1.2　基因組DNA提取

取復合種熊蜂的右前足或中足，置于1.5mL離心管中，加入液氮冷凍，用研磨棒研磨至粉末狀；利用昆蟲DNA提取試劑盒Insect DNA Kit（OMEGA Inc.）提取基因組DNA（按試劑盒說明書操作）。提取完成后，取5μL總DNA進行1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。對電泳檢測合格的樣品基因組DNA進行編號，存于-20℃備用。

1.3　PCR擴增及序列測定

將提取的復合種熊蜂基因組DNA進行PCR擴增，引物為Hebert等（2004）設計的膜翅目昆蟲DNA條形碼通用引物LepF 5'-ATTCAACCAAT-CATAAAGATAT TGG-3’和LepR 5'-TAAACTTCTG-GATGTCCAAAAAATCA-3'。反應體系如下：PCR Mix 25μL、10μmol/L引物各2μL、模板DNA 2μL，然后，補足ddH2O至50μL。反應程序如下：94℃預變性5min，然后，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環；最后，72℃再延伸10min。擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選擇陽性擴增送北京博邁德生物技術有限公司雙向測序。

1.4　序列分析

利用BioEdit 7.0.9軟件對所測得的序列進行校正和拼接，同時，去除低質量序列（Hall，1999）。將處理后的序列利用BOLD V3.6在線平臺的物種鑒定功能進行種類鑒定（http：//www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine，2013年可訪問）。應用Clustal X2對鑒定的序列進行多序列比對（Larkin et al.，2007），結果導入DnaSP 5.0軟件，分析單倍型數、單倍型多樣性、核苷酸多態性和平均核苷酸差異數（Librado and Rozas，2009）；利用MEGA 5.1軟件，統計保守位點數、多態位點數、簡約信息位點、單核苷酸變異位點數、平均堿基組成、遺傳距離和核苷酸差異（Tamura et al.，2011）。

1.5　系統進化

以B.vagans和B.alpinus熊蜂為外群，利用模型優化分析軟件jModelTest 2.1.3獲得最優模型（Darriba et al.，2012）。利用MEGA 5.1軟件構建最大似然樹（maximum-likelihood tree），系統樹節點的置信度由自舉值（bootstrap value）進行估計，重復次數為1000（Tamura et al.，2011）；利用MrBayes 3.2軟件構建貝葉斯系統進化樹，世代數為107，老化值為世代數的10％，模型為jModelTest優化所獲得的最優模型，各節點的置信度由后驗概率（poster probability）進行估計（Ronquist et al.，2012）。利用Figtree 1.4.0進行顯示和編輯構建的系統樹。

1.6　地理分布分析

根據分子鑒定的結果，結合每個標本的經度、緯度和海拔高度等采集記錄信息，利用ArcMAP 10.2軟件分析該復合種各種熊蜂的分布特征。

2　結果

2.1　DNA條形碼序列分析

實驗總共提取到223個熊蜂標本的基因組DNA，利用標準昆蟲條形碼序列引物進行PCR擴增、測序，共獲得了160個標本的DNA條形碼序列。經過BioEdit軟件校對，所有獲得的序列有效長度均為658bp，表明序列所有位點未發現插入或缺失突變。將處理后的序列利用BOLD V3.6在線平臺的物種鑒定功能進行種類鑒定，確定為B.terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B. cryptarum。4種隱存種熊蜂種的序列堿基組成差異不大，A，T，G和C堿基的平均含量分別為33.5％，43.6％，10.1％和12.8％；其中A + T含量（77.1％）大于G + C含量（22.9％）。利用MEGA軟件對DNA條形碼序列變異分析（包括兩個外群），結果顯示，這些序列包含519個保守位點，139個變異位點，77個簡約性位點，62個單變異位點。

