1.3.1　層級化結構

合成生物學主要基于“自下而上”的正向工程學思想，通過三個基本層次進行層級化構建，即生物元件、生物裝置和生物系統（見圖1-2）。生物元件是指具有特定功能的DNA序列，是遺傳系統中最簡單、最基本的生物積塊（BioBrick）。具有不同功能的生物元件可以組合為更復雜的生物裝置，而具有不同功能的生物裝置協同運作就可以構成更復雜的生物系統。

圖1-2　層級化結構示意圖

1．生物元件

生物元件是遺傳系統中生命體發揮功能的最小單元，按照功能的不同，生物元件可以劃分為啟動子、核糖體結合位點、終止子、蛋白質編碼序列等。

（1）啟動子（promoter）。啟動子是指通過控制RNA聚合酶與DNA的結合，從而控制目的基因轉錄的元件，即通過控制啟動子的位置、操縱位點數量或者啟動子序列本身來調控轉錄起始復合物與啟動子的結合親和力，從而控制轉錄強度。啟動子可分為激活型啟動子、阻遏型啟動子和組成型啟動子。激活型啟動子會受到轉錄因子的正調控，轉錄因子水平的提升會使此類啟動子的活性增加。典型的基于化學誘導劑的激活型啟動子包括pLac啟動子和pBAD啟動子，這些啟動子在基因線路中得到了廣泛應用。除了基于化學誘導劑的誘導方式，“非接觸式”激活型啟動子可以滿足對誘導方式的特殊要求，其中包括以光源等作為誘導劑的光敏啟動子以及通過熱激或冷激等作為誘導劑的溫敏啟動子。阻遏型啟動子會受到轉錄因子的負調控，轉錄因子水平的提升會使此類啟動子的活性降低。例如，在藍光阻遏型啟動子設計中，對藍光敏感的蛋白結構域被插入大腸桿菌啟動子的?35至?10區域內，當藍光存在時，該蛋白形成二聚體并造成空間位阻，可以阻止RNA聚合酶的募集和轉錄。組成型啟動子直接受到RNA聚合酶的影響，此類啟動子的下游基因表達相對穩定，其表達強度取決于基因線路上所使用的組成型啟動子的強度。值得一提的是，Anderson啟動子庫是一種合成生物學常用庫，提供了各種強度的組成型啟動子。但需要注意的是，強度極高的組成型啟動子會消耗細胞內大部分聚合酶和核糖體資源，進而給細胞帶來一定的代謝負擔，甚至會導致宿主細胞出現明顯的生長缺陷現象。此外，可將兩種或兩種以上不同啟動子元件融合構成新的啟動子，即雜合啟動子。例如，pTac啟動子為色氨酸啟動子與乳糖啟動子融合形成，兼具強啟動能力和可調控性。

（2）核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）。RBS是指mRNA分子中位于啟動子下游、起始密碼子上游的一段短核苷酸序列，用于募集核糖體以啟動轉錄。由于核苷酸的變化可以改變mRNA 5′端的二級結構，影響核糖體與mRNA結合自由能，從而改變蛋白質的整體翻譯速率，因此RBS序列中的微小變化往往會導致表達效率上的巨大差異。Anderson RBS庫是廣泛使用的RBS庫之一，可提供各種轉錄強度的RBS序列。一些在線設計工具可以預測RBS序列的強度，可為用戶設計提供所需強度的RBS序列。此外，在5′端引入絕緣子（insulator）可提高預測效率。

（3）終止子（terminator）。終止子是指標志著轉錄結束的一段短DNA序列。原核生物的終止子在終止點之前都有回文結構，可使轉錄出來的RNA形成一個莖環式的發夾結構。一類終止子不依賴β因子，一般通過轉錄生成mRNA發夾結構，進而阻止RNA聚合酶繼續沿DNA移動，使聚合酶從DNA鏈上脫落下來終止轉錄；另一類終止子則依賴β因子，即轉錄終止需要β因子的協同。通常，為了防止轉錄終止子不能完全終止轉錄，我們可以使用雙終止子使之完全終止轉錄。既往研究已發現并鑒定了大腸桿菌幾百種不同強度的終止子，其中有39種強終止子適用于復雜的大型基因線路設計。

