第二節(jié) 酵母菌的發(fā)酵機理
酵母是兼性微生物，有氧條件下主要進行生長，無氧條件下主要進行發(fā)酵。在不同的細胞狀態(tài)下，或啟動發(fā)酵途徑，或啟動呼吸途徑，產生不同的終產物。
一、糖酵解
糖酵解包括生物細胞將己糖轉化為丙酮酸的一系列反應。這些反應有的可在厭氧條件下進行(酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵)，有的也可在有氧條件下進行(呼吸)，它們構成了糖的各種生化轉化的起點。糖酵解的特點是，葡萄糖分子經轉化成1，6-二磷酸果糖后，在醛縮酶的催化下，裂解成2個三碳化合物分子，由此再轉變成2分子的丙酮酸。在糖酵解中，由于葡萄糖被轉化為1，6-二磷酸果糖后開始裂解，故又稱之為磷酸己糖途徑。在糖分子的裂解過程中，1分子葡萄糖降解成2分子丙酮酸，消耗2分子ATP，產生4分子ATP，因此凈得2分子ATP，葡萄糖酵解的總反應式為：
葡萄糖＋2Pi＋2ATP＋ 2ADP＋2NAD＋
2CH3COCOOH＋4ATP＋2NADH＋2H＋＋2H2O
這里需要說明的是，果糖進入酵解的途徑是果糖在己糖激酶的催化下形成6-磷酸果糖，接著進入酵解途徑。酵母對蔗糖吸收利用以前，先把蔗糖水解為葡萄糖和果糖，水解得到的己糖再經過磷酸化進入酵解途徑。
二、有氧呼吸
在有氧條件下，丙酮酸進入三羧酸(TCA)循環(huán)。開始丙酮酸羧化生成草酰乙酸或生成乙酰CoA，后兩種物質合成TCA循環(huán)的第一個物質檸檬酸。循環(huán)一次，進入的碳以CO2形式釋放，產生NADH＋H＋、FADH2 與GTP，由糖酵解與TCA循環(huán)產生的NADH＋H＋與FADH2經氧化磷酸化氧化成NAD＋與FAD，電子經細胞色素傳遞給受體氧而生成水，在膜聯(lián)ATP酶的作用下1分子NADH＋H＋氧化產生3分子ATP，1分子FADH2氧化產生2分子ATP，因此有氧條件下細胞代謝1分子葡萄糖凈獲得36或38個分子ATP。在此需要說明的是，1分子葡萄糖完全氧化產生多少個分子ATP的真實數(shù)據(jù)因具體的代謝條件而異。20世紀90年代中期以后，許多生物化學教科書改為最可能是30或32，原因在于P/O比的測定值。P/O比是被磷酸化的ADP分子數(shù)和消耗的O原子數(shù)之比，以前認為NADH＋H＋被氧化的P/O比是3，F(xiàn)ADH2被氧化的P/O比是2，20世紀90年代以后的測定值分別是2.5和1.5。
三、酒精發(fā)酵
酒精發(fā)酵是在無氧條件下酵母菌分解葡萄糖等有機物，產生酒精、二氧化碳等不徹底氧化產物，同時釋放出少量能量的過程。酒精發(fā)酵是相當復雜的生物化學現(xiàn)象，有許多連續(xù)的反應和不少中間產物，而且需要一系列酶的作用。事實上，在厭氧條件下，酵母可通過酒精發(fā)酵和呼吸兩條途徑對糖進行分解，而且這兩條途徑的起點都是糖酵解。從發(fā)酵工藝來講，既有發(fā)酵醪中的淀粉、糊精被糖化酶作用，水解生成糖類物質的反應；又有發(fā)酵醪中的蛋白質在蛋白酶的作用下，水解生成小分子的蛋白胨、肽和各種氨基酸的反應。這些水解產物，一部分被酵母細胞吸收合成菌體，另一部分則發(fā)酵生成了酒精和二氧化碳，還要產生副產物雜醇油、甘油等。
在糖的厭氧發(fā)酵中，經EMP途徑生成的丙酮酸，通過乙醛途徑被分解，形成乙醇。在乙醛途徑中，經EMP途徑生成的丙酮酸，經丙酮酸脫羧酶(PDC)催化生成乙醛，釋放出CO2，乙醛在乙醇脫氫酶(ADH)作用下最終生成乙醇。該過程消耗了EMP途徑產生的NADH2。丙酮酸在厭氧條件下，經過異化作用生成酒精和二氧化碳。而酵母在發(fā)酵作用中，糖酵解是生成ATP的唯一途徑，該過程的中間產物是乙醛。因此在酵母菌的酒精發(fā)酵中，乙醛是最終的電子受體。綜上所述，葡萄糖進行酒精發(fā)酵的總反應式為：
葡萄糖＋2Pi＋2ADP＋2H＋
2CH3CH2OH＋2CO2＋2ATP＋2H2O
在發(fā)酵的初始階段，酵母首先積累甘油、丙酮酸和乙醛，由3-磷酸甘油醛氧化產生的NADH＋H＋將磷酸二羥丙酮還原成甘油，在發(fā)酵條件下，當細胞內缺少NAD＋時，該反應就顯得特別重要。當基質中積累了足夠的乙醛和甘油時，酒精發(fā)酵才能進行。此時，與由磷酸二羥丙酮生成甘油相比，NADH＋H＋更易于將H釋放給乙醛生成乙醇。因此乙醇不斷積累，甘油生成減少。酒精發(fā)酵時，甘油的生成量約為初始糖濃度的3%～10%，具體受酵母菌株、發(fā)酵溫度、是否攪拌及基質初始pH值與SO2含量的影響。TCA循環(huán)中某些酶在厭氧條件下仍然具有活性，這些額外的途徑對發(fā)酵中的酵母來說非常重要，因為NADH＋H＋能夠重新氧化，而且能夠合成對細胞功能有重要作用的前體物質。
四、酒精發(fā)酵的副產物
