第二節(jié)　納他霉素的生物合成和代謝調(diào)控

一、納他霉素的產(chǎn)生菌株

納他霉素產(chǎn)生菌屬于鏈霉菌屬，目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的納他霉素產(chǎn)生菌有三種。

（1）納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis，ISP 5357）　孢子絲呈2～5圈的松散螺旋形；孢子呈卵圓形或球形。在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，氣生菌絲呈白色，其基內(nèi)菌絲反面無鑒別色素。

（2）恰塔努加鏈霉菌（Streptomyces chattanoogensis，ATCC 13358）　孢子絲呈圓形或螺旋形；孢子為球形或橢圓形。恰塔努加鏈霉菌在大部分培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)，其基內(nèi)菌絲為橙黃色至深黃橙色。

（3）褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus，ATCC 13326）　孢子絲呈螺旋形；孢子為球形或卵圓形。褐黃孢鏈霉菌在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，氣生菌絲豐滿茂密，顏色呈微褐色，反面呈淺黃色。

二、納他霉素的生物合成途徑

納他霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生物合成中，產(chǎn)量的限制性因素往往是內(nèi)酯環(huán)的形成。內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)是通過聚酮體途徑縮合而成的，過程中需要大量的前體物質(zhì)，這些前體物質(zhì)的供應(yīng)與氨基酸代謝、脂肪酸循環(huán)和三羧酸（TCA）循環(huán)息息相關(guān)，在物質(zhì)的合成和代謝調(diào)控中，這些途徑是聯(lián)系初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的樞紐。

納他霉素是多種鏈霉菌產(chǎn)生的一種抗真菌藥物。Aparicio等首先發(fā)表了關(guān)于納塔爾鏈霉菌的生物合成基因的報(bào)道，之后，他的團(tuán)隊(duì)又深入研究了納他霉素生物合成的基因簇pim（圖1-2），且已基本完成基因測(cè)序。2011年，研究發(fā)現(xiàn)另外一株納他霉素產(chǎn)生菌恰塔努加鏈霉菌的納他霉素合成基因簇，被命名為scn。

納塔爾鏈霉菌的骨架結(jié)構(gòu)主要由PKSⅠ類聚酮合酶（polyketide synthase）催化完成，PKS包含13個(gè)同源性模塊和60個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，這些模塊分布在由pimS0～pimS4編碼的五個(gè)多功能酶。骨架環(huán)再由pimC、pimD、pimF、pim G、pimJ和pimK 編碼的蛋白進(jìn)行后修飾，pimA、pimB 和 pimH編碼的蛋白負(fù)責(zé)納他霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)，pimT、pimE、pimM 和 pimR編碼的蛋白負(fù)責(zé)調(diào)控納他霉素合成基因的表達(dá)。在納他霉素的生物合成的過程中，PKS和后修飾酶具有較高一致性。與scn基因簇相比，pim基因簇僅包含兩個(gè)主要差異，分別是編碼外排泵的基因pimH和編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因pimT。pimH通過編碼一種外排泵參與納他霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)，pimT通過分泌納他霉素合成的誘導(dǎo)劑2，3-二氨基-2，3-雙（羥甲基）-1，4-丁二醇（PI因子）參與調(diào)節(jié)納他霉素的產(chǎn)生，兩個(gè)基因都位于PKS基因簇的兩端；與pim基因簇相比，scn基因簇包含一個(gè)假定轉(zhuǎn)座酶基因scnL（編碼酪氨酸磷酸酯酶），位于scnS1的下游。盡管兩個(gè)基因簇的編碼區(qū)域都是高度保守的，但不同菌種基因間的結(jié)構(gòu)域的差別，也造成了它們不同的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。S.natalensis與S.chattanoogensis合成基因簇中各個(gè)基因和其相應(yīng)的蛋白見表1-1。