（4）蛋白質編碼序列（protein coding sequence，CDS）。蛋白質編碼序列位于RBS下游，是基因線路中表達的目標蛋白質。CDS以起始密碼子開始，以終止密碼子結束，并保證在CDS中間沒有提前出現終止密碼子。如果CDS來自其他物種，應根據宿主菌的密碼子使用頻率進行密碼子優化以改善蛋白質表達。

按在生物系統中的功能不同，生物元件可以分為響應元件、調控元件、報告元件和降解元件。

（1）響應元件（response element）。響應元件可以是DNA、RNA或蛋白分子，能夠在分子信號的誘導下激活或抑制基因的表達。響應元件在生物傳感器中具有廣泛的應用前景，可用其設計生物學反應系統與信號感應系統，實現對生物系統的精確調控。常見的響應元件包括感光元件、溫度元件、酸堿響應元件以及化學信號響應元件等。

● 感光元件一般為光感基因所表達的光敏受體蛋白，這些蛋白可以感受到不同波長的光信號，并轉換成細胞內的生物信號，從而調控基因表達。

● 溫度元件包括熱激反應元件和冷激反應元件，可以根據外界溫度變化調控基因表達水平。

● 酸堿響應元件通過轉錄因子或RNA穩定性等方式，根據細胞外環境的pH值來調控基因表達水平。

● 化學信號響應元件可以識別和結合特定的化學物質濃度和種類，進而通過細胞內信號轉導改變基因表達水平。例如，一些小分子化合物（如阿拉伯糖、異丙基硫代-β-半乳糖苷）可以作為外部信號調控基因表達。

此外，還有聲響應元件、電響應元件以及氧氣響應元件等，在選擇響應元件時，我們需要綜合考慮應用場景、靈敏度、特異性及環境依賴性等因素。

（2）調控元件（regulator element）。調控元件通常為蛋白質或RNA，能夠與DNA序列結合并實現對基因表達的快速響應和精確調控。常見的調控元件包括強調控元件、弱調控元件、可變調控元件和組織特異性調控元件。

● 強調控元件通常具有較高的活性，能夠快速驅動基因表達。

● 弱調控元件具有較低的活性，能夠維持基因表達的穩定。

● 可變調控元件可以根據外部信號調節基因表達水平。

● 不同種類的組織或細胞中基因調控表達存在差異。組織特異性啟動子是一種組織特異性調控元件，在該啟動子調控下，外源基因一般只在某些特定的器官或組織部位表達。例如，Bilal等人采用Cre重組酶雙熒光報告基因小鼠作為實驗動物，將在心臟具有特異活性的Nppa和Myl2啟動子插入表達Cre的腺相關病毒（AAV9）載體中，最后將AAV9基因特異性表達載體應用在心臟腔室中進行基因特異性表達研究。

（3）報告元件（reporter element）。報告元件通常可以產生明顯可觀察的蛋白質或者RNA分子作為信號，用于監測生物系統的狀態。典型的報告蛋白元件包括熒光蛋白（綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等）、生物發光系統（luxCDABE）、熒光素酶基因（Luc）和比色系統（LacZ藍白斑）。例如，β-半乳糖苷酶基因（LacZ）可以編碼一種酶，能夠將X-gal轉化為藍色產物。除了上述報告元件，還有許多其他的報告元件，例如熒光蛋白基因的突變體、熒光素酶的突變體等。在選擇報告元件時，我們需要考慮其靈敏度、特異性、穩定性、不影響目標基因表達等因素，并結合具體應用場景進行優化和設計。尤其是，在研究基因表達動力學時，我們應該考慮到不同的熒光蛋白具有不同的熒光成熟時間——這可能在建模研究動力學時帶來不必要的延遲。如果有其他蛋白質并行表達，可使用合適的熒光報告分子，例如以單體形式存在的超折疊綠色熒光蛋白（superfolder green fluorescent protein，sfGFP），可以最大程度地減少對其他蛋白質的干擾。