利用DnaSP軟件對序列進行單倍型分析，結果表明，所獲得的160個熊蜂標本的DNA條形碼序列中共有36個單倍型，群體的單倍型多樣性為0.891，平均核苷酸差異為24.975，核苷酸多樣度為0.03768。B.cryptarum種內平均核苷酸差異最大（4.816），核苷酸多樣度也最大（0.00732），表明其遺傳多樣性最豐富；B. terrestris平均核苷酸差異最小（0.207），核苷酸多樣度也最小（0.00032），表明其遺傳多樣性較貧乏。長翅熊蜂B.longipennis的單倍型多樣度最高（0.827），說明其遺傳資源較豐富。采用Tajima's D值中性檢驗對4種隱存種熊蜂DNA條形碼序列進行檢驗，B. cryptarum，B.terrestris和B. lucorum差異均不顯著，符合中性突變，說明這些蜂種歷史上未出現過群體擴張，群體大小穩定；B.longipennis的Tajima's D值差異達到顯著水平，說明該蜂種歷史上出現過種群擴張（表1）。

N：DNA條形碼序列數Sequence number of DNA barcodes；H：單倍型數Number of haplotypes；Hd：單倍型多樣性Haplotype diversity；K：平均核苷酸差異數Average number of nucleotide differences；Pi：核苷酸多樣度Nucleotide diversity；D：中性檢驗Tajima's test.*：差異顯著（P＜0.05）Significant difference at the 0.05 level.

2.2　遺傳距離分析

利用MEGA軟件Kimura雙參數模型對4種隱存種熊蜂種間的遺傳距離進行分析（表2），結果表明，種間的遺傳距離范圍為0.034～0.077。方差分析顯示， 4種隱存種熊蜂的遺傳距離均達到極顯著水平（P＜0.01），說明4種隱存熊蜂種間存在較大的遺傳差異。其中，B. terrestris和B. lucorum的種間遺傳距離最大（0.077），兩者親緣關系最遠；B. lucorum和B. longipennis的種間遺傳距離最小（0.034），兩者親緣關系最近。B. terrestris和B. longipennis，B. cryptarum或B. lucorum的遺傳距離分別為0.065，0.068和0.077，說明B. terrestris與其他3種的親緣關系較遠。

下三角數據表示遺傳距離；上三角數據表示方差分析結果。The lower triangular data represent the genetic distance，while the upper triangle data represent the results of analysis of variance. **：差異達到極顯著水平（P＜0.01）Significant difference at the 0.01 level.

2.3　系統進化樹

本研究以B.alpinus和B.vagans為外群，利用MrBayes軟件對真熊蜂亞屬內的蜂種系統進化分析（圖2），結果顯示，4種隱存種熊蜂的單倍型序列都與已知種（B. terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B. cryptarum）的單倍型序列聚在一起，形成不同的分支，說明所分析的標本為B. terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B. cryptarum 4種熊蜂，也證明了所獲得的DNA條形碼序列能夠有效應用于隱存種的鑒定。從樹圖可知，利用MEGA軟件的最大似然法和MrBayes軟件的貝葉斯法對所測4種隱存熊蜂的DNA條形碼序列進行系統進化分析（圖3），結果顯示，兩種系統進化分析方法的結果相似，即4種隱存種熊蜂復合群被分成4大分支，對應于4種隱存種B.terrestris，B.longipennis，B.lucorum和B.cryptarum種群。貝葉斯的后驗概率顯示，所有種的分支后驗概率均大于0.96；最大似然法種的分支自舉值均大于92，以上2種分析方法均支持將4種隱存熊蜂分成4個種。在系統樹上，B. terrestris處于4種隱存熊蜂的最基部，說明該種分化最早且與其他3種的親緣關系相對較遠；而B. lucorum，B. cryptarum和B. longipennis3種熊蜂形成一個大分支，說明這3種蜂的親緣關系較近。

