第一章 機械灌注的歷史及現狀

第一節 機械灌注歷史

自從1954年美國醫生Murray成功施行孿生子間腎移植并獲得長期存活以來，腎移植已逐漸發展成一門定型的外科手術并用于臨床慢性腎衰竭。這不但掀開了現代器官移植的篇章，且推動了其他臟器如肝臟、肺、心臟等的移植的探索研究及成功在臨床中的應用。目前，器官移植技術漸趨成熟和完善，已逐漸成為治療終末期器官衰竭唯一有效的手段。然而，器官供體短缺成為目前阻礙器官移植發展的重大障礙。為解決這一問題，一方面要擴大器官的來源，另一方面則是要找到保存供體的最有效方法。器官保存是器官移植的三大支柱之一。機械灌注（machine perfusion，MP）是器官獲取后將其血管連接至機械灌注系統，系統在器官保存、轉運階段將灌注液在一定溫度、壓力條件下持續至灌注離體器官，同時供給離體器官氧氣、營養物質等。與傳統靜態冷保存（static cold storage，SCS）相比，其能夠更好地保存離體器官、甚至挽救標準外器官。根據維持溫度不同，可以分為低溫型（hypothermic machine perfusion，HMP，4~6℃）、亞低溫型（subnormothermic machine perfusion，SMP，20~25℃）及常溫型（normothermic machine perfusion，NMP，32~37℃）。根據氧合可分攜氧MP與非攜氧MP。

在這一領域的最初應用是腎臟活體體外灌注法，人工心室輔助機作灌注和原位灌注等。但這些方法不能延長離體腎保存時間，因此未引起人們的重視。1964年，Humphries團隊為推動HMP的研究和應用做出了開拓性的貢獻。Humphries等使用經稀釋的自體血作為灌注液，選用40mmHg灌注壓，灌注犬的離體腎臟，連續灌注24小時后，移植腎功能良好。Belzer等于1967年在Humphries方法的基礎上進行了改良，設計了第一臺機械灌注的裝置，由1L犬自體血漿加上2mmol硫酸鎂、250ml右旋糖酐、80U胰島素、200 000U青霉素以及100mg的氫化可的松配制成灌注液（pH在7.4~7.5），灌注壓設定在50~80mmHg之間，氧分壓在150~190mmHg之間，在8~12℃條件下連續脈沖式灌注犬離體腎臟，72小時后腎臟移植回體內，同時切除對側腎臟，犬存活良好，他同時將該灌注設備應用于臨床腎移植手術中，成功地將腎臟保存時間延長至50小時，只有8%的患者術后需要進行血液透析。Starzl等在1968年首次將低溫含血機械灌注應用于11例臨床肝臟移植。該項模式逐漸引起了人們極大的興趣，從而奠定了近代機械灌注法在器官保存中的地位，并得到了廣泛的應用和研究。同時，另外一些學者進行著常溫機械灌注的研究。HMP操作較簡單，但不可避免地會引起冷保存損傷進而導致內皮細胞水腫甚至酸中毒。NMP營造了一個十分接近機體內環境的灌注條件，為確保器官功能，人們開始嘗試器官常溫灌注的方法。Starzl等在1967年首次使用常溫灌注的肝臟進行肝移植手術并取得成功。同年，Neely首次提出了供心的不停跳保存模型：通過左心房插管泵入灌注液，經左心室從主動脈引出。由于主動脈遠心端的順應器可模擬類似于人體主動脈擴張的生理現象從而形成主動脈根部的壓力，最終使灌注液進入冠狀動脈營養心肌。

然而，1969年之后，由于冷保存液的改進大大改善了移植效果，加上操作簡單易行，SCS一躍成為臨床上器官保存的金標準。同時由于MP機器的龐大，操作的繁復和成本因素，很快淡出了視野。SCS具有簡便安全、價格低廉及保存效果較好等優點，目前仍然是供器官保存的主要方法。這種方法基于低溫條件下降低細胞代謝的原理將供器官保存在特殊的器官保存液中，然而低溫時細胞的代謝活動并未完全停止。在低溫保存期間，氧氣和營養因子的來源終止，細胞內高能磷酸化合物三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的合成持續減少，而ATP持續降解并到最終耗竭，引起細胞內代謝產物的異常堆積。Na+-K+-ATP酶（Na+泵）和Ca2+-Mg2+-ATP酶（Ca2+泵）進一步失活，導致細胞膜完整性破壞、細胞內外電解質濃度梯度失衡以及線粒體內鈣超載等，鈣離子進一步激活磷脂酶、蛋白酶及核酸酶等，進而導致供器官細胞凋亡和壞死。缺血過程中，由于鈣依賴性蛋白酶的激活導致黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌呤氧化酶，再灌注后大量次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下形成尿酸，期間釋放大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS）導致脂質過氧化反應，成為引起移植物功能障礙的原因之一。另外，再灌注后微循環障礙、Kupffer細胞的激活、白細胞黏附聚集及炎性細胞因子的釋放等進一步導致移植物功能受損。因此，SCS具有保存時間有限，供體器官切取之前熱缺血損傷不可逆，保存過程中產生時間依賴性損傷等局限。20世紀90年代，由于器官的短缺、心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）供器官質量下降、遠距離長時間的器官轉運需求以及便攜式機械灌注裝置的研發成功，機械灌注在器官移植中應用再次獲得關注。