（4）降解元件（degradation element）。降解元件一般為能夠催化mRNA降解的RNA分子，進而控制基因的表達和生物系統的代謝過程，可用于構建RNA干擾、基因沉默或者其他基因敲除技術。例如，RNase E（ribonuclease E）是大腸桿菌及相關微生物中的核糖核酸酶，能識別并切割特定的RNA序列，在mRNA降解以及rRNA和tRNA成熟中可起到關鍵作用；RNase Ⅲ（Ribonuclease Ⅲ）是大腸桿菌中的一種特異性核酸外切酶，能識別并切割RNA的雙鏈結構；丁型肝炎病毒（hepatitis delta virus，HDV）的基因組中編碼有一種核酸酶，能識別并切割其RNA的特定序列。此外，蛋白質降解決定子（degron）通過與目的基因融合表達，可被細胞內的蛋白酶識別，以介導蛋白質的降解。

2．生物裝置

將生物元件按一定的邏輯拓撲結構加以組合，使其發揮特定的功能，即可形成生物裝置（biological device）。生物裝置通過信號傳導、代謝作用以及其他方式處理輸入信號，進而生成輸出信號。也就是說，生物裝置內可發生一系列生物化學反應，包括轉錄、翻譯、蛋白質磷酸化、變構調節、蛋白質相互作用以及酶反應等。

基礎的生物裝置包括報告裝置、信號轉導裝置以及蛋白質生成裝置。

（1）報告裝置。報告裝置是使產物可以被檢出的裝置。它將啟動子、調控元件和報告元件加以組合，實現對生物系統的狀態監控。

（2）信號轉導裝置。信號轉導裝置是環境與細胞或者細胞與細胞之間接收、傳遞信號的裝置。細胞通過感受環境信號或其他細胞分泌的信號分子等，將信號轉入細胞內部，通過信號轉導逐級傳遞至效應蛋白，最終輸出特定的信號。

（3）蛋白質生成裝置。蛋白質生成裝置是能夠產生目標蛋白質的裝置。它可以整合調控元件序列與蛋白質編碼序列，按需求實現目標蛋白質的表達。

構建生物裝置的基礎是設計與合成基因線路，這也是合成生物學學科形成的標志性工作。所謂基因線路的合成，是指利用電氣工程框架和數字電路的邏輯運算思想，按照電子工程學原理和方式設計、模擬，運用不同功能的基因和由生物分子組成的基本功能元件構建動態調控系統，通過特定的控制邏輯在活細胞內感知和處理信號分子。研究人員可以用相應的數學模型對這些簡單的基因線路進行描述并利用外界信號對其加以調控，以及對設計方式進行評估并可重設計、重合成。2000年，波士頓大學的James Collins課題組采用反饋調節設計出了雙穩態開關（toggle switch），這是第一個真正具有合成生物學意義的基因線路功能模塊，是構建具備設計功能的工程基因線路的開創性工作。同年，普林斯頓大學的Elowitz和Leibler設計并構建了基因表達振蕩器，利用3個轉錄抑制模塊實現輸出信號的規律性振蕩。隨后，各種控制模塊陸續得以設計、構建，包括基因開關、振蕩器、放大器、邏輯門、計數器以及復雜組合基因線路。2008年，研究人員在大腸桿菌中開發了快速、可持續并具有魯棒性的遺傳振蕩器，使之通過負反饋線路實現時間延遲，產生功能性轉錄因子的細胞級聯過程，并通過正反饋線路提升振蕩器的魯棒性和可調性，實現了振蕩線路設計和理論研究方面的重大突破。2009年，研究人員首次在哺乳動物細胞中實現了對基因表達的周期性調控，該振蕩器基于正反饋與負反饋基因回路，可自主、自我維持，以及可調控完成基因的振蕩表達。這項工作有助于理解哺乳動物晝夜節律鐘的精準分子機制和表達動態。2010年，研究人員通過合并群體感應制成了同步基因振蕩器，該振蕩器由正、負反饋線路組成，其工作原理是：單一細菌產生的信號分子可向外擴散并激活周邊細菌的基因線路，通過在線路中表達可分解該信號分子的蛋白，為循環提供延時制動，單一細菌和相鄰細菌中的不同基因線路發生動態相互作用，可用于建立信號分子和熒光蛋白的定期脈沖。這項工作為環境傳感器以及藥物輸送系統奠定了強大的基礎。