2.4　4種隱存種熊蜂種的分布特性

利用ArcMAP軟件分析4種隱存種熊蜂在中國的地理分布格局，結果顯示：B. longipennis具有單獨的地理分布區域，與其他3種隱存種熊蜂的地理分布隔離，在中國分布范圍南北跨度大，主要包括青藏高原的南部及東部地區，分布省份為西藏、云南、陜西、甘肅、寧夏，屬于東洋區和古北區均有分布的熊蜂種類；B. cryptarum分布于新疆、內蒙古及山西；B. terrestris僅分布新疆西北地區，伊犁河谷以北及阿爾泰山脈；B. lucorum分布于新疆及內蒙古高原，屬于古北區的熊蜂種類（圖4）。

根據基因鑒定結果，分析每一種熊蜂各個采集地的海拔高度和經緯度數據。結果表明，B. longipennis分布地的海拔高度和經緯度與其他3種隱存蜂種差異較大，其分布地的平均海拔最高，分布范圍為1906～4466m，集中分布在2800～4000m，緯度小于38°N；B. terrestris分布地的平均海拔最低，分布范圍為762～1408m；B. lucorum分布范圍為567～2731m，集中分布在1000～2000m；B. cryptarum分布范圍為883～3108m，集中分布在2000～3000m。B.lucorum，B.cryptarum和B.terrestris3種熊蜂分布地的海拔高度和緯度存在重疊區，其中，B.cryptarum集中分布于較高海拔地區，B. terrestris分布于較低海拔地區，3種蜂集中分布在緯度40°～50°N之間（圖5～圖6）。

3　討論

熊蜂是一類體色相對多變的社會性昆蟲，存在形態特征趨同進化的現象，給傳統形態學鑒定帶來一定的困難。真熊蜂亞屬內存在許多隱存種，如B. lucorum，B. cryptarum和B.magnus復合種一直為該亞屬內種類鑒定的爭論焦點（Pamilo et al.，1984；Carolan et.al.，2012；Williams et al.，2012b；Vesterlund et al.，2014）。成功區分這些隱存種，對物種的保護和人工利用具有重要的指導意義，而DNA條形碼技術不失為一種有效手段（Carolan et al.，2012；Williams et al.，2012b）。本研究首次應用DNA條形碼技術對中國4種隱存種熊蜂進行了研究，發現DNA條形碼序列能夠有效揭示4種隱存熊蜂的差異，DNA條形碼序列的堿基組成具有明顯偏好性， A + T含量遠大于G + C含量，符合蜜蜂科昆蟲線粒體基因組和COI基因的序列特征（Crozier and Crozier，1993；Pedersen，1996；Williams et al.，2012b），因此，可以說明本研究中所測序列來源于線粒體，而非核基因序列。所測DNA條形碼序列未發現有插入和缺失現象，序列的信息位點豐富，且種間差異明顯，表明DNA條形碼技術可成功應用于該隱存種復合種的鑒定。

在4種隱存種熊蜂單倍型多樣性分析中，B. longipennis的多樣度最高，中性檢測結果表明B. longipennis在歷史上經歷過種群擴張，這與該種熊蜂在中國境內的分布廣和豐度高有密切關系，而其余3種隱存種熊蜂群體大小穩定，未出現過群體擴張。遺傳距離分析顯示，B. terrestris與其他3種隱存蜂種遺傳距離遠，這與作者進行RAPD擴增時，隨機引物容易區分B.terrestris與其他3種熊蜂的結果相一致（未發表資料），而B. lucorum，B. cryptarum和B. longipennis3種熊蜂很難利用隨機引物進行區分，亦充分說明其分化時間較短，其遺傳差異較小，為開發區分3種蜂的特異性分子標記帶來困難。