納他霉素骨架的合成從PimS0開始，由CoA 連接酶-ACP-KS-AT-ACP催化乙酸形成酰基腺苷酸，為PimS1模塊1的KS結(jié)構(gòu)域提供乙酰單元，但是模塊0中的KS結(jié)構(gòu)域是失活的；PimS1的4個(gè)模塊分別完成骨架鏈延長(zhǎng)的前4個(gè)循環(huán)，并構(gòu)成大部分的多烯發(fā)色團(tuán)；然后，PimS2、PimS3、PimS4上的8個(gè)模塊催化8個(gè)羧酸模塊單元的縮合，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾從而形成納他霉素的骨架。在PimS2中，模塊5負(fù)責(zé)形成發(fā)色團(tuán)的最后一個(gè)雙鍵，模塊6～10中缺失DH結(jié)構(gòu)域，模塊7中的AT結(jié)構(gòu)域選擇的延伸單元為丙酸；PimS2 的模塊9中的KR是非活性的，β-酮基不能被還原，因此，在模塊7中KR結(jié)構(gòu)域的作用下C9羰基和C13羥基形成了納他霉素結(jié)構(gòu)中的半縮酮環(huán)；PimS3負(fù)責(zé)合成C3和C4， 并引入一個(gè)雙鍵，之后會(huì)形成一個(gè)環(huán)氧結(jié)構(gòu)；在PimS4的C末端硫酯酶結(jié)構(gòu)域（TE）催化下釋放碳鏈，并形成二十六元內(nèi)酯環(huán)。骨架形成的準(zhǔn)確性依賴于基因pimⅠ編碼的硫酯酶，該酶能有效篩選酰基起始單元以及去除錯(cuò)誤的延伸單位，它可以被其他的硫酯酶補(bǔ)充，而且與PimS4末端的TE具有互補(bǔ)作用。酰基載體蛋白（ACP）是PKS 中關(guān)鍵功能域，磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（PPTase）催化磷酸泛酰巰基乙胺基從CoA轉(zhuǎn)移到ACP的活性絲氨酸的殘基上，將ACP從無活性的脫輔基形態(tài)轉(zhuǎn)化為有活性的全輔基形態(tài)，PPTase作為PKS的活性開關(guān)，對(duì) PKS 產(chǎn)物的生物合成起著不可或缺的作用。研究證實(shí)在S.chattanoogensis中含有1個(gè)Ⅰ型 PPTase基因（schACPS）和Ⅱ型PPTase基因（schPPT），SchPPT傾向于催化次級(jí)代謝中ACP的輔基化，而SchACPS傾向于催化獨(dú)立ACP的輔基化。

合成糖苷配基后，細(xì)胞色素P450酶和PimG催化環(huán)外甲基在C12氧化形成環(huán)外羧基，產(chǎn)生12-羧基嘧啶酮。Liu等通過使恰塔努加鏈霉菌 L10中pimG的同源基因scnG失活證明了這一假說。隨后，而 GDP-甘露糖被 PimJ、PimC催化構(gòu)成GDP-3-酮-6-脫氧甘露糖（GDP 放線菌糖胺）。

在納塔爾鏈霉菌中，PimJ催化GDP-甘露糖合成海藻糖胺，GDP-甘露糖衍生于果糖-6-磷酸。在兩性霉素產(chǎn)生菌節(jié)狀鏈霉菌（S.nodosus）中，pimJ的同源基因的amphDⅢ失活導(dǎo)致兩性霉素內(nèi)酯的積累，表明海藻糖胺的合成來源于GDP-甘露糖。同時(shí)，來自制霉菌素的合成基因nysDⅢ的異源表達(dá)證明了海藻糖胺特異性途徑的首先由GDP-甘露糖4，6-脫水酶催化。因此，推測(cè)pimJ催化GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖，并通過自發(fā)的異構(gòu)反應(yīng)生成GDP-3-酮-6-脫氧甘露糖。隨后，pimC編碼的轉(zhuǎn)氨酶經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成GDP-海藻糖胺，通過pimK編碼糖基轉(zhuǎn)移酶催化海藻糖胺與大環(huán)內(nèi)酯的連接。最后，pimD編碼的P450單加氧酶催化最后一個(gè)氧化反應(yīng)，將C4和C5雙鍵形成環(huán)氧基團(tuán)，轉(zhuǎn)化為納他霉素（圖1-3）。

納他霉素是通過醋酸-丙二酸途徑（AA-MA途徑）生物合成的，其合成途徑可以分解為活化前體（乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A）的生成、大環(huán)內(nèi)酯的生物合成和氨基糖的形成。納他霉素的生物合成涉及很多途徑，主要有糖酵解、三羧酸循環(huán)、二氧化碳固定和脂肪酸降解途徑（見圖1-4）。其中，草酰乙酸是納他霉素生物合成的限制性中間產(chǎn)物，菌株高產(chǎn)的前提是菌株中草酰乙酸含量和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性都很高，因此，三羧酸循環(huán)改變碳的流通量調(diào)節(jié)著納他霉素的生物合成。Borodina等研究發(fā)現(xiàn)，磷酸果糖激酶基因在調(diào)控天藍(lán)色鏈霉菌的次級(jí)代謝中發(fā)揮重要作用，而這個(gè)酶也是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶。