酵母在酒精發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵作用和其他代謝活動同時存在，酵母除了將果汁或果醪中90%以上的糖發(fā)酵生成酒精、二氧化碳和熱量外，酵母還能夠利用另外10%以下的糖產生一系列的其他化合物，稱為酒精發(fā)酵副產物。酵母菌的代謝副產物不僅影響果酒的風味和口感，而且有些副產物，如辛酸和癸酸等，同時還對酵母的生長具有抑制作用。
1．甘油
甘油，即丙三醇，無色、無臭、味甜，外觀呈澄明黏稠液態(tài)，是一種有機物。甘油是除水和乙醇外在果酒中含量最高的化合物，主要在發(fā)酵初期形成。甘油的呈味閾值一般為3～4.4g/L，味甜，像油一般濃厚，增加酒的掛杯性與醇厚度，口感圓潤，一定含量的甘油可以提高果酒的質量，能使果酒口感圓潤，并增加口感復雜性。在佐餐酒中甘油含量為5～15g/L，平均值為7g/L，在葡萄酒中，其含量為6～10g/L。
在酒精發(fā)酵過程中，甘油的生成量，除受代謝條件影響外，還主要取決于菌株間產甘油能力的差異和基質。酵母菌株之間甘油生成能力差別很大，嗜冷酵母菌株產甘油多。高溫、長時間發(fā)酵、添加SO2、高pH值、通氣、攪拌均有利于甘油生成，初始糖濃度等也影響甘油的合成量，如紅葡萄酒發(fā)酵溫度較白葡萄酒高，其中含甘油也較多。在貯存期間，葡萄酒甘油含量提高0.04～0.12g/L。
2．乙酸
乙酸，也叫醋酸、冰醋酸，化學式CH3COOH，是一種有機一元酸，是構成果酒揮發(fā)酸的主要物質，是酵母發(fā)酵的副產物，在正常發(fā)酵情況下，乙酸在果酒中的正常含量不超過0.4～0.6g/L。當酒中乙酸含量高于1.0g/L時，大多數(shù)消費者都會嘗出醋味，所以絕大多數(shù)葡萄酒生產國將果酒中的乙酸含量限制在1.0～1.5g/L，我國為1.2g/L。
乙酸主要在發(fā)酵初期產生，它是由乙醛經氧化還原作用而形成的。發(fā)酵期間部分乙酸被還原成乙醇。在正常范圍內時，乙酸是果酒良好的風味物質，賦予果酒氣味和滋味。乙酸與醇反應生成數(shù)種具有水果香的、對果酒酒香有重要意義的乙酸酯。乙酸含量過高時說明原料或酒被某些細菌如醋酸菌、乳酸菌污染。被污染的酒暴露于空氣中時乙酸大量生成。果酒的醋味主要是由乙酸引起的。因為測定乙酸的方法簡單，所以果酒廠通過測定乙酸來監(jiān)測果酒的揮發(fā)酸情況。
3．乙醛
乙醛是無色易流動液體，有刺激性氣味，可與水和乙醇等一些有機物質互溶。乙醛可由丙酮酸脫羧產生，也可在發(fā)酵以外由乙醇氧化而產生。乙醛是果酒中最重要的醛類物質，其含量可占到總醛的90%以上。葡萄酒中乙醛的含量為20～60mg/L，有時可達300mg/L。乙醛給酒帶來苦味和氧化味，乙醛可與SO2結合形成穩(wěn)定的亞硫酸乙醛，這種物質不影響果酒的質量和味道，故可用SO2處理，使乙醛的氧化味消失。乙醛在水中的氣味閾值為1.3～1.5mg/L。酒中有SO2存在時，氣味閾值上升至100mg/L，佐餐酒中乙醛含量超過50mg/L時表明酒已被氧化了。乙醛是氧化型葡萄酒的風味物質，一般希望其含量在300mg/L以上，此時酒具有堅果的風味。乙醛是正常的酒精發(fā)酵副產物，其生成量受pH、SO2、好氧程度、澄清劑使用、酵母菌種、種齡及其接種量大小有關。發(fā)酵要結束時，乙醛重新進入酵母細胞被還原成乙醇。在某些菌株中，乙醛的生成與乙酸生成量成反比。
4．乳酸
乳酸，學名2-羥基丙酸，分子式是C3H6O3，在多種生物化學過程中起作用。發(fā)酵期間，酵母產生少量的乳酸(0.04～0.75g/L)，在葡萄酒中，乳酸含量一般低于1 g/L。果酒中的乳酸主要來自于細菌的代謝活動和酒精發(fā)酵。最常見的細菌是乳酸菌。這些細菌產生的酶將蘋果酸脫羧生成乳酸，該過程稱為蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolatic fermentation，MLF)，MLF的最大益處是將口味粗糙的蘋果酸轉化為口味柔和的乳酸。由MLF生成的乳酸是L型的，而酵母和某些細菌生成等量的L-乳酸和D-乳酸。
5．琥珀酸
琥珀酸是酵母代謝正常副產物，發(fā)酵初期生成較多，其生成量為乙醇生成量的0.5%～1.5%。果酒中琥珀酸的含量約為1g/L, 在所有的葡萄酒中都存在琥珀酸，一般為0.6～1.5 g/L。果酒中的琥珀酸主要來自糖代謝，琥珀酸在果酒中非常穩(wěn)定，無氧條件下抑制微生物的代謝活動，其乙酯是某些葡萄酒的重要芳香成分，但琥珀酸有鹽苦味，因此限制了在葡萄酒或果酒中的應用。
6．雙乙酰與乙偶姻