利用真熊蜂亞屬內的已知熊蜂種序列與本研究獲得的4種隱存種熊蜂單倍型序列構建系統進化樹，發現所構建的系統進化樹與Williams等（2012b）所構建的系統進化樹結構一致，說明所構建的系統進化樹可靠。4種隱存種熊蜂的單倍型序列與已知序列的4種熊蜂聚成相應的分支，且后驗概率值都高于0.96，說明利用DNA條形碼對這4種隱存種熊蜂的鑒定結果穩定。利用最大似然法和貝葉斯法構建4種熊蜂系統進化樹，二者所構建的系統進化樹結構相似。利用最大似然法構建的系統進化樹，表明B. longipennis和B. cryptarum為較晚分化群，但其節點的自舉值較低，說明該節點為獨立一分支的結論不可靠，貝葉斯法分析表明B. longipennis和B. lucorum為最晚分化群，但其后驗概率值只有0.4037，說明該節點為一分支的結論也不可靠，故兩種分析方法所構建的系統進化樹的結果一致，因此，當利用DNA條形碼序列進行真熊蜂亞屬的系統進化分析時，較深節點的后驗概率小，如需準確獲得4種隱存種熊蜂的系統進化關系還需進一步利用其他基因序列進行預測。

對4種隱存熊蜂種的地理分布進行分析，結果發現B. terrestris僅分布于中國新疆的西北部地區。由于該種熊蜂具有很強的入侵性，易于在引入地筑巢及繁殖，與當地熊蜂種類形成食物競爭且易引入異源病蟲害，對當地的熊蜂種群造成威脅，故該蜂種已被許多國家列為入侵物種，禁止人為引入（Kingston et al.，2002；Kanbe et al.，2008；Kadoya et al.，2009）。我國內地與新疆被戈壁灘和大山脈天然隔離，因此，在制定熊蜂保護策略上應禁止人為引入該熊蜂種進入內地，防止其入侵，以免對內地豐富的熊蜂資源造成重大威脅。種類分布海拔和緯度均顯示，B. longipennis與其他3種隱存蜂種具有明顯差異，表現在其分布海拔高、緯度小于北緯38°，因此，可以結合其分布特性進行進一步的人工利用。B. lucorum，B. cryptarum和B. terrestris3種熊蜂的分布海拔高度具有重疊區，而B. cryptarum分布于較高地區，B. terrestris分布于較低地區，故分布海拔高度也可以作為蜂種鑒定的依據之一。但因采集到的標本數量有限，如需精確獲得明亮熊蜂復合種4種隱存熊蜂在中國境內的分布格局，還需繼續增加標本采集量和擴大標本采集范圍。

熊蜂在中國分布范圍極廣，僅個別地區未發現，是世界上熊蜂種類最豐富的國家，占世界熊蜂種類的46％（潘菲洛夫，1957；Williams et al.，2010），如何有效保護和利用中國豐富的熊蜂資源已成為一大焦點和難題。對熊蜂種類（尤其是隱存種）進行精確鑒定，明確其分布特性，以摸清我國熊蜂資源家底，是指導熊蜂種保護政策制定、合理開發利用的重要依據。本文首次采用DNA條形碼技術鑒定和區分了中國明亮熊蜂隱存種，并闡明其各自的分布特性，為其進一步的資源保護和開發利用提供了一定的理論借鑒，這僅是中國熊蜂資源保護和利用工作的起步階段，對于中國熊蜂的分類、保護和利用仍有大量的研究工作亟待進行。

致謝

中國農業科學院蜜蜂研究所羅術東、周志勇、郭軍、徐龍龍等，甘肅養蜂研究所張世文、祁文忠、繆正瀛等，以及寧夏固原市養蜂試驗站王彪、褚忠橋等同志幫忙采集熊蜂標本；英國自然歷史博物館生命科學系Paul H. Williams博士饋贈該復合種的部分序列并在形態學鑒定上給予幫助。在此一并表示感謝。

參考文獻（References）

An JD，Williams PH，Zhou B，Miao Z，Qi W，2011.The bumblebees of Gansu，Northwest China（Hymenoptera，Apidae）.Zootaxa，2865，1-36.