雖然納他霉素對(duì)產(chǎn)生菌沒有抗性，但在細(xì)胞內(nèi)大量積累對(duì)產(chǎn)生菌是有害的，因此，產(chǎn)生菌體內(nèi)存在轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將納他霉素排出胞外。在S.natalensis中，pimA、pimB和pimH三個(gè)基因參與了納他霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)，pimA和pimB編碼Ⅲ型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能結(jié)合ATP酶和跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)相同的多肽從而發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)作用，它們可能會(huì)結(jié)合形成一個(gè)異二聚體。研究發(fā)現(xiàn)基因nysH、nysG（pimA、pimB的同源基因）失活的Streptomyces noursei突變株也可將制霉菌素運(yùn)出胞外，說明鏈霉菌中存在除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子外的還會(huì)有其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。因此，推測(cè)pimH編碼的外排泵也會(huì)參與納他霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)。在S. chattanoogensis基因簇中的編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因scnA和scnB， 與pimA和pimB的相似度在95%以上，雖然沒有發(fā)現(xiàn)pimH的相似基因，但發(fā)現(xiàn)了可起補(bǔ)充作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NepⅠ/NepⅡ和Mfs1，以上四個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成了一個(gè)新的納他霉素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

三、納他霉素的代謝工程和半合成衍生物

納他霉素等多烯類抗生素具有良好的抗真菌活性，但其在臨床應(yīng)用中，相伴產(chǎn)生的溶血毒性及相對(duì)偏低的抗真菌活性極大地限制了其使用的范圍。近年來，研究報(bào)道出許多相關(guān)的半合成衍生物，例如酯、N，N-二烷基、N-烷基、N-酰基、N-糖基、N-芳基、氫磷酰基衍生品以及脂質(zhì)體制劑。此外，基于納他霉素生物合成途徑和效共軛體系，可以通過代謝工程得到一些高效低毒的納他霉素衍生物（圖1-5）。

第一種納他霉素衍生物是其前體——4，5-去環(huán)氧匹馬菌素（DEP）是通過基因工程敲除納他霉素生物合成的最后一步反應(yīng)的基因pimD獲得的，它編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶催化C4-C5的環(huán)氧反應(yīng)。該化合物顯示的抗真菌活性較納他霉素明顯降低，表明環(huán)氧基在納他霉素在與真菌膜相互作用時(shí)的重要性。

最近，有研究表明，在制霉菌素的生物合成中，DEP可以被pimD同系基因nysL作為底物引入其最后的羥基化，產(chǎn)生6-羥基-DEP（圖1-5）。與DEP相比，它的抗真菌活性并未得到提高。此外，酰胺轉(zhuǎn)移酶PscA可以催化DEP和6-OH-DEP的羧酰胺化反應(yīng)，得到兩種羧酰胺化的衍生物，4，5-去環(huán)氧基-AB-400和6-羥基-4，5-去環(huán)氧基-AB-400，羧化后的衍生物抗真菌活性得到明顯改善。PscA及其同源蛋白PscB控制四烯甲酰胺化合物的自發(fā)反應(yīng)，生產(chǎn)一種納他霉素的甲酰胺衍生物AB-400。相比于PscB，PscA有更廣泛的底物范圍，這也使它成為未來多烯衍生物開發(fā)的首要研究對(duì)象。

在研究恰塔努加鏈霉菌中納他霉素生物合成的途徑時(shí)，通過基因敲除pimG的同源基因scnG得到一種新的納他霉素衍生物，4，5-去環(huán)氧基-12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素（圖1-5），其中scnG編碼P450單加氧酶控制環(huán)外羧基的形成。scnG基因的敲除導(dǎo)致4，5-去環(huán)氧基-12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素的積累，表明糖基轉(zhuǎn)移酶ScnK能夠?qū)⒑Ｔ逄前愤B接到脫羧糖苷配基上，而ScnD不能引入環(huán)氧基團(tuán)。隨后，Qi等通過使scnG的同源基因失活不僅導(dǎo)致4，5-去環(huán)氧基-12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素的積累，同時(shí)還使12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素積累，這表明在一定條件下，ScnD也可能引入環(huán)氧基團(tuán)。

