2　紫外-可見分光光度法

2.1方法簡介

2.1.1　方法分類

紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visiblespectrophotometry）通常是指利用物質對200～800nm光譜區域內的光具有選擇性吸收的現象，對物質進行定性和定量分析的方法。按測量光的單色程度（即含波長范圍的寬窄程度）分為分光光度法（spectrophotometry）和比色法（colorimetry）。利用比較溶液顏色深淺的方法來確定溶液中有色物質的含量方法稱比色法。應用分光光度計，根據物質對不同波長的單色光的吸收程度不同而對物質進行定性和定量分析的方法稱分光光度法（又稱吸光光度法）。分光光度法中，按所用光的波譜區域不同，又可分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。

2.1.2　基本原理

2.1.2.1　物質對光的選擇性吸收

（1）單色光和互補光　具有同一種波長的光，稱為單色光。純單色光很難獲得，激光的單色性雖然很好，但也只接近于單色光。含有多種波長的光稱為復合光，日常見到的日光、白熾燈光等白光就是由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫七色光組成的復合光。如果把適當顏色的兩種光按一定強度比例混合，也可成為白光，這兩種顏色的光稱為互補色光。圖2-1為互補色光示意圖。圖中處于直線關系的兩種顏色的光即為互補色光，如綠色光與紫色光互補、藍色光與黃色光互補等，它們按一定強度比混合都可以得到白光，所以日光等白光實際上是由一對對互補色光按適當強度比混合而成。

（2）物質顏色的產生　當一束白光通過某透明溶液時，如果該溶液對可見光區各波長的光都不吸收，即入射光全部通過溶液，這時看到的這溶液透明無色。當該溶液對可見光區各種波長的光全部吸收時，此時看到的溶液呈黑色。若某溶液選擇性地吸收了可見光區某波長的光，則該溶液即呈現出被吸收光的互補色光的顏色。例如，當一束白光通過KMnO4溶液時，該溶液選擇性地吸收了500～560nm的綠色光，而將其他的色光兩兩互補成白光而通過，只剩下紫紅色光未被互補，所以KMnO4溶液呈現紫紅色。可見物質的顏色是基于物質對光有選擇性吸收的結果，而物質呈現的顏色則是被物質吸收光的互補色。

（3）物質的吸收光譜曲線　已知溶液呈現不同的顏色，是由于物質溶液對色光的選擇性吸收。若要更精確地說明物質具有選擇性吸收不同波長范圍光的性質，則必須用光吸收曲線來描述。吸收光譜曲線是通過實驗獲得的，具體方法是：將不同波長的光依次通過某一固定濃度和厚度的有色溶液，分別測出它們對各種波長光的吸收程度（用吸光度A表示），以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，畫出曲線，此曲線即稱為該物質的光吸收曲線（或吸收光譜曲線），它描述了物質對不同波長光的吸收程度。圖2-2所示的是3種不同濃度的KMnO4溶液的3條光吸收曲線。

①高錳酸鉀溶液對不同波長的光的吸收程度是不同的，對波長為525nm的綠色光吸收最多，在吸收曲線上有一高峰（稱為吸收峰），其對應的波長稱為最大吸收波長（常以λmax表示）。②不同濃度的高錳酸鉀溶液，其吸收曲線的形狀相似，最大吸收波長也一樣。所不同的是吸收峰峰高隨濃度的增加而增高。③不同物質的吸收曲線，其形狀和最大吸收波長都各不相同。因此，可利用吸收曲線來作為物質定性分析的依據。

（4）紫外-可見吸收光譜的產生　物質對光的吸收是物質與輻射能相互作用的一種形式。攝入物質的光子能量與物質的基態和激發態能量差相等時才會被吸收。由于吸光物質的分子（或離子）只有有限數量的、量子化的能級，物質對光的吸收在波長上具有選擇性。能被某種物質吸收的波長，稱之為該物質的特征吸收波長。物質分子由于對紫外-可見區的光有選擇性吸收而使分子的外層價電子躍遷產生波長位于紫外-可見區的吸收光譜。它與原子光譜的窄吸收帶不同。由于每種電子能級的躍遷會伴隨若干振動和轉動能級的躍遷，使分子光譜呈現比原子光譜復雜得多的寬吸收帶。由于電子躍遷的類型不同，實現躍遷需要的能量不同，因而吸收的波長范圍也不相同。除電子躍遷外，電荷遷移躍遷也可產生紫外-可見吸收光譜。電荷遷移吸收光譜是指用電磁輻射照射化合物時，電子從給予體向接受體相聯系的軌道上躍遷，而產生相應的吸收光譜。例如，某些取代芳烴可產生分子內電荷遷移躍遷吸收帶。電荷遷移躍遷吸收帶的譜帶較寬，但一般吸收強度大。