雙乙酰、乙偶姻是參與果酒風味形成的一類重要的4C羰基化合物，它們對果酒風味影響較為復雜。乙偶姻不是強風味活性物質，在果酒中的嗅覺閾值很高，比如在葡萄酒中的嗅覺閾值達150mg/L以上；雙乙酰能夠使酒精飲料產生不良風味，在葡萄酒中其閾值只有8mg/L。正常情況下雙乙酰在酒中含量低，對酒的風味影響較小，含量超過 0.9mg/L時，會出現(xiàn)黃油味而影響酒質。酵母在發(fā)酵初期生成較多的雙乙酰，發(fā)酵溫度高生成量多，發(fā)酵后期雙乙酰被還原成2，3-丁二醇，酵母能夠迅速降解細菌或酵母生成的雙乙酰、乙偶姻與α-乙酰乳酸。雙乙酰和乙偶姻在酵母代謝下，能夠借助酶促反應和非酶反應相互轉變，二者都能夠被最終還原為2，3-丁二醇。2，3-丁二醇在果酒中的含量為0.4～0.9g/L，無氣味，略帶甜苦味，其味可被甘油掩蓋，一般不影響酒質。雙乙酰有甜珠、黃油味和奶油味，在雪莉酒中含量相當高。乙偶姻具有甜味、黃油味，在佐餐酒中含量很低，對酒風味的影響還有待于進一步探討。目前，釀酒工藝師大多關注雙乙酰對果酒風味影響，而有關乙偶姻的研究較少。實際上，乙偶姻對果酒風味的潛在影響已經超出它的風味本身。
7．雜醇油
雜醇油是碳原子數(shù)大于2的脂肪族醇類的統(tǒng)稱。在所有酵母進行的發(fā)酵中，都會產生一定量的雜醇油，比較重要的有正丙醇、異丁醇、異戊醇等。其中，異戊醇又是雜醇油中最重要的揮發(fā)性物質，其含量在90～300mg/L之間，有時能占雜醇油總量的50%以上。正丙醇具有甜味和成熟水果味。通常白葡萄酒中的雜醇油在160～270mg/之間，紅葡萄酒中在140～420mg/L之間。
一般地認為，果酒中正常產生的雜醇油來自果實中氨基酸的還原脫氨與糖代謝。另一些雜醇油來自野生酵母與細菌的污染。在某個釀造階段被有害微生物污染時，果酒中會出現(xiàn)雜醇油味。但某些污染微生物產生的雜醇油具有令人愉快的香味。在陳釀過程中，雜醇油與酒中的有機酸反應生成酯，但反應速度要比發(fā)酵過程中酵母的酶促酯化慢得多。發(fā)酵過程中雜醇油的生成量受釀造工藝的影響。高溫發(fā)酵、發(fā)酵醪中存在懸浮顆粒、加糖發(fā)酵、帶皮發(fā)酵、加壓發(fā)酵、攪拌、通風等均有助于雜醇油的形成；添加SO2、加壓發(fā)酵、清汁發(fā)酵、低溫發(fā)酵能減少雜醇油的生成量。酵母菌種之間產雜醇油的能力也不同。
8．酯類
果酒中含有有機酸和醇類，而有機酸和醇可以發(fā)生酯化反應，生成各種酯類化合物。影響酯合成的因素包括果實成熟度、糖含量、發(fā)酵溫度、果汁澄清度等。酯具有風味，如乙酸乙酯具有“溶劑味”“指甲油味”；乙酸異戊酯具有“水果味”“梨味”或“香蕉味”；丁酸乙酯具有“花香味”或“水果味”；己酸乙酯和辛酸乙酯具有“酸蘋果味”，而乙酸苯乙酯具有“花香”“玫瑰香”與“蜂蜜香”等。由此可見，酯類影響著果酒的香氣。
在所有酯中，乙酸乙酯研究得最多。健康葡萄酒內乙酸乙酯含量一般為50～100mg/L，低含量(<50mg/L)時具有令人愉快的香氣，增加果香的復雜性；高于150mg/L時則有酸醋味。乙酸乙酯含量過高通常是因為果實、果漿或酒污染了醋酸菌的緣故。醋酸菌不僅能直接合成乙酸乙酯，而且由其生成的乙酸在非酶條件下與乙醇反應生成乙酸乙酯。
9．丙酮酸、蘋果酸
在酒精發(fā)酵過程中，生成20～30mg/L丙酮酸。丙酮酸具有鼠味、乙酸味與馬德拉酒的氧化味。在發(fā)酵過程中應盡量減少形成丙酮酸，因其與SO2具有很強的結合能力(每毫克丙酮酸結合0.72mg SO2)。添加維生素B1可以將丙酮酸的生成量減小到最少。
酵母代謝L-蘋果酸的能力與菌株的最適生長溫度有關，耐冷酵母(貝酵母、巴斯德酵母和葡萄汁酵母)可以合成L-蘋果酸，適溫的釀酒酵母在發(fā)酵過程中降解中等水平的L-蘋果酸，而耐熱的釀酒酵母和奇異酵母能夠降解40%～48% L-蘋果酸。適宜條件下酵母可以生成1g/L蘋果酸，且可以生成D(＋)-蘋果酸。酵母細胞內蘋果酸降解有兩種可能途徑，即蘋果酸酶途徑和富馬酸途徑，在發(fā)酵開始時，琥珀酸生成活躍，在發(fā)酵后期，大部分L-蘋果酸轉化成乙醇。不同的酵母菌株產琥珀酸能力不同，且增加蘋果酸的濃度會使琥珀酸產量增加。酵母屬酵母之間降解蘋果酸的能力差別顯著(0～3g/L蘋果酸之間)。
10．含硫化合物
含硫化合物主要是SO2與硫化氫。果酒酵母中，在輔因子3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸存在條件下，催化形成H2S的酶復合體是合成含硫氨基酸(蛋氨酸與半胱氨酸)必需的。過多SO2生成是因酶亞硫酸復合體突變缺陷造成的。該缺陷使得酶亞硫酸復合體過早水解而產生SO2，而不是還原成H2S。高產SO2的菌株H2S產量低，反之亦然。產H2S是果酒酵母的特性，產量由每升幾微克到幾毫克不等。果漿中的元素硫會促進H2S產生。另外，不產H2S的菌株正丙醇產生多。H2S有揮發(fā)性，為臭雞蛋味，接近閾值時，是剛發(fā)酵完新酒酵母味的一部分。在常用的果酒酵母中，貝酵母產SO2比釀酒酵母多。發(fā)酵過程中SO2積累量在12～64mg/L之間。影響SO2合成的主要因素是酵母菌種、發(fā)酵溫度及果實含硫量。SO2> 30mg/L時，通常是在果酒發(fā)酵前后添加的結果。