12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素表現(xiàn)出高于納他霉素兩倍的抗真菌活性，其溶血毒性較納他霉素降低了77.8%，是一種具有良好應(yīng)用前景的納他霉素衍生物。Qi等也探究了4，5-去環(huán)氧基-12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素的生物活性，表明雖然其提高了納他霉素的抗真菌活性，但同時(shí)也降低了溶血作用。在隨后的研究中又獲得了一株突變株，它積累了一種新的衍生物，3-羥基-4，5-去環(huán)氧基-12-脫羧基-12-甲基匹馬菌素，但它卻沒有表現(xiàn)出明顯的抗真菌活性和溶血活性，這表明scnG催化的羧化作用是在聚酮化合物合成期間而不是發(fā)生在此之后。

scnK催化納他霉素內(nèi)酯與糖基部分的連接，恰塔努加鏈霉菌中scnK基因的敲除導(dǎo)致4，5-去環(huán)氧匹馬菌素內(nèi)酯的積累，其本身不具有抗真菌活性，但通過半合成，多合成或蛋白質(zhì)工程等方法可間接替代糖基部分（GDP-3-酮-6-脫氧甘露糖）。4，5-去環(huán)氧匹馬菌素內(nèi)酯的積累也確定了基因scnG（pimG）在納他霉素生物合成途徑中的糖基化反應(yīng)之前的作用。

四、代謝調(diào)控機(jī)制

在鏈霉菌合成的次生代謝產(chǎn)物中，納他霉素受復(fù)雜調(diào)節(jié)影響，如群體密度、環(huán)境因子和生理信號(hào)等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是代謝網(wǎng)絡(luò)的一種重要的調(diào)節(jié)方式，納他霉素合成的調(diào)控機(jī)制則主要包括途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控和全局多效調(diào)控。

1.途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多個(gè)信號(hào)和復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子相互調(diào)節(jié)。通常，鏈霉菌的次級(jí)代謝相應(yīng)的合成基因簇內(nèi)常編碼一個(gè)或多個(gè)只調(diào)控所在基因簇內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控因子，從而調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，這樣的調(diào)控基因稱為途徑特異性調(diào)控基因。納他霉素合成基因簇含PimR和PimM兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。

PimR是納他霉素生物合成中第一個(gè)途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也是一個(gè)具有特殊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄激活子，敲除pimR后的突變體不能產(chǎn)生納他霉素，負(fù)責(zé)納他霉素內(nèi)酯環(huán)形成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量降低明顯，且完全中斷了膽固醇氧化酶基因pimE的轉(zhuǎn)錄，這說明PimR在納他霉素的生物合成中是一個(gè)正調(diào)控蛋白。PimR的N端末端包含鏈霉菌抗生素蛋白（SARP）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C末端包含同源的半鳥苷酸環(huán)化酶和LuxR家族ATP結(jié)合調(diào)節(jié)因子（LAL）。SARP家族蛋白的識(shí)別序列靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的六個(gè)堿基組成的重復(fù)序列，它們已經(jīng)在PKS，NRPS和undecyprodiginines等基因簇上被發(fā)現(xiàn)，LAL家族蛋白目前只在放線菌中存在。C末端含蛋白質(zhì)家族的獨(dú)特的ATP/GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但N端末端的鳥苷酸環(huán)化酶或其LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）與C末端的LAL調(diào)節(jié)因子的DNA結(jié)合缺乏特定的信號(hào)序列。研究表明，通過凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSAs）、脫氧核糖核酸酶保護(hù)研究、逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）和啟動(dòng)子替換實(shí)驗(yàn)來研究PimR的作用模式，確定其結(jié)合單一操縱子。該操縱子包含有三個(gè)七聚體，由間隔4bp的完全重復(fù)序列CGGCAAG構(gòu)成。該操縱子位于pimM的啟動(dòng)子區(qū)，在PimR結(jié)合時(shí)開始表達(dá)被激活。在恰塔努加鏈霉菌中，PimR的結(jié)合序列在scn基因簇中的scnRⅠ（pimM的同源基因）和scnRⅡ（pimR的同源基因）之間，在阿維鏈霉菌中對(duì)應(yīng)絲氨酸蛋白酶基因簇中的基因pteF和pteR之間的基因間隔區(qū)（IGR）。