2.1.2.2　定性和定量原理

（1）定性原理　由于不同的物質對不同波長光有不同的吸收度，其吸收曲線形狀和最大吸收波長λmax不同，且吸收曲線形狀和λmax也不隨其濃度改變而改變。因此，根據光譜圖上吸收光譜的形狀等特征就可以進行定性分析，吸收曲線是物質定性的基礎。

（2）定量原理　在一定的條件下，吸光物質對單色光的吸收符合朗伯-比爾定律，即

（2-1）

式中，A為吸光度；b為光程長度（即吸收池厚度），cm；c為吸光物質的物質的量濃度，mol/L；ε為摩爾吸光系數，L/（mol·cm）；T為透光率，%；I0為入射光強度；It為通過溶液后透射光的強度。

ε表示物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數，其值的大小取決于吸光物質的性質、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質等，與溶液濃度大小和液層厚度無關。摩爾吸光系數是吸光物質的重要參數之一，它表示物質對某一特定波長光的吸收能力。ε越大，表示該物質對某波長光的吸收能力越強，測定的靈敏度也就越高。因此，為了提高分析的靈敏度，通常選擇ε大的有色化合物、選擇具有εmax的波長作入射光進行測定。摩爾吸光系數由實驗測得。

朗伯-比爾定律表明：當一束平行單色光垂直入射通過均勻、透明的吸光物質的稀溶液時，溶液對光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。也就是說當b、ε一定時，吸光物質的吸光度為其濃度c的單值（線性）函數。因此對吸光物質的濃度的測試可直接歸結為對吸光度A的測試，朗伯-比爾定律是吸光光度法定量測定的理論基礎，應用于各種光度法的吸收測量。

嚴格地說，該定律只適用于稀溶液和單色光。在高濃度的溶液或采用過寬入射波長時，可能導致吸光度和濃度間的線性關系偏離朗伯-比爾定律。

2.1.3　分析條件的選擇

2.1.3.1　儀器測量條件的選擇

在測量吸光物質的吸光度時，測量準確度往往受多方面因素的影響。如儀器波長準確度、吸收池性能、參比溶液、入射光波長、測量的吸光度范圍、測量組分的濃度范圍等都會對分析結果的準確度產生影響，必須加以控制。

（1）入射光波長的選擇　當用分光光度計測定被測溶液的吸光度時，首先需要選擇合適的入射光波長。通常是根據被測物質的吸收曲線，選用最強吸收帶的最大吸收波長（λmax）作為入射光波長。這樣可以得到最大的測量靈敏度，稱為最大吸收原則。當最大吸收峰附近有干擾存在（如共存離子或所使用試劑有吸收），則在保證有一定靈敏度情況下，可以選擇吸收曲線中其他波長進行測定（應選曲線較平坦處對應的波長），以消除干擾。

（2）吸光度測量范圍的選擇　偏離朗伯-比爾定律的一些因素可以給測量帶來誤差，除此以外，儀器光源不穩定、實驗條件的偶然變動、讀數精度變動等也可以帶來測量誤差，這些因素特別是對于濃度較大或較小試樣的測定結果影響較大，這就要求選擇適宜的吸光度范圍，以使測量結果的誤差較小。研究表明，測量吸光度過高或過低，誤差都很大，一般適宜的吸光度范圍是0.2～0.8。實際工作中，可以通過調節被測溶液的濃度（如改變取樣量、改變顯色后溶液總體積等）、使用厚度不同的吸收池來調整待測溶液吸光度，使其在適宜的吸光度范圍內。