果酒中還有一些其他硫化物。這些物質可能來自含硫氨基酸、多肽和蛋白質的代謝。有機硫的異味與酵母自溶有關。結構最簡單的含硫化合物是硫醇，其中最重要的是乙硫醇，達到閾值時產生腐爛圓蔥味、燃燒橡膠味，濃度高時具有臭鼬味、糞便味，另一種物質是2-巰基乙醇，與酒的谷倉味有關。硫醚是另一類含硫化合物。二甲硫在葡萄酒中高于閾值時有熟卷心菜味、蝦味，低于閾值時為蘆筍味、玉米味和糖蜜味。二甲基二硫和二乙基硫醚有時也存在于葡萄酒中。
11．多糖、糖苷酶與甘露糖蛋白
果酒酵母還能產生多糖膠體物質，特別是甘露聚糖與葡聚糖，有時為半乳糖與鼠李糖的聚合物。這些聚合物會阻塞膜濾器通道，防止酒石酸鹽沉淀，有利于酒中芳香物質的揮發(fā)。除酵母菌株特性外，促進細胞繁殖的因素如溫度、氧、銨離子等也會促進膠體物質的生成，低pH與高酒精含量有利于膠體物質從細胞膜釋放。
某些果實中存在單萜類物質，如香葉醇、橙花醇、里哪醇、香茅醇與α-萜品醇，賦予果實特有的芳香。當這些物質以糖苷形式存在時，無揮發(fā)性，也就沒有香氣。若采用酶切斷其中的糖苷鍵，使萜烯游離，萜烯的香氣就會體現(xiàn)出來。但用高β-葡萄糖苷酶活性酵母釀造葡萄酒時，發(fā)現(xiàn)酒中的萜烯含量與酒的感官質量并沒有顯著變化。
甘露糖蛋白是自溶時酵母細胞壁釋放的親水膠體，這些蛋白質有助于蛋白質與酒石酸鹽的穩(wěn)定性，與香氣物質發(fā)生反應，降低單寧的苦澀味。甘露糖蛋白是高度分支的雜蛋白，分子量變化很大。陳釀時攪拌會增加這些物質的含量，而微氧處理作用甚微。有學者建議使用發(fā)酵結束時自溶迅速且產生大量蛋白質的酵母菌株或使用β-1，3-葡聚糖酶以從酵母細胞壁釋放更多的甘露糖蛋白。
五、影響酒精發(fā)酵的因素
1．溫度
盡管酵母菌在低于10℃的溫度條件下很難生長繁殖，但它的孢子可以抵抗－200℃的低溫。液態(tài)酵母的活動最適溫度為20～30℃，當溫度達到20℃時，酵母菌的繁殖速度加快，在30℃時達到最大值；而當溫度繼續(xù)升高達到35℃時，其繁殖速度迅速下降，酵母菌呈疲勞狀態(tài)，酒精發(fā)酵有停止的危險。只要在40～45℃保持1～1.5h或在60～65℃保持10～15min就可殺死酵母。但干態(tài)酵母抗高溫的能力很強，可忍受5min 115～120℃的高溫。在20～30℃的溫度范圍內，每升高1℃，發(fā)酵速度就可提高10%。因此發(fā)酵速度隨著溫度的提高而加快。但是，發(fā)酵速度越快，停止發(fā)酵越早，因為在這種情況下，酵母菌的疲勞現(xiàn)象出現(xiàn)較早。在一定范圍內，溫度越高，酵母菌的發(fā)酵速度越快，產酒精效率越低，而生成的酒度就越低。因此，如果要獲得高酒度的果酒，必須將發(fā)酵溫度控制在足夠低的水平上。
當發(fā)酵溫度達到一定值時，酵母菌不再繁殖，并且死亡，這一溫度就稱為發(fā)酵臨界溫度。如果超過臨界溫度，發(fā)酵速度就大大下降，并引起發(fā)酵停止。由于發(fā)酵臨界溫度受許多因素如通風、基質的含糖量、酵母菌的種類及其營養(yǎng)條件等的影響，所以很難將某一特定的溫度確定為發(fā)酵臨界溫度。在實踐中主要利用“危險溫區(qū)”這一概念。在一般情況下，發(fā)酵危險溫區(qū)為32～35℃。但這并不是表明每當發(fā)酵溫度進入危險區(qū)，發(fā)酵就一定會受到影響，并且停止，而只表明，在這一情況下，有停止發(fā)酵的危險。需要強調指出的是，在控制和調節(jié)發(fā)酵溫度時，應盡量避免溫度進入危險區(qū)而不能在溫度進入危險區(qū)以后才開始降溫。因為這時，酵母菌的活動能力和繁殖能力已經降低。浸漬發(fā)酵最佳溫度25～30℃；而清汁發(fā)酵的最佳溫度為18～20℃。
2．通風
酵母是兼性微生物，發(fā)酵過程中需要氧。在完全的無氧條件下，酵母菌只能繁殖幾代，然后就停止。這時，只要給予少量的空氣，它們又能出芽繁殖。但如果缺氧時間過長，多數(shù)酵母菌細胞就會死亡。酵母細胞的合成及膜功能的調節(jié)需要甾醇與不飽和脂肪酸，微量的氧有利于不飽和脂肪酸和甾醇的合成。另外煙酸的合成也需要分子氧。
在果實前處理時果汁吸收的氧(約9mg/L)能夠滿足酵母的生長需求。深色果漿發(fā)酵期間通過果汁循環(huán)吸入氧有利于發(fā)酵進程。在對數(shù)生長期末通氧效果特別明顯。通氧后酵母細胞數(shù)增加，平均細胞活力增強。通風還有利于乙醛的生成，乙醛對花色苷與單寧聚合物的早期聚合有利，因而有利于顏色穩(wěn)定性。發(fā)酵后，限制通氧(40mg/L)有利于紅葡萄酒的成熟。與之相反，大多數(shù)白葡萄酒與淺色果酒在發(fā)酵后應避免與氧接觸。而在某些白葡萄酒釀造過程中，酒液與酒腳攪拌混合時應限制性通氧。發(fā)酵停滯的果酒經過通風可使發(fā)酵能力恢復。生產起泡果酒時，二次發(fā)酵前輕微通風有利于發(fā)酵的進行。