在其他鏈霉菌中，與PimR相似結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)因子還有菲律賓鏈霉菌中的菲律賓菌素生物合成的同源基因FilR；在核苷肽類抗生素中，尼可霉素生物合成中的同源基因sanG和多氧霉素生物合成中的同源基因polR。不同的是，菲律賓菌素是戊烯大環(huán)內(nèi)酯，而尼古菌素和多氧霉素是核苷肽類抗生素；相同的是，這些化合物都是有效的抗真菌劑，因此，推測(cè)這些調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)域序列可能是檢測(cè)抗真菌產(chǎn)物的通用信號(hào)。此外，PimR的七聚體與SanG和PolR中的完全相同。

PimM是納他霉素生物合成的第二個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子，pimM缺失的突變體中納他霉素的生產(chǎn)完全中斷，說明PimM是納他霉素生物合成過程中的另一個(gè)正調(diào)控蛋白。PimM的N末端包含一個(gè)PAS傳感器結(jié)構(gòu)域，C末端含與DNA結(jié)合的LuxR型HTH結(jié)構(gòu)。PAS傳感器結(jié)構(gòu)域能檢測(cè)到外界物理或化學(xué)信號(hào)且具有響應(yīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的活性。與大多數(shù)其他傳感器結(jié)構(gòu)域不同，含有PAS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞溶質(zhì)中，因此它們可以檢測(cè)內(nèi)部信號(hào)，也可以穿過細(xì)胞膜檢測(cè)外部環(huán)境因素。與大部分原核PAS結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)因子相比，如雙組分系統(tǒng)的傳感器激酶，PimM不屬于雙組分系統(tǒng)。最近，已有研究解釋了PimM在納塔爾鏈霉菌中的作用方式，并且確定了其結(jié)合位點(diǎn)為CTVGGGAWWTCCCBAG，該位點(diǎn)恰好是被調(diào)控啟動(dòng)子的上游第35位六聚體。

PimM不僅存在于納他霉素的合成基因簇中，在其他已知抗真菌多烯的生物合成基因簇中還發(fā)現(xiàn)了同源基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白，且已被證明它們的功效與pimM相同。兩性霉素合成中的amphRⅣ基因，制霉菌素合成中的nysRⅣ和菲律賓菌素合成中的pteF是PAS-LuxR類的異源調(diào)節(jié)因子的編碼基因，將它們分別引入到pimM敲除的納塔爾鏈霉菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體一定程度上恢復(fù)了納他霉素的生產(chǎn)。此外，將單一拷貝的pimM分別導(dǎo)入產(chǎn)生兩性霉素的節(jié)狀鏈霉菌、產(chǎn)生菲律賓菌素的阿維鏈霉菌及裂霉素產(chǎn)生菌龜裂鏈霉菌后，增加了它們所有多烯產(chǎn)物的產(chǎn)量，這說明這些調(diào)節(jié)因子是完全可交換的。PimR和PimM以協(xié)同方式起作用，PimR結(jié)合到PimM啟動(dòng)子上并激活其轉(zhuǎn)錄，PimM直接激活納他霉素8個(gè)結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子 （pimS2～pimS4、pimS1、pimAB、pimD、pimE、pimI、pimK和pimJ），并影響其轉(zhuǎn)錄。PimM發(fā)揮作用并不依賴于PimR調(diào)控蛋白，但增加PimM的表達(dá)量可以顯著提高納他霉素的產(chǎn)量，而提高PimR表達(dá)卻不影響納他霉素的產(chǎn)量。此外，PimM 能通過激活其他調(diào)節(jié)因子間接調(diào)節(jié)pimC基因的表達(dá)（圖1-6）。