2.1.3.2　顯色反應條件的選擇

使用紫外-可見分光光度法對一些物質進行測定時，由于其在測定波長范圍內不產生吸收或吸收不大，常常利用顯色反應將被測組分轉變為一定波長范圍內有吸收或吸收較大的物質。常見的顯色反應有氧化還原反應、配位反應以及增加生色團的衍生化反應等，其中配位反應應用最為普遍。同一種組分可與多種顯色劑發生反應，在分析時，選擇合適的顯色反應，并嚴格控制反應條件是十分重要的實驗技術。

（1）顯色劑用量　設M為被測物質，R為顯色劑，MR為反應生成的有色配合物，則此顯色反應可以用下式表示：

從反應平衡角度上看，加入過量的顯色劑顯然有利于MR的生成，但過量太多也會帶來副作用，例如增加了試劑空白或改變了配合物的組成等。因此顯色劑一般應適當過量。在具體工作中顯色劑用量具體是多少需要經實驗來確定，即通過繪制吸光度（A）-顯色劑濃度（cR）曲線，來獲得顯色劑的適宜用量。

（2）溶液酸度　酸度是顯色反應的重要條件，當酸度不同時，同種金屬離子與同種顯色劑反應，可以生成不同配位數的不同顏色的配合物，要想獲得組成恒定的有色配合物，必須根據實際需要控制pH在一定范圍內。溶液酸度過高會降低配合物的穩定性，特別是對弱酸型有機顯色劑和金屬離子形成的配合物的影響較大；溶液酸度過低可能引起被測金屬離子水解，因而破壞了有色配合物，使溶液顏色發生變化，甚至無法測定。

因此，顯色反應適宜的酸度范圍必須通過實驗來確定，即通過繪制吸光度（A）-pH關系曲線，曲線平坦部分對應的pH為應該控制的pH范圍。

（3）顯色溫度　大多數顯色反應是在室溫下進行的，但也有的反應必須在較高溫度下才能進行或進行得比較快。因此對不同的反應，應通過實驗找出各自適宜的顯色溫度范圍。由于溫度對光的吸收及顏色的深淺都有影響，因此在繪制工作曲線和進行樣品測定時應該使溶液溫度保持一致。

（4）顯色時間　各種顯色反應的反應速率各有不同，需要的反應時間也不一樣。有些顯色反應在實驗條件下可瞬間完成，顏色很快達到穩定，并在較長時間內變化不大，但也有的顯色反應需要一段時間顏色才能達到穩定，而且可能穩定時間不長。因此，顯色反應應該從兩個方面來考慮時間的影響：一是顯色反應完成所需要的時間，稱為“顯色（或發色）時間”；二是顯色后有色物質色澤保持穩定的時間，稱為“穩定時間”。在實際工作中通過實驗來確定適宜的反應時間：配制一份顯色溶液，從加入顯色劑開始，每隔一定時間測吸光度一次，繪制吸光度隨時間變化的曲線。曲線平坦部分對應的時間就是測定吸光度的最適宜時間。

2.1.3.3　參比溶液的選擇

在分光光度分析中測定吸光度時，由于入射光的反射，以及溶劑、試劑等對光的吸收會造成透射光通量的減弱。為了使光通量的減弱僅與溶液中待測物質的濃度有關，需要選擇合適的參比溶液（有時稱為空白）來調節透射比100%（A=0），以消除顯色溶液中其他成分以及吸收池和試劑對入射光的反射和吸收所帶來的誤差。參比溶液的組成視試樣溶液的性質而定，合理選擇參比溶液很重要。

（1）溶劑參比　當試樣溶液的組成比較簡單，共存的其他組分很少且對測定波長的光幾乎沒有吸收，僅有待測物質與顯色劑的反應產物有吸收時，可采用溶劑作參比溶液，它可以消除溶劑、吸收池等因素的影響。

（2）試劑參比　如果顯色劑或其他試劑在測定波長有吸收，此時應采用試劑參比溶液。即按顯色反應相同條件，只不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。這種參比溶液可消除試劑中的組分產生的影響。

（3）試液參比　如果試樣中其他共存組分有吸收，但不與顯色劑反應，且顯色劑在測定波長無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液，即將試樣與顯色溶液作相同處理，只是不加顯色劑。這種參比溶液可以消除有色離子的影響。

（4）褪色參比　如果顯色劑及樣品基體有吸收，這時可以在顯色液中加入某種褪色劑，選擇性地與被測離子配位（或改變其價態），生成穩定無色的配合物，使已顯色的產物褪色，用此溶液作參比溶液，稱為褪色參比溶液。褪色參比是一種比較理想的參比溶液，但遺憾的是并非任何顯色溶液都能找到適當的褪色方法。