發(fā)酵白葡萄汁或釀造果香突出的果酒時應避免接觸過多的氧。通風有利于高級醇和乙醛的生成，抑制酯合成，但在發(fā)酵開始或發(fā)酵最初幾天短期通風可使情況逆轉。通風可除去H2S，延長通風時間促進尿素的合成，增加氨基甲酸乙酯合成的可能性。氧的吸收受許多因素的影響，如澄清情況、皮汁接觸情況、多酚含量、SO2含量、多酚氧化酶、糖濃度、溫度、泵循環(huán)及發(fā)酵速度等。在發(fā)酵過程中，氧越多，發(fā)酵就越快、越徹底。因此，在生產中常用倒罐的方式來保證酵母菌對氧的需要。
3. pH值
酵母菌在中性或微酸性條件下，發(fā)酵能力最強。如在pH4.0的條件下，其發(fā)酵能力比在pH3.0時更強。低pH值有利于某些氨基酸的吸收，有助于SO2的殺菌作用，可抑制果汁中多種雜菌的生長。低pH值會引起乙基酯和乙酸酯的降解。pH值高時有利于甘油與高級醇的生成。在pH很低的條件下，酵母菌生成揮發(fā)酸或停止活動。因此，酸度高并不利于酵母菌的活動，但卻能抑制其他微生物(如細菌)的繁殖。葡萄酒發(fā)酵適宜pH值為3.3～3.5，其他果酒的發(fā)酵pH值不低于3為宜。若pH值過低，酵母很難將某些果漿(汁)發(fā)酵徹底。
4．糖
葡萄糖和果糖是酵母的主要碳源和能源，葡萄糖利用速度比果糖快。蔗糖先被位于酵母細胞膜和細胞壁之間的轉化酶在膜外水解成葡萄糖和果糖，然后再進入細胞，參與代謝活動。果酒酵母能利用的碳源還有醋酸、乙醇、甘油等，但這些物質在果漿中含量較低。水果中的其他糖如戊糖則不能被酵母利用。糖度高，發(fā)酵生成的甘油較多，生成的乙醇及其酯類也多。果汁加糖發(fā)酵時，高級醇和乙醛的生成量增加。當果汁含糖量過高時，適當添加氮源有利于酒精發(fā)酵且減少高級醇的形成。糖濃度影響酵母的生長和發(fā)酵。糖度為1～2°Bx時生長發(fā)酵速度最快；5°Bx開始抑制酒精發(fā)酵，單位糖的酒精產率開始下降；高于25°Bx出現(xiàn)發(fā)酵延滯；高于30°Bx時單位糖酒精產率顯著降低；而高于70°Bx時大部分果酒酵母不能發(fā)酵。
5. SO2
在大多數(shù)情況下，添加SO2主要是為了抑制有害菌的生長。SO2是理想的抑菌劑，果酒酵母對其不敏感，處于生長旺盛期的酵母甚至比休眠細胞更耐SO2。在正常使用濃度范圍內(健康果實<50mg/L)，SO2不會影響酒精發(fā)酵速度，但會推遲發(fā)酵的開始。15～20mg/L的SO2可使酵母活細胞數(shù)由106CFU/mL降至104CFU/mL以下，1.2～1.5 g/L的SO2能夠殺死酵母菌。SO2還有利于甘油的生成，減少乙酸生成量。SO2與果汁中某些物質結合而失去殺菌、抑菌作用。SO2還可以影響酵母的代謝活動，SO2容易和乙醛、丙酮酸、α-酮戊二酸等羰基化合物結合，增加這些物質的生成量。因此成品酒中這些物質的濃度隨SO2添加濃度的增加而升高。被固定的SO2量與糖含量、pH值、溫度等因素有關。只有游離SO2才具有殺菌作用，果汁pH值低，SO2殺菌活性高。
6．含氮化合物
果實中的含氮化合物含量差別很大。在某些情況下，果實中的可同化氮達不到酵母生長繁殖的最低要求(140～150mg/L)。含氮少會造成起發(fā)困難或發(fā)酵緩慢，因為氮饑餓會不可逆轉地造成糖運輸系統(tǒng)鈍化。澄清、過濾或離心的果汁中含氮量低。氮用來合成蛋白質、嘧啶核苷酸與核酸。酵母可由糖和無機氮合成這些物質。由此，大多數(shù)酵母不需要存在于果汁中的這些物質。但當基質中存在這些含氮物時，酵母能夠同化。高糖果汁中添加無機氮可獲得高的酒精得率，減少高級醇的生成，增加發(fā)酵醪中的酵母細胞數(shù)，加快發(fā)酵速度。
含氮化合物在酵母對數(shù)生長期需要量最多，吸收最快。酵母最容易吸收的無機氮是氨。氧化態(tài)的氮可直接參與有機物的合成。釀酒酵母有數(shù)個氨基酸運輸系統(tǒng)。一個是非專一性的，可輸送除脯氨酸外的所有氨基酸。其他系統(tǒng)有較強的專一性，只輸送某些特定的氨基酸。某些氨基酸特別容易被同化，如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸與色氨酸，而另外一些如絲氨酸、精氨酸、脯氨酸難于被同化。胺和多肽也可以作為可同化氮源。果酒酵母不能利用蛋白質，因其既不能將蛋白質送入細胞內，也不能將蛋白質在胞外酶解成氨基酸。
