2.2 免疫電鏡技術

免疫電鏡技術（Immunoelectron Microscopy）又稱電子顯微鏡免疫細胞化學技術，是在細胞及組織中對蛋白質進行定位檢測的最好方法之一。該技術是免疫細胞化學與電鏡技術相結合的產物，即在保持抗體的抗原識別特性前提下，把抗體用高電子密度的標記物（如鐵蛋白、金等）或用經細胞化學方法處理電子密度能增高的標記物（如辣根過氧化物酶等酶類）標記后，在電子顯微鏡下對細胞內抗原做亞細胞水平的定性或定量研究。包括免疫鐵蛋白技術、免疫膠體金技術、免疫酶細胞化學技術等常用技術。

免疫電鏡技術的成功應用首先基于待檢樣品中待測蛋白抗原性的保存、抗體與抗原之間識別的特異性及抗體穿透細胞的能力，在此基礎上，免疫電鏡技術中最關鍵的因素包括抗體標記物和樣品固定液的選擇。理想的免疫電鏡標本固定既要保存組織中的抗原，又要具有良好的細胞超微結構。四氧化鋨（OsO4）、甲醛和戊二醛是免疫電鏡技術中的常規固定液，其中OsO4因其高活性而常常影響抗原性的保存。因此，免疫電鏡常用一些特殊的固定液，如過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液（PLP）、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液（PG）及苦味酸-多聚甲醛固定液等。

根據待測抗原物質的特性不同，有3種染色步驟可供選擇：非包埋法免疫染色（Cryo-Ultramicrotomy）、包埋前免疫染色（Pre-Embedding）和包埋后免疫染色（Post-Embedding）。非包埋法免疫染色指組織經蔗糖浸漬，液氮速凍，不經過包埋直接在冷凍超薄切片機上切片，然后進行免疫染色。包埋前染色是指組織在樹脂包埋前進行的免疫染色，該法可很好地保存待測蛋白的抗原性，提高檢出率，但易損傷組織結構。包埋后染色是指組織經固定、包埋、超薄切片后，直接在超薄切片上進行免疫染色。該法操作簡單，重復性強，可以很好地保存細胞的超微結構，但待測蛋白的抗原性可能會減弱或消失。

下面以包埋后免疫染色方法為例介紹膠體金標記抗體免疫電鏡分析法的詳細操作步驟。

1．實驗儀器、耗材及試劑

①固定液：以0.1mol/L二甲砷酸鹽緩沖液溶解4%（m/V）多聚甲醛與1.5%（V/V）戊二醛混合的固定液，pH 7.3。

②1×PBS（pH 7.2～7.4）。

③封閉液：1% BSA溶解于1×PBS中。

④以一定濃度溶解于封閉液中的一抗。

⑤以一定濃度溶解于封閉液中的蛋白A/膠體金（16nm）復合物。

⑥醋酸雙氧鈾飽和溶液。

⑦梯度乙醇溶液：50%、70%、90%乙醇溶液。

⑧LR White樹脂包埋劑。

⑨恒溫溫箱。

⑩震動切片機。

?電子顯微鏡。

2．實驗步驟

①固定：將組織樣本浸泡于固定液中，室溫固定5～6h。

②清洗：1×PBS洗3次。

③脫水：將組織依次浸泡于50%、70%、90%濃度梯度乙醇溶液中，每個濃度浸泡15min。

④包埋：以LR-White和90%乙醇的混合溶液浸泡脫水后的組織，于搖床上輕柔搖動浸泡2min后，將組織浸泡于100% LR-White包埋劑中，于4 ℃包埋過夜。將組織轉移到盛有100% LR-White包埋劑的模具中，55 ℃聚合24h。

⑤切片：用震動切片機切60～90nm超薄切片。

⑥封閉：用封閉液，室溫濕盒中封閉30min。

⑦一抗染色：用50μL稀釋后的一抗進行免疫染色（稀釋濃度需根據預實驗結果決定）。于4 ℃濕盒中染色過夜。

⑧清洗：1×PBS洗3次。

⑨膠體金染色：用50μL稀釋于封閉中的以一定濃度溶解于封閉液中的進行膠體金染色。于37 ℃濕盒中染色30min。

⑩清洗：1×PBS洗3次。

?電子顯微鏡觀察染色結果：在醋酸雙氧鈾飽和溶液中浸泡5～8min，流水沖洗，檸檬酸鉛染2～3min。電鏡下觀察染色結果，圖2-2所示為膠體金標記的外泌體特異蛋白。

知識窗

免疫電鏡技術的臨床醫學應用實例

免疫電鏡技術廣泛應用于生物醫學的各個研究領域當中。史璐等（見參考文獻[4]）研究者對不同發育階段小鼠胚胎下頜第一磨牙牙胚中窖蛋白（Caveolin）的表達情況進行了免疫染色及電鏡觀察，圖2-3中黑色箭頭所示為Caveolin-1蛋白。