2.1.4　定性定量方法

紫外-可見分光光度法最廣泛和最重要的用途是作微量成分的定量分析，它在工業生產和科學研究中都占有十分重要的地位。根據測定波長的范圍可分為可見分光光度定量分析和紫外分光光度定量分析。前者用于有色物質的測定，后者用于有紫外吸收的物質的測定，兩者的測定原理和步驟相同。進行定量分析時，由于樣品的組成情況及分析要求的不同，因此分析方法也有所不同。

2.1.4.1　單組分定量方法

單組分是指樣品溶液中僅含有一個組分，或者是在選定測量波長下，混合物溶液中其他組分沒有吸收即對待測組分不干擾，其定量分析比較簡單，在測量波長下，選用適當的參比溶液、測量試液的吸光度，然后再用標準曲線法、標準比較法和吸光系數法求得分析結果即可。

（1）標準曲線法　標準曲線法又稱校準曲線法，它是實際工作中使用最多的一種定量方法。其方法是：配制一系列不同含量（4個以上）被測組分的標準溶液，以不含被測組分的空白溶液為參比，在相同條件下分別測定各標準溶液的吸光度，以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制曲線（見圖2-3），此曲線即為標準曲線。在相同條件下測定未知試樣的吸光度，然后在工作曲線上查出與之對應的濃度。實際工作中，為了避免使用時出差錯，在所作的工作曲線上還必須標明標準曲線的名稱、所用標準溶液（或標樣）名稱和濃度、坐標分度和單位、測量條件等信息。

此外，還可以利用計算機或計算器求出工作曲線的一元線性回歸方程表示，即：

（2-2）

式中，x為標準溶液的濃度；y為相應的吸光度。直線稱回歸直線，a為直線的截距、b為直線斜率，工作曲線線性的好壞可以用回歸直線的相關系數來表示，相關系數接近1說明標準曲線線性好，一般要求相關系數大于0.999。

為了保證測定準確度，要求標樣與試樣溶液的組成保持一致，待測試液的濃度應在工作曲線線性范圍內，最好在工作曲線中部。工作曲線應定期校準，如果實驗條件變動（如更換標準溶液、所用試劑重新配制、儀器經過修理、更換光源等情況），標準曲線應重新繪制。標準曲線法適于成批樣品的分析，它可以消除一定的隨機誤差。

（2）標準比較法　這種方法是用一個已知濃度的標準溶液（cs），在一定條件下，測得其吸光度As，然后在相同條件下測得試液cx的吸光度Ax，設試液、標準溶液完全符合朗伯-比爾定律，則：

（2-3）

使用這種方法的要求：cx與cs濃度應接近，且都符合吸收定律。標準比較法適于個別樣品的測定。

（3）吸光系數法　吸光系數法是利用標準的值進行定量測定的。可以由標準物質分別在已校準過的不同型號的分光光度計上進行測定，計算出吸光系數，也可以從手冊上查出其標準值，再與樣品的實驗值比較，計算出樣品含量（體積分數或質量分數）。我國藥典中某些藥物的測定一般采用此法。

2.1.4.2　多組分定量方法

多組分是指在被測溶液中含有兩個或兩個以上的吸光組分。進行多組分混合物定量分析的依據是吸光度的加和性。假設溶液中同時存在兩種組分x和y，它們的吸收光譜一般有下面三種情況。

（1）組分間無干擾　根據圖2-4（a），吸收光譜曲線不重疊，或至少可找到在某一波長處x有吸收而y不吸收，在另一波長處y有吸收而x不吸收，則可分別在波長λ1和λ2處測定組分x和y，而相互不產生干擾。

（2）組分間有干擾　根據圖2-4（b），表示x組分對y組分的測定有干擾，y組分對x組分的測定無干擾；根據圖2-4（c），表示x組分對y組分互有干擾。則可選定兩個波長λ1和λ2并分別在λ1和λ2處測定吸光度A1和A2，根據吸光度的加和性，列出如下方程組：