果汁中含氮不足時常用的無機氮源是(NH4)2HPO4。在美國，最高允許(NH4)2HPO4添加量為960mg/L，相當于提供氮203mg/L；歐洲國際葡萄與葡萄酒組織(OIV)最多只允許添加300mg/L(NH4)2HPO4，澳大利亞控制葡萄酒中的最高磷酸鹽含量為400mg/L。一些釀酒師提倡添加含有氨基酸、礦物質、維生素及其他酵母生長因子的營養(yǎng)促進劑。在具體選用時應確定是否符合我國的相關規(guī)定，根據(jù)待發(fā)酵果漿或果汁的營養(yǎng)組成與使用的果酒酵母的需求而定。
7．脂質
組成植物細胞的脂質可分為兩組，第一組主要是以異戊二烯的聚合物及其衍生物和環(huán)戊烷多氫菲衍生物組成，第二組由脂肪酸與醇(如甘油)發(fā)生酯化反應生成的酸及其衍生物組成。第一組包括萜類物質和甾醇等，第二組包括磷脂、脂肪、蠟、糖脂等。所有脂質對植物細胞和酵母細胞的結構和功能都非常重要，然而只有脂肪、蠟和甾醇直接影響果酒的質量。在發(fā)酵中和發(fā)酵后，兩種脂質都有助于維持細胞膜功能、提高酵母的耐乙醇能力。
脂質的功能很多，如為酵母細胞膜的基本組成成分(磷脂與甾醇)、色素(類胡蘿卜素)、能量貯備物(脂肪)、與蛋白質生成脂蛋白成為調節(jié)因子等。無氧時果酒酵母不能合成甾醇和不飽和脂肪酸，也就無法合成脂質。厭氧條件下脂合成的抑制，使高度澄清的果汁發(fā)酵滯緩，澄清可除去90%的脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸、亞麻酸)。此外，甾醇如麥角固醇也有可能從葡萄汁中除去。但甾醇和不飽和脂肪酸貯存量的減少會加劇乙醇誘導的葡萄糖吸收減弱與發(fā)酵終止。有氧條件下酵母合成某些中間代謝產物如羊毛甾醇、麥角甾醇以及不飽和脂肪酰輔酶A等，這些物質通稱為“存活因子”。甾醇是保持膜滲透性的必需物，能夠增加酵母活力并延長它們的發(fā)酵活性。甾醇還影響揮發(fā)性氣味與風味物質的合成。
果酒酵母對中鏈羧酸如辛酸、癸酸特別敏感。這些酸是發(fā)酵期間酵母發(fā)酵正常副產物，它們的存在加劇了乙醇誘導的營養(yǎng)成分如氨基酸的泄漏。添加甾醇、不飽和長鏈脂肪酸或各種吸附性物質如酵母菌皮、活性炭、膨潤土、硅膠等都能使這些癥狀得到緩解或逆轉。酵母菌皮是酵母細胞壁的殘留物，能提供部分可同化氮、不飽和脂肪酸和甾醇，但氧化變質的酵母菌皮不能再使用。
8．酵母菌皮
在對酒精發(fā)酵停止原因的研究中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，酵母菌本身可以分泌一些抑制自身活性的物質。這些抑制發(fā)酵的物質是酒精發(fā)酵的中間產物，主要是脂肪酸。所以除去這些脂肪酸可以促進酒精發(fā)酵，防止發(fā)酵中止。在酒精發(fā)酵過程，活性炭可以吸附這些脂肪酸，從而促進酒精發(fā)酵。但是，在果酒中加入活性炭后很難將之除去，而且很多國家限制活性炭的使用。所以，活性炭的這一特性難以實際應用。酵母菌皮同樣具有這種吸附特性，酵母菌皮一般用高溫殺死酵母菌而獲得。發(fā)酵前加入0.2～1.0g/L酵母菌皮，可大大加速發(fā)酵，而且使發(fā)酵更為徹底。
酵母菌皮除可用于防止發(fā)酵中止外，還可用于發(fā)酵停止的果酒重新發(fā)酵。第一次發(fā)酵由于各種原因自然中止，含有大量殘?zhí)恰＿@時加入酵母菌皮，可除去脂肪酸，使發(fā)酵重新觸發(fā)，而且發(fā)酵更為徹底。大量實驗結果還表明，酵母菌皮不僅能有效地防止發(fā)酵的中止和觸發(fā)發(fā)酵中止的果酒的再發(fā)酵，而且不影響果酒的感官特征。因此，OIV(2006)已將酵母菌皮的使用，列入允許使用的工藝處理名單。
9．維生素
維生素是酶或輔酶的前體，對酵母代謝有重要的調節(jié)作用。因菌種與生長環(huán)境不同，酵母還需要各種維生素如維生素B1、核黃素、泛酸、維生素B6、煙酸、生物素等。一般地，在生產實踐中酵母屬的所有菌株都需要生物素與泛酸。缺乏泛酸可導致H2S生成。維生素B1與酮酸的脫羧作用有關，有的酵母具有維生素B1合成能力，有的則沒有，SO2會破壞果汁中的維生素B1，因此在接酵母發(fā)酵果漿(汁)之前，一般添加適量的維生素B1。煙酸用于合成NAD＋與NADP＋。真菌污染的葡萄中維生素含量低，此時添加維生素有利于縮短發(fā)酵延滯期。適量的維生素會減少能與SO2結合的羧基化合物的生成量，由此可減少釀造過程中SO2的用量。此外，維生素還可以減少高級醇的形成。
10. CO2與壓力
CO2為正常發(fā)酵副產物，每克葡萄糖約產260mL CO2，發(fā)酵期間CO2的溢出帶走約20%的發(fā)酵熱。揮發(fā)性化合物也隨CO2一起釋出。乙醇的揮發(fā)損失為其產量的1%～1.5%，具體隨糖濃度與發(fā)酵液溫度而變。芳香物質大約損失25%，損失量與水果品種與發(fā)酵溫度有關，一般乙酸酯的損失比乙基酯的損失多。增大發(fā)酵罐體積，減少發(fā)酵果汁與空氣的接觸面積，降低發(fā)酵溫度，使CO2緩慢溢出，都有利于香氣成分的保留。