目前，基因線路的研究范疇已經從轉錄調控擴展至轉錄后和翻譯調控，基因線路由此成為構建人工生命系統以及探索生命運行規律的強大工具。

3．生物系統

通過串聯、反饋或者前饋等形式，我們將生物裝置組合成更復雜的級聯線路或者調控網絡，即生物系統（biological system）。自然生物系統中的調控網絡有轉錄調控網絡、蛋白質信號通路和代謝網絡。這里我們將以工程信號轉導系統、人工細胞-細胞通信系統、代謝工程、生物傳感器、最小基因組等為例，介紹生物系統的構建策略以及研究進展。

（1）工程信號轉導（engineering signal transduction）系統。細胞與環境間的相互作用，以及許多細胞功能是由多個相互聯系的工程信號轉導級聯系統介導的，這些工程信號轉導級聯系統由復雜的蛋白質線路組成，蛋白質線路則由許多不同的模塊域組成，從而賦予了信號轉導級聯系統特定的功能和路徑連接，并決定了信號網絡的輸入和輸出。這些蛋白質可以通過直接修飾（如磷酸化）或者與特定配體結合來轉導信號。蛋白質調控的級聯線路對輸入具有超敏感性響應，輸入信號中的微弱變化就可能促使輸出發生由低到高或由高到低的轉換。了解和操縱信號轉導機制可增加合成網絡設計的復雜性和靈活性。Dueber 等人對酵母中變構蛋白信號開關進行了模塊化的重編程，與誘導肌動蛋白N-WASP輸出結構域變構激活的正常輸入不同，該蛋白被設計成具有不同的自抑制輸入結構域，可以響應不同的誘導劑。通過這種方式，肌動蛋白N-WASP 輸出與異源輸入耦合，進而創建了全新的信號通路，使設計人員能夠觀察和理解某些參數如何影響開關的行為。酵母支架蛋白Ste5和Pbs2通常分別介導的是α-factor因子響應和滲透反應，但經過融合和改造，將α-factor因子輸入引導至滲透反應輸出；Howard等人將磷酸酪氨酸識別結構域 Grb2 和 ShcA 融合到Fadd蛋白的死亡效應結構域，構建的新型嵌合蛋白可有效地引導有絲分裂或轉化受體酪氨酸激酶信號以觸發細胞死亡。

（2）人工細胞-細胞通信系統（artificial cell-cell communication system）。利用合成基因線路可構建人工細胞-細胞通信系統。Basu等人利用由細菌種群中兩種不同細胞類型組成的特性良好的自然模塊設計了人工細胞-細胞通信系統。在該系統中，一種細胞負責發送信號，另一種細胞則用作信號接收器，可對發送細胞誘導劑信號的行為作出反應。該系統被設計為響應誘導信號時空特征的脈沖發生器，為了響應由發送細胞產生誘導劑增加的持久性，接收細胞以GFP的脈沖來響應。在接收信號細胞的基因線路中，GFP和lambda抑制器都通過信號分子激活的LuxR轉錄因子響應N-酰基高絲氨酸內酯（N-acyl homoserine lactones AHL）濃度而表達，同時GFP的轉錄也可被lambda抑制元件所抑制。隨著AHL濃度的上升，GFP表達先上升，隨后被同時表達上升的lambda抑制器抑制。結果表明，根據誘導劑濃度和兩種細胞距離的變化，可通過數學模型定量描繪出對信號分子的動力學響應曲線，實現了脈沖發生器的構建。2015年，研究人員利用細胞信號傳導機制來調節多種細胞類型的基因表達，構建了由兩種不同的細胞類型組成的合成微生物群落，即“激活劑”菌株和“阻遏劑”菌株，這些菌株產生了兩個正交的細胞信號分子，在橫跨兩個菌株的合成線路中調節基因表達，形成種群水平振蕩，這項工作通過研究種群水平動態進行編程的能力為具有多種細胞類型的復雜組織和器官的人工合成指明了方向。