Bertsch A，2009. Barcoding cryptic bumblebee taxa： B. lucorum， B. cryptarum and B. magnus，a case study. Beitr?ge zur Entomologie，59（2）：287-310.

Boehme P，Amendt J，Disney RHL，Zehner R，2010. Molecular identification of carrion-breeding scuttle flies（Diptera：Phoridae）using COI barcodes.International Journal of Legal Medicine，124（6）：577-581.

Cameron SA，Hines HM，Williams PH，2007.A comprehensive phylogeny of the bumble bees（Bombus）.Biological Journal of the Linnean Society，91（1）：161-188.

Carolan JC，Murray TE，Fitzpatrick ù，Crossley J，Schmidt H，Cederberg B，McNally L，Paxton RJ，Williams PH，Brown MJF，2012.Colour patterns do not diagnose species：quantitative evaluation of a DNA barcoded cryptic bumblebee complex.PLoS ONE，7（1）：e29251.

Crozier RH，Crozier YC，1993. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera：complete sequence and genome organization.Genetics Society of America，133（1）：97-117.

Darriba D，Taboada GL，Doallo R，Posada D，2012. jModelTest 2：more models，new heuristics and parallel computing. Nature Methods，9（8）：772.

Fitzpatrickù，Murray TE，Paxton RJ，Breen J，Cotton D，Santorum V，Brown MJF，2007. Rarity and decline in bumblebees-a test of causes and correlates in the Irish fauna.Biological Conservation，136（2）：185-194.

Goulson D，Lye GC，Darvill B，2008.Decline and conservation of bumble bees.Annual Review of Entomology，53：191-208.Hall TA，1999. BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95 /98 / NT. Nucleic Acids Symposium Series，41：95-98.

Hebertp DN，Penton EH，Burns JM，Janzen DH，Hallwachs W，2004. Ten species in one：DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，101（41）：14812-14817.

Hebertp DN，Ratnasingham S，De Waard JR，2003. Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species.Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，270（Suppl.1）：96-99.

Kadoya T，Ishii HS，Kikuchi R，Suda SI，Washitani I，2009. Using monitoring data gathered by volunteers to predict the potential distribution of the invasive alien bumblebee Bombus terrestris.Biological Conservation，142（5）：1011-1017.

Kanbe Y，Okada I，Yoneda M，Goka K，Tsuchida K，2008.Interspecific mating of the introduced bumblebee Bombus terrestris and the native Japanese bumblebee Bombus hypocrita sapporoensis results in inviable hybrids. Naturwissenschaften，95（10）：1003-1008.

Kingston AB，Marsden-Smedley J，Driscoll DA，Corbett S，Fenton J，Anderson R，Plowman C，Mowling F，Jenkin M，Matsui K，Bonham KJ，Ilowski M，Mcquillan PB，Yaxley B，Reid T，Storey D，Poole L，Mallick ST，Fitzgerald N，Kirkpatrick JB，Febey J，Harwood AG，Michaels KF，Russell MJ，Black PG，Emmerson L，Visoiu M，Morgan J，Breen S，Gates S，Bantich MN，Desmarchelier JM，2002. Extent of invasion of Tasmanian native vegetation by the exotic bumblebee Bombus terrestris （Apoidea：Apidae）.Austral Ecology，27（2）：162-172.

Larkin MA，Blackshields G，Brown NP，Chenna R，McGettigan PA，McWilliam H，Valentin F，Wallace IM，Wilm A，Lopez R，Thompson JD，Gibson TJ，Higgins DG，2007.Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatic，23（21）：2947-2948.

Librado P，Rozas J，2009.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data.Bioinformatics，25（11）：1451-1452.

Pamilo P，Varvio-Aho SL，Pekkarinen A，1984.Genetic variation in bumblebees（Bombus，Psithyrus）and putative sibling species of Bombus lucorum.Hereditas，101（2）：245-251.