當壓力上升至0.7MPa時酵母生長停止。低pH值、高乙醇含量增加了酵母對壓力的敏感性。CO2對酵母的作用是改變了膜的組成與透性。另外CO2會影響羧化反應與脫羧反應間的平衡。加壓發(fā)酵時，用于酵母繁殖的糖顯著減少，單位糖產酒增多，發(fā)酵結束時，新酒中也往往殘留較多糖分。德國、澳大利亞、南非等國就采用加壓發(fā)酵生產半干葡萄酒。
11．礦物質
以干重計時，酵母含有3%～5%的磷、2.5%的鉀、0.3%～0.4%的鎂、0.5%的硫與微量的鈣、氯、銅、鐵、鋅和錳等。銅、鐵、鋁含量高抑制酒精發(fā)酵，酵母生長需要供給磷源，用于合成核酸、磷脂、ATP及其他化合物。鉀對磷吸收是必要的，缺鉀可能會導到酒精發(fā)酵滯緩。無機離子是酵母許多酶活性部位的重要組成成分，并且能調節(jié)細胞代謝，維持細胞質pH值及離子平衡。
K＋的作用是抗有毒離子，控制胞內pH，分泌鉀以平衡主要離子如Zn2＋、CO2的吸收，穩(wěn)定發(fā)酵最適pH；Mg2＋的作用促進糖吸收，減輕不利環(huán)境因素對細胞的影響；Ca2＋在生長過程中被細胞主動吸收，與細胞壁蛋白結合；減輕不良環(huán)境對細胞的影響；抵消亞適量Mg2＋的抑制與促進；Zn2＋是糖酵解及某些維生素合成必需的無機離子，pH<5時吸收減慢，吸收一個Zn2＋，釋放2個K＋；Mn2＋與調節(jié)Zn2＋的作用有關，促進蛋白質的合成；Fe2＋、Fe3＋位于許多酵母蛋白的活性部位；Na＋靠被動擴散進入細胞，促進某些糖的吸收；Mo2＋、Co2＋在低濃度時促進生長。
六、酵母抑制機理及酒精發(fā)酵中止
1．酵母抑制機理
糖和乙醇都是抑制酵母活動的因素。高濃度的糖限制酵母的生長量；乙醇在酵母細胞中的積累也使酵母停止生長。在酒精發(fā)酵的條件下，酵母細胞內的乙醇濃度變化相對較小；如果基質中含有類固醇，則酵母細胞內乙醇濃度比對照(不含類固醇)高出兩倍，且被發(fā)酵的糖量更多；與酵母細胞內的乙醇濃度相反，在繁殖階段，酵母細胞內己糖濃度不停地降低。在衰減階段后期，果汁中糖繼續(xù)被轉化為乙醇。這表明酵母細胞的酶仍保持高度的活性，此時發(fā)酵速度的降低，主要是由于糖通過酵母細胞壁滲入細胞內出現(xiàn)障礙造成的。類固醇，特別是麥角甾醇，在酒精發(fā)酵過程中作為生存素而起作用。它通過影響磷脂的性質，從而調節(jié)細胞膜的生理狀態(tài)和滲透性。
酵母生長停止和發(fā)酵速度減緩，與細胞中甾醇的消失相一致。如果在果汁加入甾醇，則可增加酵母細胞中甾醇的濃度，從而提高酵母群體的生活力和發(fā)酵速度。酵母細胞中甾醇的缺乏，引起細胞膜生理狀態(tài)和透性的改變，從而影響酵母細胞與基質之間的物質交換，導致發(fā)酵速度減緩或中止。
2．酒精發(fā)酵的中止
大多數(shù)漿果中含有酵母菌生長繁殖所需的所有物質。一般而言，只要漿果的含糖量不過高，在入罐時接種106CFU/L的釀酒酵母，酒精發(fā)酵就會很容易啟動，并且順利完成。但是，有很多因素可以影響酵母的生長和酒精發(fā)酵進程。這些因素包括微生物因素、物理化學因素等。如果酒精發(fā)酵出現(xiàn)困難，一些不需要的微生物，即致病性微生物就會活動，從而抑制釀酒酵母。物理化學因素包括營養(yǎng)的缺乏、發(fā)酵抑制劑、給氧、溫度和果汁澄清等。多數(shù)情況下，是由于多種因素的共同作用，導致酒精發(fā)酵的困難和中止。
由原料的入罐溫度和含糖量、發(fā)酵容器的種類(大小和材質等)引起的溫度低或過高，會導致發(fā)酵中止。入罐溫度過低，會限制酵母的生長，導致酵母群體數(shù)量過低，而且在溫度較低的情況下，酵母對溫度突變的適應性很差；所有加速發(fā)酵進程的處理，如加糖、通氣等，都會引起溫度的升高；發(fā)酵溫度一般不能超過30℃，而且升溫越早，其抑制作用越大，發(fā)酵起始溫度應較低，為20℃。果汁或果醪中的高含糖量本身就對酵母菌有抑制作用，在酒精發(fā)酵過程中形成的酒精，更加重了它的抑制。如果在發(fā)酵過程中加糖(提高酒度)太遲，已經受酒精影響的酵母，就很難繼續(xù)其代謝活動。嚴格的厭氧條件不利于酵母菌的活動，在酒精發(fā)酵過程中的通氣，可加快其速度，而且在發(fā)酵開始時，即在酵母的繁殖階段，就應通氣。此外，固醇和長鏈脂肪酸也可加快發(fā)酵速度。營養(yǎng)的缺乏，包括氮素、脂類、生長素和礦物營養(yǎng)的缺乏，會影響酵母的活動。在一些特殊情況下，給氧結合添加銨態(tài)氮，可取得良好的效果。含有農藥的漿果原料以及霉變原料中由一些灰霉菌產生的物質，可抑制酵母的活動。此外，還有其他一些因素影響酒精發(fā)酵的進程，如酵母的代謝副產物、果汁的澄清處理、pH過高、酵母接種量不夠、接種太遲、CO2排除不良等。
3．預防發(fā)酵中止