大量文獻表明，相比于SCS，MP具有突出的優勢：

1.維持血管床通暢，通過持續動態灌注模擬機體內環境維持血管張力。

2.持續的營養及氧氣供應，去除代謝廢物及毒素，并向移植物提供ATP　在SCS低溫保存期間，氧氣和營養因子的來源終止，細胞內ATP的合成持續減少，而ATP持續降解并到最終耗竭，引起細胞內代謝產物的異常堆積，最終導致細胞凋亡和壞死。研究發現應用MP保存的供體移植后，細胞內ATP水平恢復更快，介導細胞凋亡的穿孔素蛋白表達比SCS組少。

3.減輕移植物血管內皮細胞的損傷　研究表明，SCS因缺乏流體作用而導致轉錄因子2及內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitricoxide synthetase，eNOS）表達減少，一氧化氮生物利用度的降低，NO是公認的血管舒張因子，因此加劇了血管活性物質內皮素以及血栓素A2的生成，從而導致血管內皮細胞功能紊亂。MP提供的流體剪切力通過增加磷酸化eNOS來保護NO信號通路，從而改善移植物微循環和血管阻力。

4.減輕移植過程中的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）　線粒體是IRI的前沿誘導物，冷保存導致線粒體含氧量降低，極大增加了再灌注的前10分鐘內的氧耗，同時，電子傳送鏈的電子泄漏導致ROS的釋放，進而引起并加重IRI。低溫氧化機器灌注依靠氧化代謝的可逆性抑制改變了線粒體氧化狀態，并且在隨后常溫再灌注中減少了初始ROS釋放。

5.實時動態監測移植物功能　通過實時收集膽汁分泌量及灌注液中肝酶水平可以動態反映肝臟活力及功能，利于供肝質量評估。

1993年，Beyersdorf等首次提出控制性下肢灌注（controlled limb reperfusion，CLR）的概念，將灌注應用于急性下肢缺血再灌注損傷治療。Schon等于2001年首次對缺血60分鐘的豬DCD供肝進行4小時常溫機械灌注，術后移植物存活率明顯提高。Vairetti等于2007年使用20℃攜氧的Krebs-Henseleit（KH）液離體灌注大鼠肝臟6小時，首次驗證了SMP相較于SCS的對肝臟的保護作用。SMP的提出主要是為了避免使用攜氧載體和溫度控制，讓肝臟在室溫保存，旨在綜合HMP和NMP的優勢、避免兩者的不足。SMP的研究大多還停留在動物實驗水平，有文獻比較了不同灌注溫度（10℃、20℃、30℃、37℃）對大鼠肝移植后代謝改變的影響，證實10℃或者20℃對肝臟損傷較少尤其是缺氧損傷。總的來說SMP避免了冷保存損傷而且不需要額外的溫度控制，但是這項技術尚未開展臨床試驗，安全性和有效性有待評估。2009年Guarrera等首次完成了HMP保存供肝的臨床試驗。該研究對20例接受HMP（Vasosol液，4~6℃，灌注3~7小時）保存肝臟的受者與20例采用SCS保存肝臟的受者進行對比，結果顯示：HMP組膽道并發癥發生率較低，早期移植物功能喪失發生率更低，血清損傷標志物水平也更低，住院時間更短，提示HMP與SCS相比，是一種更加安全、可靠的保存供肝方式。隨后的一些實驗也證實了上述結果。同年，Moers等認為，腦死亡供體（donation after brain death，DBD）供腎HMP相比于SCS能夠顯著減少腎移植術后受者移植腎功能延遲恢復（delayed graft function，DGF）的發生，同時較少的DGF發生使腎臟原發性無功能發生率（primary non-function，PNF）和急性排斥反應的發生率降低，并提高移植腎和移植患者的存活率。Op Den Driesa等于2013年首次對臨床棄用的DCD肝臟進行常溫灌注，證實常溫機械灌注對DCD供肝的修復作用及其臨床可行性。牛津大學研究小組于2013年首次對常溫灌注24小時的肝臟進行臨床移植，患者術后恢復較好，且2018年nature medicine雜志報道了常溫灌注設備的臨床試驗結果，共納入220例移植患者，結果顯示常溫機械灌注顯著改善移植術后肝功能且有效減少肝臟棄用率，表明NMP實驗成功延長了肝臟保存時限，有利于提高肝臟利用率。

Michel等于2014年比較了HMP和SCS在豬心臟保存中的差異，結果顯示兩組在心臟收縮功能方面沒有差異，HMP組預示著較好的移植物存活率和患者生存率，但需要更多的動物及臨床試驗來證實。2015年，Abbas Ardehali將一項關于器官呵護系統保存供心的多中心隨機對照臨床研究結果發表于國際頂尖醫學雜志柳葉刀，該研究共納入2010年6月—2013年9月的130例心臟移植患者，結果發現接受多器官呵護系統保存的供心在延長近2小時的離體時間的前提下，與接受冷保存的供心相比，短期各項臨床結果均無顯著性差異。由此看來，常溫不停跳灌注的供心保存技術的遠期效果還需進一步觀察和研究。同時，考慮實施心臟NMP，需要解決在心肌無收縮的情況下，增加心臟保存時間，并在移植前評估心臟功能狀態，是擺在學者面前的難題。NMP在肺移植中應用前景樂觀，供肺在再灌注過程中通過氣管插管可得到氧氣，并在移植前通過檢測灌注液中的氧合水平來評估移植物狀態。而對于胰腺，由于其血流量較低，易于受到灌注液的壓力傷害，既往一些關于胰腺機械灌注的研究由于未控制好灌注的壓力與流量，常不能取得令人滿意的效果，故其研究進展要遠遠落后于腎臟與肝臟，依然需要大量研究探索（圖1-1）。