PimM被認(rèn)為是一個(gè)特定于納他霉素合成的調(diào)節(jié)因子，但近年的研究表明，它不應(yīng)該作為途徑特異性因子，而是作為具有更廣泛影響的調(diào)節(jié)因子。例如，pimM的操縱子常用于尋找阿維鏈霉菌的基因組中同源蛋白質(zhì)PteF的假定靶點(diǎn)，在阿維鏈霉菌的菲律賓菌素合成基因簇pte中發(fā)現(xiàn)了101個(gè)假定操縱子，在基因簇外發(fā)現(xiàn)了97個(gè)。這些結(jié)合位點(diǎn)位于初級(jí)和次級(jí)代謝各個(gè)層次基因的內(nèi)部或上游，包括遺傳信息處理、DNA復(fù)制和修復(fù)、能量代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、形態(tài)分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和次生代謝物生物合成等，這也表明調(diào)節(jié)因子可以控制調(diào)節(jié)這些過程。Vicente等從中選出17個(gè)操縱子，通過EMSA顯示了它們與pimM DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合過程。隨后，對(duì)ATP合酶抑制劑寡霉素的生物合成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其基因簇包含兩個(gè)操作子。PteF缺失的突變體導(dǎo)致菲律賓菌素產(chǎn)量過低，且其生長(zhǎng)形態(tài)與野生型菌株相比，突變株的孢子延遲形成。此外，其olm基因的表達(dá)量減少，寡霉素產(chǎn)量也下降顯著，而基因互補(bǔ)的突變體卻恢復(fù)了表型。這證明了pteF能夠同時(shí)調(diào)節(jié)兩種相關(guān)的次級(jí)代謝物，菲律賓菌素和寡霉素的生物合成。這種交叉調(diào)節(jié)又可以調(diào)節(jié)到上面的所有反應(yīng)過程，這在以前是沒有發(fā)現(xiàn)的，PAS-LuxR調(diào)節(jié)因子實(shí)際上能影響一系列連鎖反應(yīng)。

小型多烯抗生素基因簇都包含編碼膽固醇氧化酶的基因，在納他霉素合成時(shí)，編碼膽固醇氧化酶的基因是pimE和scnE；四霉素合成中為tetrO；在菲律賓菌素合成時(shí)是pteG和filG；在裂霉素合成中是rimD。膽固醇氧化酶是一種黃素蛋白，催化膽固醇氧化成5-膽甾烯-3-酮，同時(shí)分子氧還原為過氧化氫，最后，Δ5鍵異構(gòu)化生成4-膽固醇-3-酮。該酶在參與膽固醇或具有3-β-羥基結(jié)構(gòu)的其他固醇時(shí)，細(xì)菌中生長(zhǎng)所需的碳源和能量開始降解，但在抗真菌物質(zhì)生產(chǎn)中沒有明顯的作用。

在納塔爾鏈霉菌中，PimE對(duì)納他霉素生物合成是必需的，PimE失活的菌株不能產(chǎn)生納他霉素，然而，這種胞外酶或其他膽固醇氧化酶，在添加到敲除pimE后突變體的培養(yǎng)液或“休眠細(xì)胞”時(shí)能恢復(fù)納他霉素的生產(chǎn)。這說明PimE可以作為真菌傳感器經(jīng)麥角甾醇的檢測(cè)和響應(yīng)觸發(fā)，通過未知的機(jī)制恢復(fù)納他霉素的生產(chǎn)。此外，這對(duì)土壤中膜中含麥角固醇的真菌微生物與其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生了一種選擇性優(yōu)勢(shì)。

生物合成基因簇的調(diào)控因子有時(shí)直接結(jié)合在下游靶基因的啟動(dòng)子上激活其轉(zhuǎn)錄，有時(shí)多個(gè)調(diào)控基因構(gòu)成一個(gè)級(jí)聯(lián)的調(diào)控系統(tǒng)。大部分情況下途徑特異性調(diào)控基因所起的作用是激活相關(guān)基因簇的表達(dá)，雖然這些正調(diào)控因子作用相似但在結(jié)構(gòu)域組成上有很大區(qū)別，對(duì)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域起著不同的調(diào)控作用。

2.全局多效調(diào)控

相比途徑特異性調(diào)控因子，在抗生素的合成、形態(tài)分化過程中還存在一些能夠調(diào)控多個(gè)代謝途徑的全局多效調(diào)控基因，它們常存在于抗生素的合成基因簇之外，通常，它們通過途徑特異性調(diào)控因子實(shí)施。

在鏈霉菌中，PhoR-PhoP雙組分系統(tǒng)是研究較為詳細(xì)的磷酸雙組分調(diào)控系統(tǒng)，它由信號(hào)激酶和受體調(diào)控蛋白兩個(gè)部分組成。磷酸可以作為細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)物質(zhì)，同時(shí)作為信號(hào)分子參與代謝以及調(diào)控。細(xì)胞形態(tài)發(fā)育、次級(jí)代謝過程，眾多抗生素、色素和免疫抑制劑等都受到磷酸的調(diào)控。無機(jī)磷酸鹽對(duì)納塔爾鏈霉菌中納他霉素的合成有非常敏感的抑制作用，濃度低至2mmol/L時(shí)就足以阻斷納他霉素的產(chǎn)生，這種負(fù)調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。在其他鏈霉菌，如達(dá)托霉素生產(chǎn)菌玫瑰孢鏈霉菌L30中，也發(fā)現(xiàn)了磷酸雙組分系統(tǒng)PhoR-PhoP能夠正調(diào)控達(dá)托霉素的生產(chǎn)，結(jié)果表明，相比出發(fā)菌株，PhoP和PhoR-PhoP缺失株中納他霉素的生物合成時(shí)間均提前且其產(chǎn)量提高約70%。