除環(huán)境、設備應保持良好的衛(wèi)生狀況外，應及時對原料進行二氧化硫處理，以防止致病性微生物的活動。為了防止野生酵母的活動，必須及時添加酵母，對于清汁發(fā)酵的果酒，應在澄清后立即添加；對于帶皮發(fā)酵的果酒，在二氧化硫處理12h后添加。在入罐時適量加NH4HSO3，不僅可產生SO2，還可為酵母菌提供可同化氮。對于缺氮原料，氮素的補充在發(fā)酵開始(相對密度為1.050～1.060)時，最為有效，可結合開放式倒罐和加糖(如果需要)添加。對于清汁發(fā)酵的果酒，對果汁的澄清處理不能過度，在澄清時加入適量的果膠酶可獲得澄清度適當?shù)墓绻吻暹^度加入適量的纖維素，有利于果汁的發(fā)酵。在發(fā)酵過程中每天1.5～2倍(原料的量)的開放式倒罐有利于酵母菌的活動，在此期間由于CO2的釋放，沒有氧化的危險，也可通過微量噴氧的方式(10mg/L果汁)對發(fā)酵汁給氧。研究結果還表明，當這些果汁發(fā)酵進行到一半時，加氧(7mg/L)結合加磷酸氫二銨[300mg/L(NH4)2HPO4]，能有效地防止發(fā)酵中止。添加酵母菌皮或死酵母，也有利于發(fā)酵的完成。
4．發(fā)酵中止時的處理
在發(fā)酵過程中，很容易觀察到發(fā)酵中止，如果24～48h發(fā)酵汁的密度不再下降，就表示有發(fā)酵中止的危險。在這種情況下，可有多種措施促使發(fā)酵重新啟動，防止致病性微生物的活動。在發(fā)酵中止時，必須盡快將果汁封閉分離到干凈的發(fā)酵罐。即使浸漬不夠，也要分離。分離有利于防止細菌的侵染及對發(fā)酵汁通氣和降低發(fā)酵汁溫度。在分離時進行30～50mg/L SO2處理，以防細菌的活動。這樣處理后，有時會自動再發(fā)酵。
如果再發(fā)酵不能自然啟動，就必須添加酒母。同時將發(fā)酵中止的果汁添滿、密封。必須強調的是，如果發(fā)酵汁中已有8%～9%(體積分數(shù))的酒度，直接添加活性酵干母是沒有用的。
制備酒母的方法如下：取5%～10%發(fā)酵中止的果汁，將其酒度調整為9%(體積分數(shù))、含糖量調整為15g/L，并添加30mg/L SO2，然后加入200mg/L抗酒精能力強的活性干酵母，在20～25℃進行發(fā)酵。當糖接近耗盡(相對密度低于1.000)時，按5%～10%的比例加入發(fā)酵中止果汁中，以啟動再發(fā)酵。也可以1∶1的比例將發(fā)酵中止的果汁加到酒母中，使混合汁進行發(fā)酵。當其相對密度降至低于1.000時，再將發(fā)酵中止果汁按1∶1的比例混合。直至所有果汁發(fā)酵結束。
對發(fā)酵中止果汁進行瞬間巴氏殺菌，即在20s內將果汁的溫度升至72～76℃，可以改善果汁的可發(fā)酵性。在殺菌后，待溫度降低到20～25℃，再加酵母進行再發(fā)酵。在再發(fā)酵過程中，加入0.5mg/L泛酸，既可防止揮發(fā)酸的升高，又能使已經過高的揮發(fā)酸消失。當然，加入低于50mg/L硫酸銨也有利于再發(fā)酵的進行。
需要強調的是，發(fā)酵中止后，即使是最好的再發(fā)酵，也會嚴重影響果酒的質量。所以，必須采取適當?shù)拇胧A防酒精發(fā)酵的中止。
七、發(fā)酵的酒精產率
計算果汁中發(fā)酵時來自糖的酒精產量的基礎是酒精(乙醇)和二氧化碳是兩個主要的產物，但不是全部的產物。在發(fā)酵期間，糖被分解成為酒精和二氧化碳，并有一系列有利于酵母生長的其他次生物質的生成。在完全發(fā)酵的情況下，1000g轉化糖(葡萄糖和果糖)大約產生480g酒精，這與溫度、通氣和酵母種類有關。所依據(jù)的乙醇產量公式是由蓋-呂薩克在1810年提出的，如下所示：
例如，1L含20.0%糖(以化學分析方法測得，以還原糖計)的果汁可以通過發(fā)酵產生96.3g或12.20%體積分數(shù)的酒精，后面的數(shù)字是通過質量百分比除以酒精相對密度(0.7893)得到的。這個數(shù)值是在假設酒精最小蒸發(fā)量，酵母沒有產生多余的其他副產物，不通氣及低溫發(fā)酵的情況下測出的平均值。然而，果醪中的糖經常用液體比重計，如波美度計、白利度計。例如：22.0°Bx為12.2°Bé，這種液體比重計測量的是總的可溶性固形物的讀數(shù)，果汁或果醪中的糖是其主要部分。但是實際還原糖大約比白利度讀數(shù)要平均低2%或20g/L，比波美計讀數(shù)低1.1。波美度和酒精產量的關系因不同的波美度高低而不同，在10～12°Bé范圍內，將產生與波美度幾乎相同數(shù)量體積分數(shù)的酒精。這就是為什么釀酒師的速算方法是調節(jié)1°Bé來增產1%體積的酒精。但是由于果醪中還原糖并不能由液體比重計準確地測得，任何用液體比重計得到的果汁中的酒精產量都是近似數(shù)值。因此，準確的測量方法是用化學法檢測果汁中的糖含量，然后由以上列出的數(shù)據(jù)與公式進行計算。