（3）代謝工程（metabolic pathway engineering）。在大腸桿菌和釀酒酵母菌等模式生物中使用工程途徑和模塊化的生物合成級聯，可以改變細胞原有的代謝途徑，進而產生非天然的代謝物或提高目標代謝物的產量。代謝工程的一個重要特點是將新的途徑整合到細胞中，并考慮到維持細胞基本功能所需的本地代謝物和操作手段。例如，青蒿素是治療瘧疾耐藥性效果最好的藥物，以青蒿素類藥物為主的聯合療法也是當下治療瘧疾最有效、最重要的手段。青蒿素是由青蒿天然產生的，獲取難度大、制備時間長且價格昂貴。為了降低青蒿素的成本，Ro等人開發了酵母生產青蒿酸（青蒿素前體）的系統，使用一種改進的甲羥戊酸途徑，通過使酵母細胞工程化來表達amorphadiene合成酶和細胞色素P450氧化酶（這兩種酶都源自工程菌大腸桿菌），其中P450氧化酶通過三步氧化法可將amorphadiene 氧化成青蒿酸。隨著后續研究中產量優化和規模化采收，基于青蒿素相關治療藥物的生產時間將顯著縮短，其成本也會降低。

（4）生物傳感器（biosensor）。合成生物學的發展大大促進了生物傳感器的發展。生物傳感器利用待檢測物質作為輸入信號，通過構建的基因線路將輸入信號轉為細胞內的生化信號，并實現下游特定基因的表達。全細胞生物傳感器的制造通常包含三個階段：對輸入的單一信號或多重信號感知、信號處理和產生可觀測的輸出反應。目標物理量的檢測通常是通過轉錄因子發生別構效應（通過影響啟動子區域來激活或抑制基因轉錄的啟動）從而轉換為內部生化信號，并觸發隨后的一系列細胞信號轉導事件，從而將細胞內部的生化信號轉化為外部可定量或定性檢測的報告信號。合成生物學技術大幅提升了可用于生物傳感器的元件數量和質量。例如，計算機驅動的蛋白質工程技術可設計具有全新結構的蛋白質結構域、蛋白質相互作用表面以及具有功能活性的酶，促進了生物傳感器特定功能的實現。此外，基于細菌分裂與繁殖的全細胞生物傳感器大幅度降低了制造成本，具有重要的經濟意義，減少了將生物傳感平臺擴展到工業應用水平的障礙。

（5）最小基因組（minimal genome）。合成生物學的目標之一是更好地理解生命，以及在功能上整合組成細胞的系統。解決這個問題的主要策略之一是定義基因組中足以維持生命的最小組成部分。隨著高通量DNA測序和合成技術的發展，研究人員構建了多種縮減基因組的底盤菌株。目前有兩種互補的策略來研究最小基因組：一種是“自上而下”的策略，即去除非必需的遺傳基因，進一步簡化生物體基因組——隨著大規模基因組測序與分析技術的發展，研究人員通過對來自不同生物體的基因組加以比較分析，揭示對于細胞生命和代謝途徑等必不可少的基因；另一種是“自下而上”的策略，即合成基因組的每個組件，并通過組裝實現基因組的人工合成。高速發展的生物技術使基因調控網絡的設計、生物合成途徑的開拓乃至整個基因組的構建成為可能，目前已成功合成的有病毒、細菌和真菌基因組。例如，研究發現，模式生物大腸桿菌的基因組大于5 Mb，包含4000多個基因，其中1000多個為未知功能的基因。大腸桿菌可在多種環境（如好氧和厭氧，以及不同營養物質、pH值和溫度等）下繁殖，然而其基因組編碼了許多實驗室培養和工業發酵不需要的基因，這些基因會導致能量和原料的浪費（如非必需基因組片段復制，以及功能冗余的轉錄物、蛋白質和代謝物的合成），若刪除這些不必要序列，則有可能使其成為生物制造產業中的優良細胞底盤。