雙組分系統(tǒng)PhoR-PhoP屬于ⅢA類的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，它控制細(xì)胞對(duì)磷酸鹽稀缺的反應(yīng)，PhoR是膜結(jié)合信號(hào)激酶，PhoP是DNA結(jié)合響應(yīng)調(diào)節(jié)因子，PhoP也控制目的基因pho因子的轉(zhuǎn)錄。PhoP作為一個(gè)自調(diào)控因子，磷酸化的PhoP與自身啟動(dòng)子的保守位點(diǎn)PHO盒的結(jié)合發(fā)生在磷酸鹽耗盡之后，隨后，Mendes等對(duì)納塔爾鏈霉菌中的PhoU-PhoR-PhoP區(qū)域進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)來自天藍(lán)色鏈霉菌的PhoP蛋白會(huì)與納塔爾鏈霉菌PhoU-PhoRP基因內(nèi)部區(qū)域中的PHO盒的一致的序列結(jié)合，這表明該系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在PhoP缺失的突變體中幾個(gè)納他霉素基因簇中的基因表達(dá)卻出現(xiàn)了上升，但在整個(gè)基因簇中卻未發(fā)現(xiàn)一樣的PHO盒，且PhoP蛋白不能直接結(jié)合到納他霉素合成基因簇內(nèi)基因啟動(dòng)子區(qū)域，這表明，基因調(diào)節(jié)磷酸鹽的濃度是由PhoP通過其他調(diào)節(jié)子介導(dǎo)，間接調(diào)節(jié)納他霉素的生物合成。

WhiG是恰塔努加鏈霉菌中另一個(gè)多效調(diào)控因子，它通過結(jié)合pimC的同源基因scnC、pimD的同源基因scnD的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)基因間接正向地調(diào)節(jié)納他霉素產(chǎn)量，同時(shí)也作為scnRⅠ（pimR的同源基因）和scnRⅡ（pimM的同源基因）的轉(zhuǎn)錄激活因子。

其他多效的結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)因子還有AdpA，它在恰塔努加鏈霉菌中作為納他霉素合成的正調(diào)控因子，并作為一個(gè)重要的形態(tài)分化和次級(jí)代謝調(diào)控因子。AdpA通過結(jié)合自身啟動(dòng)子間接調(diào)控scnRⅠ，它直接正調(diào)控的對(duì)象是WblA，它也是納他霉素生物合成和形態(tài)學(xué)分化的關(guān)鍵激活因子。

眾所周知，納他霉素的合成是一個(gè)耗氧過程，氧氣的供應(yīng)能有效調(diào)節(jié)產(chǎn)物合成。然而，低濃度的氧氣會(huì)限制菌株的生長(zhǎng)及納他霉素的合成，高濃度的氧氣則會(huì)升高胞內(nèi)活性氧（ROS），破壞細(xì)胞組分。細(xì)胞內(nèi)活性氧失衡時(shí)，H2O2將 pimM作為直接或間接靶標(biāo)，通過氧化還原機(jī)制調(diào)控并提高納塔爾鏈霉菌中納他霉素的合成。超氧化物歧化酶SodF的失活導(dǎo)致納他霉素產(chǎn)量降低，然而抑制H2O2分解酶，如烷基過氧化氫酶系統(tǒng)中的AhpCD或過氧化氫酶KatA1，卻導(dǎo)致納他霉素產(chǎn)量的提高，因此，胞內(nèi)H2O2和納他霉素的產(chǎn)量呈正相關(guān)。最近，通過轉(zhuǎn)錄組分析了納塔爾鏈霉菌磷酸鹽代謝和氧化應(yīng)激之間的交互作用，SodF或AhpCD的缺失都導(dǎo)致納他霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄延遲激活，推測(cè)和培養(yǎng)液中磷酸耗盡有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在氧脅迫條件下，細(xì)胞NADPH / NADH的比例和支鏈氨基酸代謝提供的合成前體是納他霉素合成的主要瓶頸。