Panfilov DV（translated by Li LY），1957.The distribution of Bombus in China.Journal of Georaphical Sciences，（3）：221-239.[д.в.潘菲洛夫（李麗英譯），1957.中國熊蜂（Bombus）的分布.地理學報，（3）：221-239].

Pedersen BV，1996. A phylogenetic analysis of cuckoo bumblebees（Psithyrus，Lepeletier）and bumblebees（Bombus，Latreille）inferred from sequences of the mitochondrial gene cytochrome oxidase I. Molecular Phylogenetics and Evolution，5（2）：289-297.

Rasmont P，Pauly A，Terzo M，Patiny S，Michez D，Iserbyt S，Barbier Y，Haubruge E，2005. The survey of wild bees（Hymenoptera，Apoidea）in Belgium and France. In：Status of the World 's Pollinators. Food and Agriculture Organization of the United Nations，Rome. 18 pp.

Ronquist F，Teslenko M，van der Mark P，Ayres DL，Darling A，H?hna S，Larget B，Liu L，Suchard MA，Huelsenbeck JP，2012. MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Systematic Biology，61（3）：539-542.

St?hls G，Vujic A，Pérez-Ba?on C，Radenkovic S，Rojo S，Petanidou T，2009.COI barcodes for identification of Merodon hoverflies（Diptera，Syrphidae）of Lesvos Island，Greece.Molecular Ecology Resources，9（6）：1431-1438.

Tamura K，Peterson D，Peterson N，Stecher G，Nei M，Kumar S，2011. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution，28（10）：2731-2739.

Velthuis HHW，van Doorn A，2006. A century of advances in bumblebee domestication and the economic and environmental aspects of its commercialization for pollination.Apidologie，37（4）：421-451.

Vergara CH，Fonseca-Buendía P，2012. Pollination of greenhouse tomatoes by the Mexican bumblebee Bombus ephippiatus（Hymenoptera：Apidae）.Journal of Pollination Ecology，7（4）：27-30.

Vesterlund SR，Sorvari J，Vasem?gi A，2014. Molecular identification of cryptic bumblebee species from degraded samples using PCR-RFLP approach.Molecular Ecology Resources，14（1）：122-126.

Wang JF，Qiao GX，2009. DNA barcoding of genus Toxoptera Koch（Hemiptera：Aphididae）：identification and molecular phylogeny inferred from mitochondrial COI sequences.Insect Science，16（6）：475-484.

Williams P，2005.Does specialization explain rarity and decline among British bumblebees?A response to Goulson et al.Biological Conservation，122（1）：33-43.

Williams P，An JD，Huang JX，Yao J，2010. BBCI：a new initiative to document Chinese bumble bees for pollination research. Journal of Apicultural Research and Bee World，49（2）：221-222.

Williams PH，1982.The distribution and decline of British bumble bees（Bombus Latr.）.Journal of Apicultural Research，21（4）：236-245.

Williams PH，An JD，Brown MJF，Carolan JC，Goulson D，Huang JX，Ito M，2012a. Cryptic bumblebee species：consequences for conservation and the trade in greenhouse pollinators.PLoS ONE，7（3）：e32992.

Williams PH，Brown MJF，Carolan JC，An JD，Goulson D，Aytekin AM，Best LR，Byvaltsev AM，Cederberg B，Dawson R，Huang JX，Ito M，Monfared A，Raina RH，Hempel PS，Sheffield CS，?ima P，Xie Z，2012b. Unveiling cryptic species of the bumblebee subgenus Bombus s.str.worldwide with COI barcodes（Hymenoptera：Apidae）.Systematics and Biodiversity，10（1）：21-56.

Williams PH，Cameron SA，Hines HM，Cederberg B，Rasmont P，2008. A simplified subgeneric classification of the bumblebees（genus Bombus）.Apidologie，39（1）：46-74.

［發表于：昆蟲學報，2014，57（2）：235-243］