（2-4）

式中，cx、cy分別為x組分和y組分的濃度；分別為x組分在波長λ1和λ2處的摩爾吸光系數；分別為y組分在波長λ1和λ2處的摩爾吸光系數，可以用x、y的標準溶液分別在λ1和λ2處測定吸光度后計算求得。將上述摩爾吸光系數代入方程組，可得兩組分的濃度。

聯立方程組可用于兩種以上吸光組分的同時測定，但是測量組分增多，分析結果的誤差也同時增大。近年來由于電子計算機的廣泛應用，多組分同時測定從理論上和方法上得到了快速的發展。比較成熟的方法有矩陣分析法、卡爾曼濾波分析法等，這些方法利用電子計算機處理數據，提取有用的信息，在多組分同時分析中取得了令人滿意的結果。

當吸收光譜互相重疊的兩組分共存時，可以利用雙波長法消除共存組分的干擾，對單個組分或同時對兩個組分進行測定。此外還可以應用紫外-可見吸收光譜法測定配合物的組成。

紫外-可見分光光度法一般適用于含量為10-2～10-6mol/L濃度范圍的測定。過高或過低含量的組分，由于溶液偏離吸收定律或因儀器本身靈敏度的限制，會使測定產生較大誤差，此時若使用差示分光光度法就可以解決問題。

2.1.4.3　定性分析

紫外-可見分光光度法可用于有機化合物的鑒定、結構推斷和純度檢驗。但由于紫外-可見光譜較為簡單，光譜信息少，特征性不強，而且不少簡單官能團在近紫外及可見光區沒有吸收或吸收很弱，因此，這種方法的應用有較大的局限性。

（1）未知化合物的定性鑒定　紫外吸收光譜定性分析一般采用光譜比較法。所謂光譜比較法是將經提純的樣品和標準物用相同溶劑配成溶液，并在相同條件下繪制吸收光譜曲線，比較其吸收光譜是否一致。如果紫外光譜曲線完全相同（包括形狀、λmax、λmin、拐點及εmax等）。則可初步認為是同一種化合物。為了進一步確認可更換一種溶劑重新測定后再作比較。

如果沒有標準物，則可借助各種有機化合物的紫外-可見標準譜圖及有關電子光譜的文獻資料進行比較。使用與標準譜圖比較的方法時，要求儀器準確度、精密度要高，操作時測定條件要完全與文獻規定的條件相同，否則可靠性較差。

紫外吸收光譜只能表現化合物生色團、助色團和分子母核，而不能表達整個分子的特征，因此只靠紫外吸收光譜曲線來對未知物進行定性是不可靠的，還要參照一些經驗規則以及其他方法（如紅外光譜法、核磁共振波譜、質譜，以及化合物某些物理常數等）配合來確定。

（2）有機化合物的結構推斷　紫外吸收光譜在研究化合物結構中的主要作用是推測特征官能團、結構中的共軛關系和共軛體系中取代基的位置、種類和數目。例如樣品如果在200～400nm無吸收，則說明該化合物可能是直鏈烷烴、環烷烴、飽和脂肪族化合物或僅含一個雙鍵的烯烴；如果在210～250nm有強吸收帶，表明含有共軛雙鍵；如果在250～300nm有弱吸收帶，ε為10～100L/（mol·cm），且隨溶劑極性增大而發生藍移，則說明分子內含有羰基。

紫外吸收光譜除應用于推測所含官能團外，還可對某些同分異構體進行判別。例如異亞丙基丙酮有如下兩個異構體：

經紫外光譜法測定，其中的一個化合物在235nm[ε=12000L/（mol·cm）]有吸收帶，而另一個在220nm以上沒有強吸收帶，所以可以肯定，在235nm有吸收帶的應具有共軛體系的結構，如（a）所示。而另一個的結構式則如（b）所示。

（3）化合物純度的檢測　如果化合物在紫外光區沒有明顯的吸收峰，而它所含的雜質在紫外光區有較強的吸收峰，就可以檢測出該化合物所含的雜質。例如苯在256nm處產生B吸收帶，而甲醇或乙醇在該處幾乎沒有吸收帶，因此可利用這特征在256nm處通過觀察是否有吸收帶來檢定甲醇或乙醇中是否含有雜質苯。

另外還可以用吸光系數來檢查物質的純度。一般認為，當試樣測出的摩爾吸光系數比標準樣品測出的摩爾吸光系數小時，其純度不如標樣。相差越大，試樣純度越低。