γ-丁內(nèi)酯（γ-GBL）（圖1-7）是由部分鏈霉菌及少數(shù)其他放線菌合成的具有群體感應(yīng)效應(yīng)功能的小分子信號(hào)分子。群體感應(yīng)是一種通信機(jī)制，允許細(xì)菌根據(jù)特定信號(hào)分子濃度高效監(jiān)測(cè)環(huán)境中自身或群體的數(shù)量變化，并通過不同的適應(yīng)機(jī)制以適應(yīng)。生長(zhǎng)中的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外信號(hào)，通常稱為自動(dòng)誘導(dǎo)劑。在鏈霉菌屬中，細(xì)胞的形態(tài)分化和次生代謝物生物合成在納摩爾每升濃度下的群體感應(yīng)信號(hào)下就能發(fā)揮調(diào)控作用。

鏈霉菌將GBL作為自身誘導(dǎo)劑，通過這些自動(dòng)誘導(dǎo)因子與同源受體的相互作用介導(dǎo)傳導(dǎo)信號(hào)，導(dǎo)致受體從DNA解離，從而引導(dǎo)了目的基因的轉(zhuǎn)錄。因此，GBL受體是轉(zhuǎn)錄因子tetR超家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。Du等對(duì)納塔爾鏈霉菌（sngR）和恰塔努加鏈霉菌（scgR）中的GBL受體蛋白進(jìn)行了研究。Zhou等發(fā)現(xiàn)恰塔努加鏈霉菌中sprA是GBL受體的同源基因，而且sngR和sprA是次級(jí)代謝物生產(chǎn)和形態(tài)分化的正調(diào)節(jié)因子。通常，由上游且遠(yuǎn)離GBL受體的基因編碼GBL合酶，有研究分別在納塔爾鏈霉（sngA）和恰塔努加鏈霉菌（scgA）中描述過這種情況。在恰塔努加鏈霉菌中，緊接在scgA下游的第二個(gè)基因scgX也參與了GBL的生物合成，sngA或scgA合酶的失活導(dǎo)致納他霉素產(chǎn)量降低和形態(tài)分化延遲，推測(cè)此現(xiàn)象是細(xì)胞內(nèi)假定GBL的減少導(dǎo)致。然而，研究從未在納塔爾鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)真正的GBL。

雖然在納塔爾鏈霉菌中未發(fā)現(xiàn)任何GBL，但在其內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新型的誘導(dǎo)化合物，PI因子（2，3-二氨基-2，3-雙羥甲基-1，4-丁二醇）（圖1-7）。對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，PI因子能誘導(dǎo)納塔爾鏈霉菌突變株中的多烯化合物的產(chǎn)生，且在納摩爾每升濃度下就能使其失去生成納他霉素的能力。PI因子通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子PimT從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)出，與GBL相比，它是在膜上而不是在胞內(nèi)進(jìn)行識(shí)別。然而，PI因子的確切作用機(jī)制仍未可知，同時(shí)PI因子的研究進(jìn)展受到其提取純度的限制。Morin等報(bào)道了一種化學(xué)合成方法，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。同時(shí)，納塔爾鏈霉菌似乎能夠結(jié)合不同的群體感應(yīng)信號(hào)，如灰色鏈霉菌中的A因子，它是一個(gè)高效的GBL類自動(dòng)調(diào)節(jié)子，納塔爾鏈霉菌并不會(huì)合成A因子，但是在不產(chǎn)納他霉素的突變體中加入A因子后卻能恢復(fù)納他霉素的生產(chǎn)。

此外，Recio還發(fā)現(xiàn)丙三醇、乙二醇和1，2-丙二醇等PI因子結(jié)構(gòu)類似物在一定濃度下也能催化納塔爾鏈霉菌中納他霉素的合成。盡管確切的機(jī)制仍然未知，丙三醇的作用似乎與PI因子誘導(dǎo)作用無關(guān)。最近，寇美辰等以恰塔努加鏈霉菌為發(fā)酵菌種，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加PI因子結(jié)構(gòu)類似物1，2-丙二醇、丙三醇和三乙醇胺，發(fā)酵培養(yǎng)基中納他霉素的產(chǎn)量提高了1.6倍，這說明添加一定量的PI因子結(jié)構(gòu)類似物可以提高納他霉素產(chǎn)量。